紅球菌高效利用木糖渣生產生物柴油的方法
【專利摘要】生物柴油含硫量低，且不含芳香族化合物，可生物降解，是一種環境友好型的可再生能源。紅球菌屬有很強的碳源轉化能力，能夠將生活生產中難以利用的木質纖維素高效率轉化為脂肪酸，渾濁紅球菌（ Rhodococcusopacus PD630）利用葡萄糖為碳源時油脂積累量可高達細胞干重的86%，是一種優質的產油菌株。本發明提供了一種通過渾濁紅球菌（ Rhodococcusopacus PD630）高效利用木糖渣生產脂肪酸的方法。相比常用的酵母菌屬，紅球菌屬對極性條件的耐受力強，碳源轉化能力高，發酵條件較為簡單，是一種非常有潛力的生物柴油工業化生產途徑。
【專利說明】紅球菌高效利用木糖渣生產生物柴油的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種生物柴油的生產方法，尤其是關于紅球菌利用木糖渣產生的脂肪 酸，然后采用生物柴油生產工藝將產出的脂肪酸轉化為生物柴油的一種方法。
【背景技術】
[0002] 自20世紀以來，石油一直成為人類大規模開采和使用的能源。到了 20世紀后期， 人類逐漸意識到石油資源的短缺及其使用帶來的環境問題。從而，為解決能源和環境的雙 重壓力，相關研究人員也一直致力于新能源的開發。其中，生物柴油含硫量低，且不含芳香 族化合物，可生物降解，是一種環境友好型的可再生能源。生物柴油的生產原料來源廣，隨 著社會的發展和技術的進步，生物柴油在人類生活生產中所占比例將越來越大。
[0003] 動植物油脂用來作為生產生物柴油的原料有一定的局限。首先，產油的農作物 受限于土地的利用度，與糧食競爭土地來生產生物柴油有些得不償失。而目前也不斷在 嘗試用微生物油脂作為綠色可持續的生物柴油原料，紅球菌屬有很強的碳源轉化能力，能 夠將生活生產中難以利用的木質纖維素高效率轉化為脂肪酸。渾濁紅球菌 OAacm TO630)利用葡萄糖為碳源時油脂積累量可高達細胞干重的86%，是一種優質的產油 菌株。
[0004] 木糖渣是利用玉米芯生產木糖時的下腳料，其主要成分為48. 5%的纖維素、23. 5% 的半纖維素和21. 3%的木質素，是一種優質的生物質資源，并且我國每年有約25萬t的木 糖漁產生，
【發明者】長期探索發明了一種通過渾池紅球菌（Rhodococcus opacus Η)630)高效 利用木糖渣生產脂肪酸的方法。相比常用的酵母菌屬，紅球菌屬對極性條件的耐受力強，碳 源轉化能力高，發酵條件較為簡單，是一種非常有潛力的生物柴油工業化生產途徑。
【發明內容】
[0005] 本發明提供一種高效產油紅球菌一/Sot/ococciAs Ρ?630，保藏編號 DMSZ44193。在渾濁紅球菌(TSoi/ococcm OAacm TO630)的發酵培養基中配入適量的木糖 渣粉，在發酵過程中實時監測其濃度，及時補料，同時也要控制好其他條件參數。通過勻漿 使得紅球菌細胞破碎釋放胞內油脂，然后將渾濁紅球菌發酵積累的油脂通過極性有機溶劑 (如氯仿、己烷）萃取出來，接著用酯交換的方法將提純出來的微生物油脂轉化為生物柴油。 或者對紅球菌生物質進行直接酯交換以制備生物柴油。具體的實施方式，本文將通過以下 幾個實施例來加以詳細說明。
【具體實施方式】 [0006] 實施例1 種子培養基：葡萄糖l〇g/L，酵母提取物5g/L，麥芽提取物10g/L，Na2HPO4 · 12H20 9g/ UKH2PO4 1.5g/L。除葡萄糖外將培養基其他成分于121°C條件下滅菌20min，葡萄糖單獨于 115°0滅菌2〇1^11。接種量為2%，起始口!17.2±0.02,281：，200卬111，培養2411。
[0007] 24h 后測得 OD6tltl 為 47. 2。
[0008] 實施例2 改變培養基中氮源的量，將上述實施例1中的種子培養罐中的菌體分別轉入下面的培 養培養基中擴大培養。
[0009] 營養平衡培養基：木糖渣 80g/L，尿素 10g/L，MgSO4 · 7H20 lg/L，CaCl2 · 2H20 0· 02g/L，FeSO4 · 7H20 0· 5g/L，ZnSO4 · 7H20 0· 4g/L，MnSO4 · 5H20 0· 02g/L，H3BO3 0· 015g/L， NiCl2 · 2H20 0· 01g/L，EDTA 0· 25g/L，CoCl2 · 6H20 0· 05g/L，CuCl2 · 2H20 0· 005g/L，Stock A溶液lml/L，I. OM磷酸緩沖溶液35. 2ml/L。
[0010] 氮源限制培養基：木糖渣80g/L，尿素0. 636g/L，其他成分與營養平衡型培養基 一致。
[0011] Stock A 溶液配方：NaMoO4 · 2H20 2g/L，FeNa · EDTA 5g/L。
[0012] I. OM 磷酸緩沖溶液配方：KH2PO4 47g/L，K2HPO4 113g/L。
[0013] 將實施例1發酵得到的種子液分別轉入營養平衡培養基和氮源限制培養基，分別 置于于7L全自動發酵罐中。發酵罐參數設定為：轉速500rpm，pH7. 2±0,02,溫度28°C，通 氣量0. 5vvm，培養周期為110h。發酵過程中隨著木糖渣濃度低于8g/L時，要及時向培養液 中補料使得木糖渣的濃度維持在80g/L左右。
[0014] 實施例3 :測定紅球菌細胞油脂產率 A.測定紅球菌細胞干重 上述實施例2發酵結束后，分別在兩個發酵罐取Iml發酵液，在lOOOOrpm下離心 10min，用水洗滌生物質沉淀兩次，并在40°C下恒溫干燥24h，通過重量分析確定生物質。
[0015] B.從渾濁紅球菌細胞中提取油脂（Folch油的提取方法） 將上述實施例發酵產生的紅球菌生物質與20體積的氯仿：甲醇（2:1)混合液一起勻 漿。分散后，室溫下在軌道振蕩器上過夜攪拌整個混合液，離心并回收液相。用0.2體積的 水洗滌溶劑。漩渦混合幾秒后，2000rpm下離心分開兩相。虹吸去除上相，氮氣流氛圍下在 旋轉蒸發器中蒸發含有脂質的下相，回收油脂，稱重。
[0016] C.渾濁紅球菌細胞的油脂產率 通過用紅球菌細胞產油脂的量與渾濁紅球菌細胞干重的比值來表示細胞的油脂產率。
[0017] D.營養平衡培養基和氮源限制培養基的紅球菌細胞的產油率 表1
【權利要求】
1. 一種高效生產生物柴油的方法，其特征在于：生產生物柴油的原料油脂是微生物油 脂。
2. 根據權利要求1所述，微生物油脂的的生產菌種為紅球菌屬。
3. 根據權利要求2所述產油菌種包括opactts 1^630、 jbWii RHAl等紅球菌屬的多個種。
4. 根據權利要求1、2或3所述，產油紅球菌產油利用的碳源為工業廢棄木糖渣。
5. 根據權利要求4所述，木糖渣添加方式為直接配入培養基和補料添加，添加量為 8%-10%。
6. 紅球菌細胞產油的提取方式為氯仿-甲醇（2:1)萃取。
7. 利用紅球菌細胞產油生產生物柴油的方式為對提取的油脂進行酯交換或直接對凍 干的紅球菌細胞進行酯交換反應。
8. 根據權利要求7所述，對細胞進行直接酯交換后提取生物柴油的方法為有機溶劑萃 取，萃取劑包括：氯仿，己烷，乙醚等。
【文檔編號】C12R1/01GK104313067SQ201410558740
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月21日 優先權日:2014年10月21日
【發明者】朱道辰, 謝長校, 陳焱 申請人:鎮江拜因諾生物科技有限公司