一種產小分子透明質酸的重組枯草芽孢桿菌的制作方法

一種產小分子透明質酸的重組枯草芽孢桿菌的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種產小分子透明質酸的重組枯草芽孢桿菌，屬于生物工程【技術領域】。本發明采用獸疫鏈球菌來源的透明質酸合酶hasA整合于枯草芽孢桿菌實現了透明質酸的生產；同時，對HA的合成途徑關鍵基因進行過表達實現HA在枯草芽孢桿菌的高產。在此基礎上，引入水蛭來源的透明質酸酶整合至枯草芽孢桿菌基因組上，置于受IPTG誘導控制的啟動子Pgrac下分泌表達，通過控制透明質酸酶的分泌表達量和誘導啟動時間來制備不同分子量的小分子透明質酸產物，制備的產物分子量范圍有差異，對于微生物直接生產特定范圍的小分子透明質酸具有重要的指導借鑒意義。本發明為高效制備小分子透明質酸奠定了一定的基礎，適合于工業化生產應用。
【專利說明】一種產小分子透明質酸的重組枯草芽孢桿菌

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種產小分子透明質酸的重組枯草芽孢桿菌，尤其是一種構建重組枯 草芽孢桿菌發酵葡萄糖聯產透明質酸酶和小分子透明質酸的方法，屬于生物工程技術領 域。

【背景技術】
[0002] 透明質酸（Hyaluronic Acid, HA)，是一種高分子粘性多糖，以其獨特的分子結構 和理化性質，使其具有良好的保濕性、粘彈性、滲透性和延展性，是目前發現的自然界中保 濕性最好的物質，同時無任何免疫原性和毒性，被廣泛應用于化妝品、食品和醫藥等行業領 域。近年來研究發現，低分子量的HA和透明質酸寡糖（低于IXlO 4)具有獨特的生物學 功能。此外，HA寡糖容易被人體吸收而用于人體自身HA等多糖合成的前體，因此，HA寡 糖在食品保健以及醫藥領域具有重要的應用前景。目前，雖然已有報道采用從頭合成的 方法來制備HA寡糖，但由于化學合成存在底物昂貴、步驟繁瑣以及合成效率低等多問題， 難以實現HA寡糖制備應用。相比較，酶法催化合成HA寡糖是一種很有潛力的方法，但需 要制備大量的透明質酸酶液和控制反應條件。因此，將微生物發酵生產HA和透明質酸酶 (Hyaluronidase, HAase)相偶聯，實現一菌發酵直接生產獲取HA寡糖和透明質酸酶兩種產 物，具有一定的研究意義和工業化潛力。
[0003] HA廣泛地存在于各種動物組織內，如雞冠、關節滑液、軟骨、眼玻璃體等，同時發現 HA也存在于產氣桿菌、綠膿桿菌和A、B、C溶血性鏈球菌等部分細菌中。由于動物提取工藝 復雜、效率低以及存在病毒種間交叉感染和其它風險性的感染，近些年以來，透明質酸的獲 取已經普遍由傳統的動物組織提法轉變為微生物發酵法，而應用最廣的是致病性弱的溶血 性鏈球菌C族菌，如Streptococcus equi和S. zooepidemicus，而且微生物發酵法獲得的 HA多為大分子量的HA。隨著DNA重組技術、DNA測序技術以及代謝工程的發展，構建重組 工程菌株合成HA也引起了廣泛關注。在過去幾年里，雖然微生物發酵合成HA已經獲得普 遍的應用，然而微生物發酵法獲得的HA的分子量多為大分子量的HA和中分子量的HA，而直 接發酵合成小分子HA尚無報道。如何構建微生物重組菌株合成不同分子量HA、尤其是小分 子量HA已經成為迫切需要解決的問題。
[0004] 隨著小分子HA和HA寡糖的研究與應用迅速興起，近些年以來，國內外開始重視 HA的降解及其降解產物的制備研究。目前，HA降解的方法主要有物理降解、化學降解、生 物降解3大類。物理降解方法主要有加熱、機械剪切力、紫外線、超聲波、 6tlCo照射、Y-射 線輻射等因素均可使HA發生降解。但是，物理法制備的HA分子量普遍高于1萬以上，產生 的分子量范圍分布較大，產品穩定性較差。HA的化學降解方法有水解法和氧化降解法，水 解法分酸水解（HCl)和堿水解（NaOH)，氧化降解常用的氧化劑為次氯酸鈉（NaClO)和過氧 化氫（H 2O2)15盡管使用化學降解方法降解產物的相對分子質量可以通過改變酸堿或氧化劑 的加入量和反應時間來控制，降解成本較低，易于大規模生產，但化學降解法引入了化學試 齊U，反應條件復雜，易給HA性質產生影響和產品的純化帶來困難，且產生大量的工業廢水。 生物酶法降解是HA在透明質酸酶（HAase)的作用下，糖鏈上的糖苷鍵斷裂發生降解。酶解 法是溫和的降解方法，不但可以制備小分子HA，而且利用此方法可制得鏈長為4?22的寡 糖，而且經過凝膠色譜分離后可以制得單一 HA寡糖。但是，目前商品化的透明質酸酶價格 昂貴，不適合應用于工業化制備小分子HA。
[0005] 透明質酸酶（Hyaluronidase, HAase),是廣泛分布于自然界中的一類可降解 透明質酸的酶的總稱。根據HAase的來源、結構和作用機制，HAase可以分為三類：內 切-P-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（EC 3. 2. 1.35,主要存在于哺乳動物以及蜜蜂、蛇、蜘蛛等 毒液）、內切-￠-葡萄糖醛酸苷酶（EC 3.2. 1.36,主要存在于水蛭）以及透明質酸裂解酶 (EC 4.2.2. 1，主要存在于細菌、噬菌體以及真菌）。透明質酸酶作為"擴散因子"在臨床上 被廣泛應用于藥物擴散助劑，而目前商品化的透明質酸酶主要以牛睪丸組織提取制備，產 品質量差，價格昂貴和具有動物疫源感染風險。
[0006] 本發明在食品級微生物Bacillus subtilis中構建HA的合成途徑，通過對合成HA 的途徑中的關鍵基因進行調控表達（M)P-GlcNAc和UDP-GlcA兩個前體物的合成途徑關鍵 基因），實現HA在食品級微生物Bacillus subtilis中的高產。同時，在構建的合成HA工 程菌中進行分泌表達水蛭HAase，實現一菌同步發酵生產HA和HAase，在發酵液中直接制備 生產HA寡糖產物。這一偶聯模式不僅解決了當前微生物生產HA過程中由于粘度過高導致 發酵停滯，產量難以獲得大幅度突破的瓶頸問題，尤其是本項目首次實現微生物高效合成 HA寡糖，這具有巨大的應用價值和經濟效益。


【發明內容】

[0007] 本發明提供一種產小分子透明質酸的重組枯草芽孢桿菌，是在枯草芽孢桿菌內 構建了合成透明質酸的途徑并偶聯分泌表達透明質酸酶。為構建產透明質酸的途徑，在 枯草芽孢桿菌中表達了編碼透明質酸合酶的基因hasA、UDP-葡萄糖脫氫酶的基因tuaD、 UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因glmU和氨基轉移酶的基因glmS。
[0008] 在本發明的一種實施方式中，所述枯草芽孢桿菌宿主為Bacillus subtilis 168。
[0009] 在本發明的一種實施方式中，所述透明質酸合酶編碼基因hasA可以來源于獸疫 鏈球菌（Streptococcus zooepidemicus)、馬鏈球菌（Streptococcus equi)或類馬鏈球菌 (Streptococcus equissp)。在本發明的一種實施方式中，編碼所述透明質酸合酶的基因 hasA來源于獸疫鏈球菌，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0010] 在本發明的一種實施方式中，tuaD、glmU和glmS可選擇鏈球菌屬（Streptococcus species)、大腸桿菌（Escherichia coli)或芽孢桿菌（Bacillus)來源。在本發明的一種實 施方式中，編碼所述的途徑關鍵基因來源于枯草芽孢桿菌=UDP-葡萄糖脫氫酶的基因tuaD 的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，編碼所述UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因glmU 的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，編碼所述氨基轉移酶的基因glmS的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4 所示。
[0011] 表達HA合成途徑的基因的載體為選擇游離型載體pP43NMK。
[0012] 表達HA合成途徑的基因的啟動子為誘導型啟動子如Pgrac、Pxyl等。本領域人員 也可以嘗試枯草芽孢桿菌組成型啟動子如Pveg、PtufA或者P43等。本發明游離型質粒上 選擇組成型啟動子P43,基因組上選擇木糖誘導型啟動子Pxyl。
[0013] 在本發明的一種實施方式中，所述hasA整合于于枯草芽孢桿菌基因組上，以木糖 啟動子Pxyl啟動表達。
[0014] 在本發明的一種實施方式中，所述tuaD、glmU和glmS分別融合P43 RBS序列后， 串聯連接到表達載體PP43NMK，轉化整合表達hasA的枯草芽孢桿菌。
[0015] 在本發明的一種實施方式中，編碼所述透明質酸酶的基因來源于水蛭（SEQ ID NO. 5)，進一步融合編碼6個組氨酸的序列使得編碼的透明質酸酶的N端帶有6個組氨酸， 融合編碼yweA信號肽和Pgrac啟動子的序列后整合到含透明質酸合成途徑的枯草芽孢桿 菌基因組上進行表達。編碼所述透明質酸酶的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。啟動透 明質酸酶表達的啟動子可以為芽孢桿菌來源的誘導型啟動子，本發明的一種實施方式采用 IPTG誘導型啟動子Pgrac。引導透明質酸酶分泌的信號肽為amyX、Bpr、Csn、nprE、oppA、 yweA等，本發明的一種實施方式采用yweA信號肽。
[0016] 本發明還提供一種構建所述重組枯草芽孢桿菌的方法，主要包括以下步驟：
[0017] (1)構建透明質酸的合成途徑：將編碼透明質酸合酶的基因hasA與pAXOl質粒 (自身帶有木糖啟動子Pxyl)重組，置于木糖誘導型啟動子Pxyl控制下，整合于枯草芽孢 桿菌基因組0 -半乳糖苷酶（IacA)位點上表達，將編碼UDP-葡萄糖脫氫酶的基因tuaD與 P43 RBS序列融合，UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因glmU與P43 RBS序列融合，編 碼所述氨基轉移酶的基因glmS與P43 RBS序列融合，再將三個融合片段串聯重組至表達載 體PP43NMK，轉化枯草芽孢桿菌得到含透明質酸合成途徑的重組菌株；
[0018] ⑵偶聯表達透明質酸酶：將透明質酸酶基因融合編碼6各組氨酸的序列、啟動子 Pgrac和YweA信號肽（SEQ ID NO. 9)后整合到步驟（1)所得重組枯草芽孢桿菌的基因組 中，獲得偶聯表達透明質酸酶的重組枯草芽孢桿菌。
[0019] 在本發明的一種實施方式中，步驟（2)選定枯草芽孢桿菌基因組上乳酸脫氫酶基 因作為透明質酸酶整合位點。
[0020] 所述步驟（2)中的透明質酸酶的表達量可采用對啟動子的誘導強度和誘導時間 進行調整。透明質酸酶的表達量越大，重組枯草芽孢桿菌產的HA的分子量就越小。
[0021] 本發明還提供一種應用所述重組枯草芽孢桿菌產低分子量HA(104Da〈Mr〈10 5Da) 或透明質酸寡糖（MKlO4Da)的方法，發酵培養基為以蔗糖或葡萄糖作為碳源的無機鹽培 養基 ：2-5%酵母粉，2-7(%葡萄糖，磷酸二氫鈉15.68/1，；硫酸鉀3.9 8/1，硫酸鎂0.5-28/ L。在37°C下，發酵培養到第2h左右時，添加0. 5-10g/L的木糖，誘導HA的合成，發酵培養 的第0-24h時，添加0. 1-500 ii M的IPTG誘導透明質酸酶基因表達，控制發酵培養時間為 48_96h，獲得分子量IO5Da以下的小分子透明質酸。
[0022] 發酵結束后繼續靜置一段時間，還可獲得主要產物為低分子量或者HA-4、HA_6、 HA-8、HA-10等透明質酸寡糖。
[0023] 在本發明的一種實施方式中，采用低濃度0. IuM IPTG誘導，所得重組菌株發酵生 產的HA平均分子量為I X IO5道爾頓。
[0024] 在本發明的另一種實施方式中，采用較低濃度Iy M IPTG誘導，所得重組枯草芽孢 桿菌發酵生產的HA平均分子量為67500道爾頓。
[0025] 在本發明的另一種實施方式中，采用高濃度100 PM IPTG誘導，所得重組枯草芽孢 桿菌發酵生產的HA平均分子量低于I X IO4道爾頓。
[0026] 在本發明的一種實施方式中，發酵溫度控制為37°C，發酵時間控制為48h。
[0027] 所得發酵液中的透明質酸酶分離純化后可用于食品、醫藥或臨床等用途。
[0028] 本發明利用枯草芽孢桿菌產透明質酸，與其他工程菌相比，該發明具有非常大的 應用優勢。首先，本發明過程中使用的宿主為食品級，完全滿足醫療衛生和食品安全的要 求，無內毒素和病原感染的風險，不會對產物的醫用食品安全帶來隱患；其次，在產高分子 HA的過程中，HA被同時分泌至胞外的透明質酸酶降解為小分子透明質酸，具有直接的目的 性。本發明偶聯表達透明質酸酶，降低了發酵液粘稠度，增加了溶氧和提高了 HA的產量；其 次，發酵液中酶水解制備的小分子寡聚透明質酸的轉化產率高達95%以上，產物的分子量 小余IO 5道爾頓，且主要產物為低分子量寡聚糖，易于純化回收。基于應用分析，本發明方 法在工業上用于制備特定小分子的透明質酸具有潛在而非常廣泛的價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029] 圖1所示為水蛭透明質酸酶整合片段的構建示意圖。
[0030] 圖2所示為第8h采用不濃度的IPTG誘導水蛭透明質酸酶的表達對HA產量的影 響：〇,未添加誘導劑；1，IPTG誘導濃度為0. IiiM ;2, IPTG誘導濃度為IiiM ;3, IPTG誘導濃 度為100 U M。
[0031] 圖3所示為采用I i! M的IPTG在不同時間誘導水蛭透明質酸酶的表達對HA產量 的影響：〇,未添加誘導劑；1，第Oh誘導；2,第4h誘導；3,第8h誘導；4,第24h誘導。

【具體實施方式】
[0032] 序列表中為相關核苷酸序列信息：SEQ ID NO. 1為獸疫鏈球菌來源的透明質酸合 酶hasA基因編碼序列；SEQ ID NO. 2為枯草芽孢桿菌來源的UDP-葡萄糖脫氫酶tuaD基因 編碼序列；SEQ ID NO. 3為枯草芽孢桿菌來源的UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶glmU基 因編碼序列；SEQ ID NO. 4為枯草芽孢桿菌來源的氨基轉移酶glmS基因編碼序列；SEQ ID NO. 5序列信息為水蛭來源的透明質酸酶LHyal基因序列；SEQ ID NO. 6序列信息為人工構 建片段XMZ序列；SEQ ID NO. 7序列信息為Lacl+Pgrac片段序列；SEQ ID NO. 8序列信息為 xylR+Pxyl (木糖阻遏蛋白和啟動子）片段序列；SEQ ID NO. 9序列信息為枯草芽孢桿菌來 源的yweA信號肽核苷酸序列信息。
[0033] 發酵產物HA分子量檢測分析方法：使用安捷倫公司的高效液相色譜儀1260進行 分析，選擇示差檢測器RID，使用凝膠色譜柱Ultrahydrogel Linear進行分析。流動相選擇 0. IM硝酸鈉進行洗脫，柱子溫度設定為40攝氏度，進樣量40 y L，每個樣品洗脫時間25min， 使用中國食品藥品檢定研究院出產的右旋糖酐作為標準品，利用GPC軟件進行平均分子質 量的計算。
[0034] 實施例1整合重組質粒pAXOl-hasA的構建
[0035] 本發明所用的透明質酸合酶hasA基因來源于為獸疫鏈球菌Streptococcus zooepidemicus ATCC 35246，Streptococcus zooepidemicus 菌株接種于 5ml M17 液體培 養基，在37°C 200rpm培養16h。收集菌體，采用細菌基因組提取試劑盒提取獸疫鏈球菌株 的基因組DNA。
[0036] 根據已公布的基因組信息序列，分別設計引物hasA-F/hasA-R，以提取的基因組 DNA為模板，采用標準的PCR擴增體系和程序，擴增獲取hasA基因。
[0037] 引物序列信息：5' -3'方向
[0038] hasA-F ：CGCGGATCCATGAGAACATTAAAAAACCTCATAAC
[0039] hasA-R ： TGCATGCATTTATAATAATTTTTTACGTGTTCC
[0040] 在上下游引物兩端分別引入BamHI和SacII限制性酶切位點。PCR擴增獲取的 hasA片段和質粒pAXOl分別采用BamHI和SacII進行雙酶切，采用瓊脂糖凝膠核酸電泳進 行切膠回收，回收產物進行連接，體系10 :1 雙切的載體，4 ill雙切的目的片段，5 ill Solution連接酶，16°C連接過夜，轉化JM109感受態細胞，挑取單菌落PCR驗證，陽性重組子 進行測序，比對正確，重組質粒pAXOl-hasA構建成功。重組質粒轉化Bacillus subtilis 168,以20 y g/ml的紅霉素平板進行篩選整合重組子，并對重組菌株進行PCR驗證和測序驗 證，對成功整合Pxyl-hasA的枯草芽孢桿菌菌株命名為ZHA168。
[0041] 實施例2重組質粒pP43NMK/tuaD-glmU-glmS的構建
[0042] Bacillus subtilis 168 菌株接種于 5mlLB 培養基，37°C，200rpm 培養 16h。收 集菌體，采用細菌基因組提取試劑盒提取獸疫鏈球菌株的基因組DNA。根據已公布的 Bacillus subtilis 168 基因組信息序列，分別設計引物 tuaD-F/tuaD-R、glmU-F/glmU-R 和glmS-F/glmS-R。在上游引物tuaD-F的5端引入KpnI限制性酶切位點和P43 RBS序列 (AAGAGAGGAATGTACAC)，在下游引物tuaD-R的5端引入XhoI和SacI限制性酶切位點；在 上游引物glmU-F的5端引入SacI限制性酶切位點和P43 RBS序列，在下游引物glmU-R的 5端引入XhoI和XbaI限制性酶切位點；在上游引物glmS-F的5端引入SpeI (XbaI的同尾 酶）限制性酶切位點和P43 RBS序列，在下游引物glmS-R的5端引入XhoI和XbaI限制性 酶切位點。引物信息如下：
[0043] tuaD-F ：CGGGGTACCAAGAGAGGAATGTACACATGAAAAAAATAGCTGTCATTGG
[0044] tuaD-R ： CCGCTCGAGCGGTACATTCGAGCTCTTATAAATTGACGCTTCCCAAG
[0045] glmU-F:CGGGGTACCGAGCTCAAGAGAGGAATGTACACATGGATAAGCGGTTTGCAGTTG
[0046] glmU-R ：CCGCTCGAGCGGACTCTAGTCTAGATTATTTTTTATGAATATTTTTCAC
[0047] glmS-F ：CGGGGTACCAAGAGAGGAATGTACACATGTGTGGAATCGTAGGTTATATCGG
[0048] glmS-R ：CCGCTCGAGCGGACTCTAGTCTAGATTACTCCACAGTAACACTCTTCGC
[0049] 以提取的枯草芽孢桿菌基因組DNA為模板，采用標準的PCR擴增體系和程序，分別 擴增獲取tuaD、glmU和glmS基因。
[0050] 質粒pP43NMK采用KpnI和XhoI雙酶切，同時PCR擴增獲得的tuaD基因產物也 采用KpnI和XhoI雙酶切，經1 %的瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收目標條帶，回收產物進行 連接，體系IOu I :1 Ul雙切的載體，4 雙切的目的片段，5 ill Solution連接酶，16°C 連接過夜，轉化JM109感受態細胞，挑取單菌落PCR驗證，陽性重組子進行測序，比對正確， pP43NMK/tuaD質粒構建成功。
[0051] 同理，按上述操作將重組質粒pP43NMK/tuaD進行SacI和XhoI雙酶切，glmU片段 PCR產物也進行SacI和XhoI雙酶切。回收的兩個片段進行連接，體系10 ill :1 ill雙切的 載體，4 ill雙切的目的片段，5 ill Solution連接酶，16°C連接過夜，轉化JM109感受態細 胞，挑取單菌落PCR驗證，陽性重組子進行測序，結果比對正確，pP43NMK/tuaD-glmU質粒構 建成功。
[0052] 在pP43NMK/tuaD-glmU質粒基礎上，按上述操作進行glmS基因的組裝：pP43NMK/ tuaD-glmU質粒采用XbaI和XhoI進行雙酶切，而glmS片段的PCR產物采用SpeI和XhoI 雙酶切，此步采用一對同尾酶進行連接，體系IOul :lul雙切的載體，4iU雙切的目的片 段，5 ill Solution連接酶，16°C連接過夜，轉化JM109感受態細胞，挑取單菌落PCR驗證，陽 性重組子進行測序，結果比對正確，pP43NMK/tuaD-glmU-glmS質粒構建成功。
[0053] 上述構建的重組質粒分別轉化ZHA168宿主，獲得高產HA的重組枯草芽孢桿菌菌 株：ZHA168/pP43NMK/tuaD-glmU-glmS。
[0054] 實施例3水蛭透明質酸酶LHyal基因整合片段的構建
[0055] 以大腸桿菌來源的毒素基因mazF和博來霉素抗性基因Zeocin作為雙篩選標記， 構建枯草芽孢桿菌基因組無痕改造片段XMZ (SEQ ID NO. 6)。將mazF基因置于木糖誘導 的啟動子Pxyl控制下，具體操作如下：設計引物對Pxyl-F/R、mazF-F/R和Zeo-F/R，分別 擴增xylR+Pxyl (木糖阻遏蛋白和啟動子）片段、mazF和Zeocin片段，具體操作程序如 下：xylR+Pxyl和mazF片段各取2 ill混合于PCR管內，加入無菌水21 ill和25 ill 2 X super pfu Master Mix (杭州寶賽生物科技有限公司），混勻后置于PCR儀，按如下程序運 行：94°C 3min，[94°C 30s，50°C 30s，72°C lmin] X10, 72°C 5min。無引物自融合 PCR 結束后， 立即加入引物Pxyl-F和mazF-R各liil，混勻后按如下程序運行：94°C 3min，[94°C 30s， 55°C 30s，72°C lmin] X32, 72°C 5min。PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收目標 條帶，獲得Pxyl-mazF片段。
[0056] 同理，按上述融合PCR操作，將Pxyl-mazF片段與zeocin片段進行融合，獲得目標 片段 XMZ :Pxyl-mazF_zeocin
[0057] 引物對信息如下：
[0058] Pxyl-F ： CTAACTTATAGGGGTAACACTT
[0059] Pxyl-R： GTATCGGCTTACCATTGTACATTTCCCCCTTTGATTTTTAG
[0060] mazF-F ：AAAGGGGGAAATGTACAATGGTAAGCCGATACGTACC
[0061] mazF-R ： TAAAAAGCCATATCAAGCTACCCAATCAGTACGTTAATT
[0062] Zeo-F ：ACGTACTGATTGGGTAGCTTGATATGGCTTTTTATATGTG
[0063] Zeo-R ： TCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAG
[0064] 選定枯草芽孢桿菌基因組上乳酸脫氫酶Idh基因位點作為透明質酸酶整合位點。 采用XMZ無痕操作技術，構建整合片段（見附圖1)。先采用融合PCR技術，將來源于質粒 pHTOl的Lacl+Pgrac片段與yweA_sp_H6LHyal基因（在LHyal序列前段已融合yweA信號 肽序列和6個組氨酸序列CACCACCACCACCACCAC)進行融合；在Idh基因兩端各取500bp左 右的DNA片段作為同源重組的同源臂Arm-F和Arm-R,同時取Arm-R下游約33bp的序列作 為二次交換序列（DR)，融合于XMZ片段前端。最后，采取多次重疊PCR技術，按實施例3融 合片段操作過程和附圖2所示順序，構建完整的基因整合片段。此實施例引物信息序列如 下：
[0065] Arm-F-F ：GAAGTGTTGCACAATATAAATGTG
[0066] Arm-R ：GGAAAGCGGGCAGTGAATGTTGCGTAAGTCAGGATATCAACCG
[0067] Arm-R-F ：CGAGGAGCAGGACTGACGGCCTGCCAAAAGAGCGGGTGAT
[0068] Arm-R-R ：TTAGTTGACTTTTTGTTCTGC
[0069] LacI/Pgrac-F ：TCCTGACTTACGCAACATTCACTGCCCGCTTTCCAGTCG
[0070] Lacl/Pgrac-R ：AATGAAGTTCTTTTTAGCATATCCTTCCTCCTTTAATTGG
[0071] H6LHyal-F ：TAAAGGAGGAAGGATATGCTAAAAAGAACTTCATTCGTATC
[0072] H6LHyal-R ：
[0073] AGCTCAGTGATACCTGCGATCCCTCCGCGATTATTTTTTGCAGGCTTCAACG
[0074] XMZ-F:AGGGATCGCAGGTATCACTGAGCTGAACTAACTTATAGGGGTAACACTT
[0075] XMZ-R：GCTCTTTTGGCAGGCCGTCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAG
[0076] 重組片段制備濃度為500ng/ iil，電轉產HA的重組宿主ZHA168/pP43NMK/ tuaD-glmU-glmS，涂布含有25 ii g/mlZeocin的LB平板，置于37°C培養12h，發生同源重組 的菌落攜帶XMZ片段，可以在此平板上生長。對長出的單菌落轉移至含有2 %木糖為的LB 平板上，置于37°C培養12h。在此過程中，以DR序列發生第二次交換，使得XMZ片段丟失， 實現H6LHyal的無痕整合。若未發生二次交換，XMZ未丟失，木糖啟動子在誘導下表達毒性 蛋白mazF，使得宿主死亡。因此，在含木糖的LB平板上能生長的菌為成功重組H6LHyal的 宿主，通過提取基因組進行PCR驗證和測序，該宿主改造成功，含有水蛭透明質酸酶的重組 菌株命名為 LH168/pP43NMK/tuaD-glmU-glmS。
[0077] 實施例4重組LH168/pP43NMK/tuaD-glmU-glmS菌株的搖瓶發酵
[0078] 挑取 LH168/pP43NMK/tuaD-glmU-glmS 重組菌單克隆接種于 5ml 含有 50 ii g/ml Kan的LB培養基，置于200rpm37°C過夜培養。發酵過程操作：16h后接種于250ml三角搖瓶 (裝液量25ml)中，發酵培養基為無機鹽培養基：2 %酵母粉，7 %葡萄糖，磷酸二氫鈉15. 6g/ L，硫酸鉀3. 9g/L。按10%的接種量轉接于搖瓶（此起點設為第Oh)，置于200rpm37°C培 養，在接種后第2h添加2g/L的木糖進行誘導hasA基因表達，繼續發酵培養46h。發酵過程 中第8h分別進行不同濃度的IPTG誘導，控制H6LHyal的分泌表達量，以達到不同分子量的 HA，IPTG誘導濃度分為三個梯度：0.1 iiM、Iii MUOOii M。同時，采用Iii M的誘導濃度在不 同的時間點開始誘導：發酵第〇h、4h、8h和24h。
[0079] 收集發酵液，IOOOOrpm下室溫離心lOmin。發酵液上清轉移置另一離心管中，加入 2倍體積的無水乙醇充分混勻沉淀發酵液中的透明質酸。室溫下靜置lh，再IOOOOrpm下室 溫離心20min，去除干凈液體，白色沉淀加入發酵液等體積的IM NaCl溶液充分溶解，適當 稀釋后，采用Bitter-Muir硫酸咔唑法檢測HA酸含量。從附圖2看出，在第8h采用不同的 IPTG誘導濃度誘導H6LHyal的表達，對HA產量的影響幅度在30%左右，100 ii M濃度的IPTG 誘導HA產量比0. I y M的誘導高出45%，說明透明質酸酶的表達量大有助于降解HA，并對 HA的合成有促進作用。同時根據附圖3所示不同的誘導時間看出，透明質酸酶的誘導表達 時間在菌體生長的對數后期，對HA的產量較其它誘導時間高一點，但差別不是很大。
[0080] 根據HA產物的分子量測定，不同的IPTG誘導控制透明質酸酶的表達量，所得重組 菌株發酵生產的小分子HA的平均分子量之間有區別。在低濃度0. I y M的誘導劑控制下， 發酵重組菌株獲得的平均分子量為I X IO5道爾頓。而在I ii M的誘導濃度下表達透明質酸 酶，發酵重組菌株獲得的平均分子量為67500道爾頓。進一步提高IPTG的誘導濃度，加大 透明質酸酶的分泌表達，所得重組枯草芽孢桿菌發酵生產的HA平均分子量低于I X IO4道 爾頓，并且，在發酵結束后，離心收集發酵液上清，繼續放置l_3h，繼續水解可以獲得HA10、 HA8、HA6和HA4等寡糖產物。
[0081] 雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技 術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范 圍應該以權利要求書所界定的為準。
【權利要求】
1. 一種產小分子透明質酸的重組枯草芽孢桿菌，是在枯草芽孢桿菌內構建合成透明質 酸的途徑并偶聯誘導分泌表達透明質酸酶；所述構建合成透明質酸的途徑，是在枯草芽孢 桿菌中表達了編碼透明質酸合酶的基因 haSA、UDP-葡萄糖脫氫酶的基因 tuaD、UDP-N-乙酰 氨基葡糖焦磷酸化酶的基因 glmU和氨基轉移酶的基因 glmS。
2. 根據權利要求1所述的重組枯草芽孢桿菌，其特征在于，所述透明質酸合酶編碼基 因 hasA 來源于獸疫鏈球菌（Streptococcus zooepidemicus)、馬鏈球菌（Streptococcus equi)或類馬鏈球菌（Streptococcus equissp) ;tuaD、glmU和glmS來源于鏈球菌屬 (Streptococcus species)、大腸桿菌（Escherichia coli)或芽抱桿菌（Bacillus) 〇
3. 根據權利要求1所述的重組枯草芽孢桿菌，其特征在于，所述hasA整合于枯草芽 孢桿菌基因組上，以木糖誘導型啟動子Pxyl啟動表達；所述tuaD、glmU和glmS分別融合 P43RBS序列后，以表達載體pP43NMK串聯表達。
4. 根據權利要求1所述的重組枯草芽孢桿菌，其特征在于，編碼所述透明質酸酶的基 因來源于水蛭，進一步融合編碼6個組氨酸的序列使得編碼的透明質酸酶的N端帶有6個 組氨酸，融合yweA信號肽和Pgrac啟動子后整合到含透明質酸合成途徑的枯草芽孢桿菌基 因組上進行表達。
5. -種構建所述重組枯草芽孢桿菌的方法，主要包括以下步驟： (1) 構建透明質酸的合成途徑：將編碼透明質酸合酶的基因 hasA置于木糖誘導型啟動 子Pxyl控制下，整合于枯草芽孢桿菌基因組lacA位點上表達，將編碼UDP-葡萄糖脫氫酶 的基因 tuaD與P43RBS序列融合，UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因 glmU與P43RBS 序列融合，編碼所述氨基轉移酶的基因 glmS與P43RBS序列融合，再將三個融合片段串聯重 組至表達載體PP43NMK，轉化枯草芽孢桿菌得到含透明質酸合成途徑的重組菌株； (2) 偶聯表達透明質酸酶：將透明質酸酶基因融合編碼6個組氨酸的序列、YweA信號肽 和啟動子Pgrac后整合到步驟（1)所得重組枯草芽孢桿菌的基因組中，獲得偶聯表達透明 質酸酶的重組枯草芽孢桿菌。
6. 根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟（2)選定枯草芽孢桿菌基因組上乳酸 脫氫酶基因作為透明質酸酶整合位點。
7. -種應用權利要求1所述重組枯草芽孢桿菌產透明質酸的方法，通過控制誘導劑的 濃度、誘導時間或者信號肽的分泌強度來控制透明質酸酶酶量，以獲得不同分子量的小分 子透明質酸產物。
8. -種應用權利要求1所述重組枯草芽孢桿菌產小分子透明質酸或透明質酸寡 糖的方法，所述小分子透明質酸的分子量為l〇 4Da〈Mr〈105Da，透明質酸寡糖的分子量為 Mr〈104Da，發酵培養基：酵母粉20-50g/L，葡萄糖或蔗糖20-70g/L，磷酸二氫鈉15. 6g/L，硫 酸鉀3. 9g/L，硫酸鎂0. 5-2g/L，在37°C下，發酵培養第2h時，添加0. 5-10g/L的木糖，誘導 HA的合成，發酵培養的第0-24h時，添加0. 1-500 μ Μ的IPTG誘導透明質酸酶基因表達，控 制發酵培養時間為48-96h，獲得小分子透明質酸或透明質酸寡糖。
9. 根據權利要求8所述的方法，其特征在于，在發酵培養第2h時，添加2%的木糖誘導 培養，發酵培養至第8h時，添加1 μ MIPTG誘導，IPTG誘導培養40h，得到HA平均分子量為 67500道爾頓。
10. 根據權利要求8所述的方法，其特征在于，在發酵培養第2h時，添加2%的木糖誘 導培養，發酵培養至第8h時，添加100 μ MIPTG誘導，IPTG誘導培養40h，得到HA平均分子 量低于IX 1〇4道爾頓。
【文檔編號】C12N1/21GK104293726SQ201410555019
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月17日 優先權日:2014年10月17日
【發明者】康振, 陳堅, 堵國成, 金鵬 申請人:江南大學