一種3個運動能力相關基因的pcr-ldr檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用LDR法同時檢測3個運動機能相關基因的聯合檢測試劑盒，該試劑盒可在3個小時內同時檢測三個運動機能相關基因中的3個熱點突變，該試劑盒包括PCR擴增試劑和LDR反應試劑；所述PCR擴增試劑包括：PCR緩沖液、MgCl2和dNTPs的反應混合物，Taq酶，超純水，高特異性擴增ACTN3、EPO、CKMM三個基因中3個熱點突變的引物混合物；所述LDR反應試劑試劑包括：PCR產物、10×連接緩沖液、LDR探針、TaqDNA連接酶等。一共包括3對PCR引物和3組檢測探針。本發明以上述3個基因為檢測對象，該方法靈敏度高；相對傳統測序技術，本試劑盒能完成一次性獲得3個關鍵與運動能力顯著相關基因的基因型，實現了對運動能力的高通量篩查，具有經濟、高效和高準確率等優勢。
【專利說明】-種3個運動能力相關基因的PCR-LDR檢測試劑盒
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物檢測【技術領域】，具體是一種3個運動能力相關基因的PCR-LDR檢 測試劑盒。
【背景技術】
[0002] 隨著人類基因組計劃的完成，后基因組計劃的全面展開，以基因工程為主導的生 物技術在體育運動問題領域的應用得到廣泛的關注。基因遺傳工程應用于運動員選材是大 勢所趨，它必將從根本上引起運動選材理論和方法的革命。運用遺傳學的理論和方法進行 運動選材已經有了初步進展。與個體運動能力的相關多個基因位點已經被發現，遺傳工程 應用于運動選材的前景廣闊而緊迫目前較為成熟的運動人材基因篩選的相關位點包括：
[0003] I. ACTN3 基因
[0004] ACTN3是一個與爆發力相關的基因，該基因位于人體第11號染色體上，它的R等位 基因所編碼產生的α -輔肌動蛋白-3只存在于骨骼肌的快肌纖維中，正常情況下其16號 外顯子的第1747位核苷酸的堿基為c，能指導編碼ACTN3蛋白；當該位點發生了 c到T的 突變，基因鏈產生了終止密碼子，取代了氨基酸殘基第577位的精氨酸，使快肌纖維無法合 成ACTN3蛋白，從而導致α -輔肌動蛋白-3的缺失。已經有大量研究證明，577R位點的CC 基因型則由于擁有兩個ACTN3基因使得爆發力相關的運動能力明顯優于CT和TT型。
[0005] 2. CKMM 基因
[0006] 肌酸激酶（CK)是Cr+MgATP+H--PCr+MgADP反應的關鍵酶。CK與磷酸肌酸組成 肌酸一磷酸肌酸穿梭系統，在細胞內的作用：一是，在高能量需求時作為"暫時的能量緩沖 系統"保持ATP/ADP的比率；二是，作為能量轉運單位，將能量從產生部位轉運到利用部位。 肌型肌酸激酶是一種組織特異性酶，主要在骨骼肌中表達，心肌中也有少量表達。肌肉中 CKMM主要集中在M線附近，其主要功能是在肌球蛋白頭部生成高濃度的ATP，為肌肉收縮及 運動提供能量，CKMM也存在肌質網CaATP酶附近，可能影響Ca的再聚集，從而影響肌肉的 工作能力。研究表明，人的CKMM基因的多態性與耐力以及耐力訓練效果有關。
[0007] CKMM基因多態性的三種基因型分別為：AA型、GG型和雜合子AG型。研究結果顯 示：與耐力訓練前相比，訓練后相通亞極限強度運動時，AA、AG型的人運動能力提高顯著， 但GG型訓練后各種指標改變不明顯。因此GG型基因為耐力訓練中最不敏感，攜帶A等位 基因的AA型、AG型人對耐力訓練的敏感性顯著高于和GG型。
[0008] 最新研究表明在高強度運動后出現的肌痛、肌酸激酶增高等橫紋肌溶解癥狀，與 ACE與CKMM基因有密切的關系。運動后與D等位基因（ACE基因）和G等位基因（CKMM基 因）的個體更易出現肌酸激酶高反應。而同時具有DD基因型（ACE基因）和GG基因型 (CKMM基因）的人，會出現運動后肌酸激酶異常升高，D+G基因型有相加作用。
[0009] 3.促紅細胞生成素（EPO)基因
[0010] EPO基因是促進紅細胞生成增多的關鍵調節基因，通過促進紅細胞生成增多來提 高機體攜氧和運氧能力，可以通過促進紅細胞生成增多來提高攜氧和運氧能力，可以促使 機體更快的產生能量，EPO還能促進紅細胞釋放進入血液，減輕低氧對機體的損傷即能增強 個體對低氧環境的適應性，是可以讓運動員跑的更久的基因，在越野、長跑等耐力項目中擁 有更多的EPO能給機體提供更多的能量。研究發現不同種族人群中EPO基因 SNP/T354IG多 態性分布存在差異性，優秀基因型T/G能增強個體對低氧的適應性和耐受性。因此EPO基 因序列多態性可能與不同個體間對低氧適應性具有差異性。針對位于人類EPO基因全序列 第3541bp處，在EPO基因3'端增強子上，一個T/G單核苷酸多態性，即SNP/T3541G的研究 表明，在EPO基因 T354IG位點的三種基因型：TT型、TG型、GG型中，攜帶T等位基因的人群 低氧適應能力較GG型更強。
[0011] 目前常用的基因檢測方法有：直接測序（direct sequencing, DS)、連接酶檢測 反應（ligase detection reaction, LDR)、限制性片段長度多態性分析（restriction fragment length polymorphism，RFLP)、變性高效液相色譜分析（denaturing high performance liquid chromotography，DHPLC)、定量 PCR，其中利用 DNA 分析儀直接測序是 金標準，但是上述方法分別存在著成本高、準確率低、操作繁瑣和重復性差等問題。
[0012] 本試劑盒采用聚合酶鏈式反應-連接酶檢測反應（polymerase chain reaction-ligase detection reaction，PCR_LDR)結合毛細管電泳技術來檢測3個運動能 力相關基因，LDR的原理是利用高溫連接酶實現對基因多態性位點的識別，若高溫連接酶一 旦檢測到DNA與互補的兩條寡聚核苷酸接頭對應處存在著單個核苷酸的錯配，即會阻止雜 交探針的連接。該方法靈敏度高、判讀清晰準確、采樣方便，相對測序法一次出一個序列， PCR-LDR連接酶反應整合了多個位點使用測序儀完成既保證了準確率又節約了時間，大大 節約了人力物力和時間。
【發明內容】
[0013] 本發明的目的是提供一種同時檢測3個運動能力相關基因的PCR-LDR檢測試劑盒
[0014] 為了實現上述目的，該試劑盒包括PCR擴增和LDR反應試劑；包括3對PCR引物和 3組檢測探針。
[0015] 本發明以ACTN3、CKMM和EPO等3個基因的基因型為檢測對象，通過對上述運動基 因的擴增和毛細管電泳，與基因分型標準物的對比，3小時內即可篩選出含有上述位點突變 的個體。本試劑盒首次采用復合LDR連接酶檢測反應，同時對ACTN3、CKMM和EP03個基因 進行PCR-LDR擴增，而后經毛細管電泳后分析片段大小，即可實現對3個基因位點的同時檢 測。該方法靈敏度高，判讀清晰準確；相對傳統測序技術，本試劑盒能完成一次性獲得3個 關鍵耳聾基因突變診斷結果的高通量篩查，具有經濟、高效和高準確率等優勢。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016] 本發明分型完整清晰，結果如圖1-7所示：
[0017] 圖1 :26號樣本血斑來源DNA使用本試劑盒進行測序分型后結果，其中ACTN3、 CKMM、EPO三個基因的分型結果依次為：CC純合、A/G雜合、T/G雜合，與測序結果一致。提 示該個體具有較好的爆發力、較好的訓練敏感性和較強的低氧適應能力。
[0018] 圖2 :81號樣本血斑來源DNA使用本試劑盒進行測序分型后結果，其中ACTN3、 CKMM、EP0三個基因的分型結果依次為：(：/1\6/6、1'/1'，與測序結果一致。提示該個體具有較 好的爆發力和較強的低氧適應能力。
[0019] 圖3 :90號樣本血斑來源DNA使用本試劑盒進行測序分型后結果，其中ACTN3、 CKMM、EP0三個基因的分型結果依次為：1'/1'4/^、6/6，與測序結果一致。提示該個體具有較 好的訓練敏感性。
[0020] 圖4 :56號樣本血斑來源DNA直接測序結果，其中ACTN3基因型為，C/T，提示該個 體具有較好的爆發力。
[0021] 圖5 :56號樣本血斑來源DNA直接測序后結果，其中CKMM基因型為：A/G(利用反 向序列設計測序引物），提示該個體具有較好的訓練敏感性。
[0022] 圖6 :56號樣本血斑來源DNA測序分型后結果，EPO基因型為：T/G，提示該個體具 有較強的低氧適應能力。
[0023] 圖7 :56號樣本血斑來源DNA使用本試劑盒進行測序分型后結果，其中ACTN3、 CKMM、EP0三個基因的分型結果依次為：(：/1'4/63/6，與測序結果一致。提示該個體具有較 好的爆發力、較好的訓練敏感性和較強的低氧適應能力。
[0024] 圖 8 :凝膠電泳圖，泳道從左至右為 IOOObp Marker，CKMM(359bp)，ACTN3(560bp) 及 EP0(405bp)。
【具體實施方式】
[0025] 1.基因組DNA準備
[0026] 待檢樣品選用磁珠或Chelex-IOO法提取基因組DNA，提取的樣品基因組DNA定量 在約 lng/ul-10ng/ul。
[0027] 2. PCR 反應：
[0028] 按如下過程實驗：
[0029] 體系：25ul
[0030]
【權利要求】
1. 一種同時檢測3個運動基因的PCR-LDR檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括包 裝盒體（I)，PCR擴增和LDR反應試劑； 所述PCR擴增試劑分別為PCR擴增ReactionMix (2)和（3);所述LDR反應試劑為LDR 反應 ProbeMix (4)和（5); 所述3個運動能力相關基因為ACTN3C>T，CKMMA>G，EP0T>G ; 實驗所需模板和引物如下： 其中用于ACTN3基因目的片段長度為560bp，其引物序列如下： ACTN3F:GCCACCCACAACTTTAGGCT ACTN3R:CATATACAGATGAGCCCGAG 用于CKMM基因目的片段長度為359bp，其引物序列如下： CKMMF:GGGATGCTCAGACTCACAGA CKMMR:AACTTGAATTTAGCCCAACG 用于EPO基因目的片段長度為405bp，其引物序列如下： EPO-F:ACTCTTGGCTTTTCTGTTTTCTGGG EPO-R:GTGTGGCATCAGCCGAAGAGAC 用于ACTN3T>C突變基因位點檢測的特異探針為： ACTN3_M:5' P-GTCAGCCTCGGGCAGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC ACTN3_C:TTTTTTTTTTCCCATGATGGCACCTCGCTCTCG ACTN3_T:TTTTTTTTTTTTTCCCATGATGGCACCTCGCTCTCA 用于CKMMA>G突變基因位點檢測的特異探針為： CKMM_M: 5J P-TGGCTCCCCATTTCTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC CKMM_A:TTTTTTTTTTTTTTCCAGTCCCTTACTTTCTCAAGAACCTGCCA CKMM_G:TTTTTTTTTTTTTTTTTCCAGTCCCTTACTTTCTCAAGAACCTGCCG 用于EP0T3541G突變位點檢測的特異探針為 ： EP0_M: 5 ' P-CACCTTATTGACCAGCGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC EP0_T:TTTTTTTTTTTTTTCTGCGGTGAGGCCTTGAATGGAGA EP0_G:TTTTTTTTTTTTTTTTTCTGCGGTGAGGCCTTGAATGGAGCo
【文檔編號】C12Q1/68GK104313147SQ201410558366
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月20日 優先權日:2014年10月20日
【發明者】步迅, 張全芳, 劉艷艷, 夏子芳 申請人:山東省農業科學院生物技術研究中心