β-井岡霉烯胺的生物制備方法
【專利摘要】本發明公開了β-井岡霉烯胺的生物制備方法，是以式II所示的井岡霉烯酮為底物，使其在氨基轉移酶的作用下，與氨基供體發生反應，生成式I所示的β-井岡霉烯胺，其反應路線如下：或是將氨基轉移酶基因整合入井岡霉素生產菌株，使整合后的井岡霉素生產菌株通過發酵產生β-井岡霉烯胺。本發明的有益效果在于：解決了制備β-井岡霉烯胺的常規方法所產生的缺陷；基于由氨基轉移酶催化的氨基轉移反應，建立方便、高效、立體選擇性強的β-井岡酶烯胺直接生物合成策略，為β型糖苷酶功能異常引起的相關疾病的藥物開發提供直接的藥物先導化合物。
【專利說明】β-井岡霉烯胺的生物制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及采用酶學、基因工程等生命科學技術手段，具體涉及一種β_井岡霉 烯胺的生物制備方法
【背景技術】
[0002] β -井岡霉烯胺（β-valienamine)是井岡霉烯胺的1-差向異構體，和井岡霉烯 胺一起被認為是糖苷酶抑制劑開發的先導化合物。由Ogawa和Suzuki研究團隊開發的其 衍生物對N-辛燒基-β-井同霉烯胺（NOV)和N-辛燒基-4-epi_i3-井同霉烯胺（NOEV) β_類糖苷酶有抑制作用，有望作為藥物分子伴侶應用于由β_類糖苷水解酶功能異常引 起的Gm-神經節苷脂C積癥、Morquio B癥以及Gaucher癥等溶酶體I&積癥（lysosomal storage disease, LSD)。天然狀態下井岡霉烯胺以α-狀態存在于井岡霉素、阿卡波糖等 結構中，可以通過井網霉素微生物裂解來獲得，尚未見天然產物中β-井網霉烯胺結構單 元及其合成途徑的報道，目前僅見于化學合成。
[0003] 目前，化學合成β -井岡霉烯胺的方法一般是以D-葡萄糖和L-山梨糖為起始原 料化學合成光學純β_井網霉烯胺，需要經過復雜的保護、取代、消除、異構、脫保護及消旋 和手性拆分過程，相對于生物方法反應條件嚴苛，需要使用昂貴的立體選擇催化劑，且消旋 體拆分困難。且這種總體合成方法因為合成反應需要至少10個反應步驟而過于復雜，因此 不能被采用進行大量生產。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供β -井R霉烯胺的生物制備方法，以解決現有技術中所存 在的上述問題。
[0005] 本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：
[0006] -方面，本發明提供了一種制備井R霉烯胺的方法，是以式II所示的井岡霉 烯酮為底物，使其在氨基轉移酶的作用下，與氨基供體發生反應，生成式I所示的β -井岡 霉烯胺，其反應路線如下：
[0007]
【權利要求】
1. 一種制備β-井R霉烯胺的方法，其特征在于， OH 以井閃霉烯酮JT1為底物，使其在氨基轉移酶的作用下，與氨基供體發生反 A _ 應，生成β-井R霉烯胺 Λ〇
2. 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，具體包括如下操作： 將所述井岡霉烯酮、氨基供體、氨基轉移酶和輔因子在PH為7.O?7. 5的緩沖液中，在 25?37°C下進行反應，得到所述β-井R霉烯胺。
3. 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述氨基供體為L-谷氨酰胺、L-谷氨 酸鹽、L-丙氨酸或L-絲氨酸；所述輔因子為磷酸吡哆醛。
4. 如權利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述氨基轉移酶包括天然氨基轉移 酶或在所述天然氨基轉移酶基礎上經蛋白質工程技術手段進行改造的氨基轉移酶的突變 體。
5. 如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述天然氨基轉移酶來源于天冬氨酸 氨基轉移酶I家族、Pfam數據庫DegT_DnrJ_EryCII_StrC氨基轉移酶亞家族。
6. 如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述氨基轉移酶包括來自于各種微生 物的BtrR、ArnB,DesI、Per、PglE、PseC、DesV、MegCII、TylB、QdtB、WbpE、WecE、GtmB、RbmB、 StsC、SpcS2、TbmB或其他來自于抗生素結構中負責催化該結構生成的氨基轉移酶。
7. -種制備β_井R霉烯胺的方法，其特征在于，是將氨基轉移酶基因導入井R霉素 生產菌株，采用獲得的基因工程菌通過發酵產生β_井R霉烯胺。
8. 如權利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述將氨基轉移酶基因導入井R霉素 生產菌株的方法為采用整合型質粒通過鏈霉菌接合轉移操作，將氨基轉移酶基因整合入宿 主染色體上。
9. 如權利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述生產井R霉素的菌株包括在天然 生產菌株的基礎上采用生物工程手段改造的突變菌株。
10. 如權利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述生產井網霉素的菌株為吸鏈霉菌 井岡變種5008或吸水鏈霉菌檸檬亞種。
【文檔編號】C12R1/55GK104313069SQ201410568317
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月22日 優先權日:2014年10月22日
【發明者】馮雁, 崔莉, 白林泉, 鄧子新, 關曉青 申請人:上海交通大學