一種實時定量熒光rt-pcr檢測馬尾松ggpps基因相對表達量的方法
【專利摘要】本發明公開了一種實時定量熒光RT-PCR檢測馬尾松GGPPS基因相對表達量的方法，通過馬尾松GGPPS基因特異性上、下游引物：P-GGPPS-F:5'-AATGAGGCACTGGAAAGGG-3'；P-GGPPS-R:5'-AATGCACAGAACAGGACGAAC-3'，采用實時定量熒光RT-PCR技術檢測樣本中GGPPS基因相對表達量。本發明建立的檢測馬尾松GGPPS相對表達量的方法，可以特異性的檢測分析馬尾松針葉、莖、根系等類型組織樣本中的GGPPS基因相對表達量，重復性好，可為選育高產脂力馬尾松優良品種提供分子輔助育種的理論基礎和技術支持。
【專利說明】-種實時定量熒光RT-PCR檢測馬尾松GGPPS基因相對表達 量的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物【技術領域】，涉及一種通過逆轉錄mRNA樣品得到cDNA(RT)，再設計 特異引物結合實時定量熒光PCR檢測技術檢測馬尾松GGPPS基因相對表達量的方法。
【背景技術】
[0002] 針葉樹可分泌大量以萜烯類化合物為主要成分的有特定氣味的樹脂，也稱之為松 月旨，是重要的工業原料，長期以來為人們所研究和開發利用。馬尾松是我國最主要的采脂樹 種，我國有90 %以上的松脂是采自馬尾松。
[0003] 萜烯類的生物合成途徑有兩條。一條為甲羥戊酸途徑，另一條途徑為甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸途徑。其中櫳牛兒櫳牛兒基焦磷酸合酶（GGPPS)是萜烯類物質合成的一 個重要分支酶，催化GPP與2個IPP縮合成GGPP，GGPP為二萜、類胡蘿卜素、赤霉素及葉綠 素側鏈等的形成提供C20骨架。在松脂成分中，松香含量占70 % -75 %，而松香的主要成分 樹脂酸正是一類二萜化合物，GGPP是樹脂酸的直接前體。在松脂合成部位的顯微觀察中發 現，松脂的主要合成部位是質體，結合萜類合成途徑分析，細胞質、線粒體、質體中分別側重 不同的萜類合成，其中質體中特有的萜類合成途徑包括GGPP的合成以及GGPP下游的二萜 合成，這與松脂的主要成分為二萜樹脂酸相符。此外，萜類的合成為次級代謝，在植物代謝 旺盛時次級代謝才會相應的增強，葉綠素是植物光合作用的主要功能基團，并且有研究發 現松樹針葉中葉綠素的含量與松樹產脂力存在著密切的關系，與普通馬尾松類型相比較， 馬尾松高產脂無性系的葉綠素含量極顯著提高，而GGPP是葉綠素的骨架，直接影響葉綠素 和合成。綜合以上研究結果，GGPPS基因的表達豐度在一定程度上反映了植物二萜合成鏈 的活躍程度，GGPPS基因表達水平相對較高的馬尾松植株，其體內的二萜化合物合成相對 較多，產脂力可能相對較高GGPPS很可能與產脂力具有相關性。本發明建立的檢測馬尾松 GGPPS相對表達量的方法，可為選育高產脂力馬尾松優良品種提供分子輔助育種的理論基 礎和技術支持。
[0004] 熒光定量PCR利用熒光染料對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監控反應過程，通 過熒光信號和反應循環數計算比較樣品模板的初始濃度。熒光定量PCR對擴增過程中的應 該信號進行全程實時檢測，反應快速、重復性好、靈敏度高、特異性強、結果清晰，是一種便 捷可靠的新定量檢測技術。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的提供一種實時定量熒光RT-PCR檢測馬尾松GGPPS基因相對表達量 的方法。該方法針對目的基因序列設計特異引物，并采用實時定量熒光RT-PCR方法檢測， 具有靈敏度高，特異型強、快速準確易于標準化等優點。
[0006] 本發明是這樣實現的：
[0007] -種實時定量熒光RT-PCR檢測馬尾松GGPPS基因相對表達量的方法，包括引物的 設計、總RNA的提取與純化、cDNA第一鏈的合成、實時熒光定量PCR和相對表達量的計算， 得到馬尾松GGPPS基因相對表達量，具體操作步驟如下：
[0008] (1)引物的設計：針對馬尾松GGPPS基因（KF278944. 1)設計用于檢測的目的基因 特異性引物序列如下：
[0009] P-GGPPS-F:5,-AATGAGGCACTGGAAAGGG-3，；
[0010] P-GGPPS-R:5'-AATGCACAGAACAGGACGAAC-3' 。
[0011] 根據馬尾松actin基因（KF910086. 1)設計用于檢測的內參基因特異性引物，序列 如下：
[0012] P-actin-F:5'-CTGGAATCCATGAGACTACTTACAA-3' ；
[0013] P-actin-R:5'-AACCGCCACTGAGCACAATA-3' 。
[0014] (2)總RNA的提取與純化：采用常規的RNA提取和純化的方法，從馬尾松的植物組 織樣本中提取得到純化的總RNA。
[0015] (3)cDNA第一鏈的合成：以馬尾松的組織樣品的總RNA為模板，采用常規方法合成 cDNA第一鏈。
[0016] (4)實時熒光定量PCR:采用ABISybrGreenPCRMasterMix(2X)試劑盒按常 規方法進行，以上述步驟（3)合成的cDNA第一鏈為模板，采用步驟（1)中的P-GGPPS-F、 P-GGPPS-R、P-actin-F、P-actin-R為引物，進行實時熒光定量PCR擴增反應，每個樣品設3 個平行重復。
[0017] 實時熒光定量PCR擴增體系參數詳見表1。
[0018] 表1 :實時熒光定量PCR擴增體系參數
[0019]
【權利要求】
1. 一種實時定量熒光RT-PCR檢測馬尾松GGPPS基因相對表達量的方法，其特征在于：采用針對馬尾松GGPPS基因和actin基因序列設計特異引物進行實時定量熒光PCR檢測， 包括引物的設計、總RNA的提取與純化、cDNA第一鏈的合成、實時熒光定量PCR和相對表達 量的計算，得到馬尾松GGPPS基因相對表達量。
2. 根據權利要求1所述的一種實時定量熒光RT-PCR檢測馬尾松GGPPS基因相對表達 量的方法，特征在于：所述的特異引物由符合熒光定量PCR反應特點的馬尾松GGPPS基因特 異性上、下游引物和馬尾松actin基因特異性上、下游引物組成，兩對引物序列分別是： P-GGPPS-F: 5'-AATGAGGCACTGGAAAGGG-3'； P-GGPPS-R: 5'-AATGCACAGAACAGGACGAAC-3'； P-actin-F: 5'-CTGGAATCCATGAGACTACTTACAA-3' ； P-actin-R: 5，-AACCGCCACTGAGCACAATA-3,。
【文檔編號】C12Q1/68GK104357556SQ201410556826
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月20日 優先權日:2014年10月20日
【發明者】陳博雯, 楊章旗, 賈婕, 劉海龍, 覃子海 申請人:廣西壯族自治區林業科學研究院