一種鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達量的引物及應用與方法
【專利摘要】本發明公開了一種鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達量的引物及應用與方法。所述的鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達量的引物的DNA序列為：SPS-F2：5'GGTGGTTTTCGTTGGAGAAA 3'SPS-R2：5'CATTAGGGCTGTCGAATGGT 3'。應用為所述的鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達量的引物在鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達量中的應用。方法包括前處理和實時熒光定量PCR反應步驟。本發明通過對烤煙在團棵期、旺長期、現蕾期、打頂后、成熟期5個生育期的SPS酶基因的表達情況進行測定，從而明確不同生育期蔗糖磷酸合成酶基因的變化特點，揭示烤煙不同生育期蔗糖代謝的分子特點，并為改善烤煙品質提供理論依據。
【專利說明】一種鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達量的引物及應用與 方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于鑒定檢測【技術領域】，具體涉及一種鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因 (SPS)表達量的引物及應用與方法。
【背景技術】
[0002] 烤煙是世界上一種重要的經濟作物，煙葉的品質與其糖含量密切相關，水溶性糖 與氨基酸發生梅拉德反應可以產生多種香氣物質。而蔗糖是主要的水溶性糖之一，它也是 煙草光合作用的主要產物，蔗糖可以為煙草的生長提供碳源和能量，同時，也是細胞代謝的 調控因子，可調節轉運蛋白、貯藏蛋白和編碼酶的基因的表達。
[0003] 與鹿糖代謝密切相關的酶主要有轉化酶（Invertase,Inv)、鹿糖合成酶（Sucrose Synthase,SuSy)和鹿糖憐酸合成酶（SucrosePhosphateSynthase,SPS)。SPS是調控植 物蔗糖合成的關鍵酶之一，其活力直接影響光合產物的分配，研究表明其與蔗糖形成呈正 相關。SuSy是一種可逆酶，既可催化蔗糖的合成，又可催化蔗糖的分解，通常認為，它主要起 分解蔗糖的作用，能為細胞壁提供合成底物和合成淀粉。Inv酶與植物體內形成蔗糖梯度相 關，Bachelier等研究表明，處在細胞壁中的轉化酶能調節鹿糖從韌皮部卸出，并且控制鹿 糖吸收速度，而在液泡中的轉化酶則可以調節蔗糖和己糖的貯存。
[0004] 為揭示烤煙不同生育期蔗糖代謝的分子特點，為改善烤煙品質提供理論依據，需 要明確不同生育期蔗糖代謝主要酶活性及酶基因的變化特點，目前，還沒有一種較好的方 法以達成以上目的，因此，開發一種能解決上述問題的測定方法是非常必要的。
【發明內容】
[0005] 本發明的第一目的在于提供一種鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達量的引物；第 二目的在于提供所述的鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達量的引物的應用；第三目的在于 提供所述的鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達量的引物鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表 達量的方法。
[0006] 本發明的第一目的是這樣實現的，所述的鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達量的 引物的DNA序列為： SPS-F2 :5'GGTGGTTTTCGTTGGAGAAA3' SPS-R2 :5'CATTAGGGCTGTCGAATGGT3' 。
[0007] 本發明的第二目的是這樣實現的，所述的鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達量的 引物在鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達量中的應用。
[0008] 本發明的第三目的是這樣實現的，包括前處理、PCR反應、電泳檢測步驟，具體包 括： A、 前處理：提取待測烤煙樣品的基因組總RNA，反轉錄得到第一鏈cDNA; B、PCR反應：以cDNA作為模板，進行實時熒光定量PCR擴增； 本發明通過對烤煙在團棵期、旺長期、現蕾期、打頂后、成熟期5個生育期的SPS酶基因 的表達情況進行測定，從而明確不同生育期蔗糖代謝主要酶SPS酶基因的變化特點，揭示 烤煙不同生育期蔗糖代謝的分子特點，并為改善烤煙品質提供理論依據。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0009]圖1為烤煙品種z? 87在不同生育期SPS酶基因的表達情況不意圖。
【具體實施方式】
[0010] 下面結合附圖對本發明作進一步的說明，但不以任何方式對本發明加以限制，基 于本發明教導所作的任何變換或替換，均屬于本發明的保護范圍。
[0011] 本發明所述的鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因（SPS)表達量的引物，其DNA序列為： SPS-F2 :5'GGTGGTTTTCGTTGGAGAAA3' SPS-R2 :5'CATTAGGGCTGTCGAATGGT3' 。
[0012] 本發明的應用為所述的鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達量的引物在鑒定烤煙 蔗糖磷酸合成酶基因表達量中的應用。
[0013] 本發明所述的鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達量的引物鑒定烤煙蔗糖磷酸合 成酶基因表達量的方法，包括前處理和實時熒光定量PCR反應，具體包括： A、 前處理：提取待測烤煙樣品的基因組總RNA，反轉錄得到第一鏈cDNA; B、PCR反應：以cDNA作為模板，進行PCR擴增。
[0014]B步驟中所述的PCR擴增的反應體系為：2XSYBRPremix12. 5μ1，Forward Primer0· 4μM，ReversePrimer0· 4μM，Rox1μM，加ddH20 補充至 25μ1。
[0015]B步驟中所述的PCR擴增的反應條件為：95°C30secI個循環；95°C5sec, 58 °C30sec45 個循環；95°C30sec，58°CImin，95°CImin1 個循環。
[0016] 本發明的具體操作如下： 1.材料與方法 I. 1供試材料：試驗地點設在玉溪研和基地，采集云煙87的第12片葉（自下而上)在移 栽后第20天（團棵期）、第40天(旺長期)、第60天(現蕾期)、第80天(打頂后)、第100天 (成熟期)，將新鮮煙葉Ig放入液氮罐冷凍后，置于_80°C保存備用。
[0017] 1.2試驗方法： 1. 2. 1總RNA的提取 總RNA提取按照RNAisoPlus和RNAisonateforPlantTissue試劑盒（寶生物工 程（大連）有限公司）說明書進行。用核酸蛋白紫外分析儀檢測A260 /A280的比值以鑒 定RNA抽提質量，1. 8 <A260 /A280 < 2. 0,表明總RNA質量較好，同時測定其標本總RNA 濃度。
[0018]L2. 2總RNA的反轉錄 反轉錄反應用PrimeScriptII1stStrandcDNASynthesisKit試劑盒(寶生物工程 (大連）有限公司）進行，具體方法參照試劑盒說明書。
[0019] 1.2.3引物設計 選擇內參基因Actin以及3個關鍵酶基因：蔗糖合成酶基因、蔗糖磷酸合成酶基因以 及蔗糖轉化酶基因，按照實時熒光定量PCR擴增的引物設計原則，避免引物3端互補，以及 "發卡"結構，引物的長度為18?22bp，注意到堿基的隨機分配，GC含量在40%?60%之 間，擴增片段小于200bp。并應用Primer3 (v. 0.4.0)軟件設計相應的擴增引物。引物合 成由Invitrogen公司完成。引物序列見下表。
[0020] 表1弓丨物序列
【權利要求】
1. 一種鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達量的引物，其特征在于所述的鑒定烤煙蔗糖 磷酸合成酶基因表達量的引物的DNA序列為： SPS-F2 :5' GGTGGTTTTCGTTGGAGAAA 3' SPS-R2 :5' CATTAGGGCTGTCGAATGGT 3' 。
2. -種權利要求1所述的鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達量的引物的應用，其特征 在于所述的鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達量的引物在鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因 表達量中的應用。
3. -種權利要求1所述的鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達量的引物鑒定烤煙蔗糖 磷酸合成酶基因表達量的方法，其特征在于包括前處理和實時熒光定量PCR反應驟，具體 包括： A、 前處理：提取待測烤煙樣品的基因組總RNA，反轉錄得到第一鏈cDNA ; B、 PCR反應：以cDNA作為模板，進行實時熒光定量PCR擴增。
4. 根據權利要求3所述的所述的鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達量的引物鑒定烤 煙蔗糖磷酸合成酶基因表達量的方法，其特征在于B步驟中所述的PCR擴增的反應體系為： 2XSYBR Premix 12. 5 μ 1, Forward Primer 0. 4 μ M, Reverse Primer 0. 4 μ M, Rox 1 μ Μ, 加 ddH20補充至25 μ?。
5. 根據權利要求3所述的所述的鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達量的引物鑒定烤 煙蔗糖磷酸合成酶基因表達量的方法，其特征在于Β步驟中所述的PCR擴增的反應條件為： 95? 30 sec 1 個循環；95°C 5 sec，58 ? 30 sec 45 個循環；95? 30 sec，58 °C 1 min， 95 °C 1 min 1 個循環。
【文檔編號】C12Q1/68GK104278103SQ201410574793
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年10月25日 優先權日:2014年10月25日
【發明者】馬俊紅, 李軍營, 馬二登 申請人:云南省煙草農業科學研究院