一種培育高抗tylcv番茄的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種培育高抗TYLCV番茄的方法，具體是選擇TYLCV基因組中AV1基因、AC1基因和AC3基因的片段嵌合得到多基因嵌合體AV1-AC1-AC3，并構(gòu)建回文序列的干擾載體RNAi；通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)在番茄子葉中瞬時(shí)表達(dá)dsRNA，得到轉(zhuǎn)化多基因嵌合體AV1-AC1-AC3的轉(zhuǎn)基因番茄；轉(zhuǎn)基因番茄經(jīng)過TYLCV的系統(tǒng)侵染后表現(xiàn)為對(duì)TYLCV抗性，未觀察到明顯的發(fā)病癥狀，具有高抗TYLCV性能，從而篩選出高抗TYLCV番茄。本發(fā)明可在2個(gè)月內(nèi)快速篩選和培育出高抗TYLCV番茄株系，大大縮短了培育周期，為防治TYLCV提供了技術(shù)支持。
【專利說明】-種培育高抗TYLCV番茄的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種培育高抗TYLCV番茄的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 番爺黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)屬于雙生病毒科 (Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus)，是植物病毒中唯--類具有孿生 顆粒形態(tài)的單鏈環(huán)狀DNA(single stranded DNA，ssDNA)病毒。TYLCV基因組編碼六個(gè)ORF : 在病毒鏈上的AVl和AV2,在互補(bǔ)鏈上的AC1、AC2、AC3和AC4。AVl編碼的是病毒的外殼蛋 白（coat protein，CP)，與病毒的包殼、介體傳播及與寄主互作相關(guān)；AV2編碼是移動(dòng)蛋白 (move protein, MP)相關(guān)的蛋白，主要起到協(xié)助移動(dòng)蛋白的功能；ACl編碼病毒復(fù)制相關(guān)蛋 白（replication-associated protein, Rep)，參與病毒基因組DNA的復(fù)制起始；AC2編碼的 蛋白是一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活子（transcriptional activator, TrA)，該蛋白能激活DNA-A和DNA-B 病毒鏈上的基因轉(zhuǎn)錄；AC3編碼一個(gè)復(fù)制增強(qiáng)蛋白（replication enhancer protein, REn)， 但對(duì)病毒侵染力不起決定作用）；AC4編碼的蛋白參與病毒的復(fù)制或轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
[0003] TYLCV病發(fā)病癥狀主要表現(xiàn)為：頂端葉片邊緣黃化且上卷，葉脈間葉肉發(fā)黃，植株 上部葉片變小，整個(gè)葉片萎縮，褶皺，植株生長變緩或停滯，節(jié)間縮短，明顯矮化，致使產(chǎn)量 和質(zhì)量降低。1991年，我國首次在廣西南寧發(fā)現(xiàn)該病毒。從2006年起，該病毒在北京、山 西、江蘇、上海、廣東、廣西、云南等地相繼發(fā)現(xiàn)，并對(duì)當(dāng)?shù)氐姆焉a(chǎn)造成了巨大的損失。
[0004] 預(yù)防為主、防治結(jié)合是防治番茄黃化曲葉病毒病的主要原則，目前主要通過調(diào)整 栽培結(jié)構(gòu)、防治煙粉虱、加強(qiáng)田間管理以及選用抗病品種等措施對(duì)該病進(jìn)行綜合防治。但這 些方法成本高、效果不夠理想，有時(shí)甚至?xí)o環(huán)境帶來負(fù)面影響，而進(jìn)行抗病品種選育是最 有效的途徑之一。在TYLCV的抗病性育種方面，國外研究的比較早，目前國外一些國家的科 研人員已經(jīng)以野生抗病番茄品系為材料，通過雜交選育和基因工程得到了一些抗病或耐病 的商業(yè)品種。
[0005] 但傳統(tǒng)的雜交育種艱苦費(fèi)時(shí)，從而大大限制了育種工作的進(jìn)展。與之相比，基因工 程育種具有明顯的優(yōu)越性：1)育種周期短；2)適用范圍廣，尤其適用于傳統(tǒng)育種因缺乏抗 原而難以進(jìn)行的抗CMV育種；3)在育種過程中不會(huì)引入其它不良農(nóng)藝性狀的基因等。因此， 基因工程在番茄抗病毒病育種中的應(yīng)用日益受到人們的重視。當(dāng)前，番茄抗病毒病基因工 程主要采用轉(zhuǎn)病毒外殼蛋白（CP)基因的方法，獲得了轉(zhuǎn)煙草花葉病毒外殼蛋白基因番茄， 培育出了能穩(wěn)定遺傳的抗病毒植株。除病毒的外殼蛋白基因外，目前在番茄上主要采用衛(wèi) 星RNA、反義RNA以及RNAi等方法獲得不同程度的抗病毒番茄。
[0006] 目前，轉(zhuǎn)基因的大部分的注意力都集中于單個(gè)的ACl蛋白、AVl蛋白或干擾TYLCV 在番茄內(nèi)的復(fù)制、轉(zhuǎn)移的其它蛋白基因。這種轉(zhuǎn)基因的方法獲得的高抗轉(zhuǎn)基因植物的幾率 較小，且該策略還存在異源重組等生態(tài)安全性的問題。RNA沉默機(jī)制的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，為抗病 毒基因工程提供了新的途徑，該方面的研究在國際、國內(nèi)已經(jīng)廣泛深入進(jìn)行。但是，所有抗 TYLCV的商業(yè)雜交種均為單個(gè)抗性基因?qū)?，?dāng)TYLCV大規(guī)模發(fā)生時(shí)，它們的抗病能力有限 甚至下降，仍會(huì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。為保障我國番茄產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展，促進(jìn)菜農(nóng)增產(chǎn)增 收，進(jìn)行更高抗TYLCV的番茄新品種的研究選育工作刻不容緩。
[0007] 有研究表明，通過聚合不同抗源的基因以提高植物對(duì)多種病毒的抗性是提高一個(gè) 品種抗病能力的重要策略之一。2005年，白慶榮等在煙草中轉(zhuǎn)入PVX-CP和PVY-CP嵌合基 因并獲得了 6株對(duì)兩種病毒免疫的轉(zhuǎn)基因株系；2008年，朱常香等獲得了同時(shí)對(duì)PVY、TMV 和CMV這3種病毒都有抗性的煙草；2011年，牛顏冰等獲得同時(shí)對(duì)兩種病毒（TMV和CMV)免 疫的轉(zhuǎn)基因煙草；至今為止，國內(nèi)外尚未有關(guān)利用基因技術(shù)聚合同一抗源的不同基因來提 高植物對(duì)特定病毒高抗性的研究報(bào)道，因此進(jìn)行高抗TYLCV番茄新品系的多嵌合基因沉默 技術(shù)及相關(guān)研究具有重大意義。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種培育高抗TYLCV番茄的方法，針對(duì)目前TYLCV對(duì)番茄的 產(chǎn)量和質(zhì)量的嚴(yán)重危害，采用基因瞬時(shí)表達(dá)來快速篩選并培育對(duì)TYLCV具有高抗性的高抗 TYLCV番茄，大大縮短篩選周期。
[0009] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0010] 一種培育高抗TYLCV番茄的方法，包括如下步驟：
[0011] 1)將TYLCV的AVl基因片段、ACl基因片段和AC3基因片段嵌合得到多基因嵌合 體AV1-AC1-AC3,并構(gòu)建反向重復(fù)序列的RNAi載體；其中，AVUACl和AC3基因片段的核苷 酸序列分別如SEQIDNo·l，SEQIDNo·2和SEQIDNo·3所示，多基因嵌合體AVl-ACl-AC3 的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。
[0012] 2)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將RNAi載體在番茄上瞬時(shí)表達(dá)得到轉(zhuǎn)化多基因嵌合體 AV1-AC1-AC3的轉(zhuǎn)基因番茄。
[0013] 3)轉(zhuǎn)基因番茄經(jīng)過TYLCV系統(tǒng)性侵染、鑒定抗病性，獲取對(duì)TYLCV具有抗性的高抗 TYLCV番茄。
[0014] 一種快速篩選并培育高抗TYLCV番茄的方法，包括如下步驟：
[0015] 1)以感病番茄中提取的總DNA為模板，利用三對(duì)引物AV1F/AV1R，AC1F/AC1R和 AC3F/AC3R分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增AVl基因片段，ACl基因片段和AC3基因片段，所述AVI、ACl 和AC3基因片段的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示；弓丨 物 AV1F/AV1R，AC1F/AC1R 和 AC3F/AC3R 的序列具體為：
[0016] AVIF ：CGCGGATCCGAGCTCATTCGTCTTAACAC
[0017] AVlR：ATATTTATTAAAATCATAGAAA
[0018] AC3F ：TTTCTATGATTTTAATAAATAT
[0019] AC3R ：TTCAAATTAAAGTATTTAAATA
[0020] AClF ：TATTTAAATACTTTAATTTGAA
[0021] ACIR ： GCTCTAGAGCGGCCGCGATCTGAGTCC
[0022] 2)將如 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2 和 SEQ ID No. 3 所示的 PCR 產(chǎn)物混合，以 引物AVlF和AClR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到多基因嵌合體AV1-AC1-AC3,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。多基因嵌合體AV1-AC1-AC3與載體pGEM-T Easy Vector連接，得到質(zhì)粒 PGEM-T-AV1-AC1-AC3。
[0023] 3)使用限制性內(nèi)切酶XbaI和BamHI雙酶切質(zhì)粒pGEM-T-AVl-ACl-AC3和克隆載體 pBluescript II SK(-)-RTMl，將酶切片段和載體進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pBluescript II SK (-)-AV1-AC1-AC3-RTM1。
[0024] 4)使用限制性內(nèi)切酶SacI和NotI雙酶切質(zhì)粒pBluescript II SK㈠ -AV1-AC1-AC3-RTM1和質(zhì)粒PGEM-T-AV1-AC1-AC3,將酶切片段和載體進(jìn)行連接，得到 重組質(zhì)粒 pBluescript II SK(-)-AVl-ACl-AC3(i/r)。
[0025] 5)將構(gòu)建的干擾片段AV1-AC1-AC3從重組質(zhì)粒pBluescript II SK㈠ -AV1-AC1-AC3 (i/r)上使用限制性內(nèi)切酶SacI和BamHI雙酶切切下，并連接到植物表 達(dá)載體 PBIN19 上，構(gòu)建 RNAi 載體 pBIN19-AVl-ACl-AC3 (i/r)。
[0026] 6)通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將RNAi載體pBIN19-AVl-ACl-AC3 (i/r)注射到2-3葉期苗 齡的番茄幼苗，注射20d后，用含有TYLCV侵染質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染番茄植株，將TYLCV基因 組導(dǎo)入番茄植株內(nèi)；通過提取番茄DNA、斑點(diǎn)雜交檢測TYLCV含量來篩選對(duì)TYLCV具有抗性 的高抗TYLCV番茄。
[0027] 本發(fā)明所述培育高抗TYLCV番茄的方法在提高番茄抗TYLCV中的應(yīng)用。
[0028] 本發(fā)明轉(zhuǎn)化了多基因嵌合體AV1-AC1-AC3的轉(zhuǎn)基因番茄經(jīng)含有TYLCV侵染質(zhì)粒 的農(nóng)桿菌接種到番茄植株進(jìn)行傳毒，接種5周后其葉片生長正常，沒有感染TYLCV的癥狀， 在其葉片中也沒有檢測到TYLCV，說明轉(zhuǎn)化了多基因嵌合體AV1-AC1-AC3的轉(zhuǎn)基因番茄對(duì) TYLCV具有高抗性，從而篩選并培育出對(duì)TYLCV具有高抗性的高抗TYLCV的轉(zhuǎn)基因番茄。
[0029] 本發(fā)明的有益效果：
[0030] 本發(fā)明利用TYLCV基因組中AVI、ACl和AC3基因片段擴(kuò)增出如SEQ ID NO. 4所 示的多基因嵌合體AV1-AC1-AC3,并構(gòu)建了專用于番茄的瞬時(shí)表達(dá)RNAi載體，將其在番茄 上瞬時(shí)表達(dá)得到轉(zhuǎn)化多基因嵌合體AV1-AC1-AC3的轉(zhuǎn)基因番茄，轉(zhuǎn)基因番茄再經(jīng)過TYLCV 系統(tǒng)性侵染、鑒定抗病性，獲取高抗TYLCV番茄，可以在2個(gè)月內(nèi)篩選并培育具有優(yōu)良高抗 TYLCV的轉(zhuǎn)基因番茄，大大縮短番茄的育種周期，為防治TYLCV提供了技術(shù)支持。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0031] 圖1為本發(fā)明多基因嵌合的RNAi載體T-DNA區(qū)域的構(gòu)建流程圖；
[0032] 圖2為本發(fā)明嵌合基因瞬轉(zhuǎn)番茄的PCR檢測結(jié)果，其中，M :DNA marker ; 1-8 :嵌合 基因瞬轉(zhuǎn)番茄；
[0033] 圖3為本發(fā)明TYLCV侵染沒有轉(zhuǎn)化的番茄的葉片照片；
[0034] 圖4為本發(fā)明TYLCV侵染轉(zhuǎn)化空載的番茄的葉片照片；
[0035] 圖5為本發(fā)明TYLCV侵染轉(zhuǎn)化多基因嵌合體的番茄的葉片照片；
[0036] 圖6為本發(fā)明轉(zhuǎn)基因番茄體內(nèi)TYLCV的檢測結(jié)果，其中，1 :接種TYLCV的沒有轉(zhuǎn)化 的番茄；2 :轉(zhuǎn)化嵌合基因的番茄；3 :沒有接種TYLCV的沒有轉(zhuǎn)化的番茄。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 以下結(jié)合附圖詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案 而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理 解，可以對(duì)發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范 圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。
[0038] 本發(fā)明所用的試劑和材料若未經(jīng)說明，均購自西格瑪一奧德里奇（Sigma - Aldrich)公司。
[0039] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，如沒有特別注明，均參考自《分子克隆》一書（J.薩 姆布魯克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994,科學(xué)出版社。）
[0040] 實(shí)施例ITYLCV的AVI，ACl和AC3基因片段的RNAi載體構(gòu)建
[0041] 三基因片段嵌合基因的RNAi載體的構(gòu)建流程如圖1所示，主要步驟如下：
[0042] I. 1感病番茄的基因組DNA提取
[0043] 本實(shí)施例采取改良的CTAB法提取番茄葉片基因組DNA。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：稱取 2g感病的番茄葉片放入_20°C預(yù)冷的研缽中，加入適量液氮，而后迅速將葉片研成粉末。研 磨完后將粉末裝入I. 5mL的EP管中；在EP管中加入600 μ L 2% CTAB溶液（60°C預(yù)熱）， 振蕩混勻，60°C水浴15min ;加入300μ L氯仿，輕微振蕩，放入4°C離心機(jī)中13, OOOrpm,離 心5min。將上清轉(zhuǎn)移至另一新I. 5mLEP管中；加入等體積的25:24:1的苯酚/氯仿/異戊 醇，輕微振蕩，放入4<€離心機(jī)中13,000印111，離心51]1；[11。將上清轉(zhuǎn)移至另一新1.51]11^?管 中；加等體積（600 μ L)異丙醇，輕微搖勻，在-20°C冰箱沉淀不少于30min;將沉淀后的EP 管13, OOOrpm離心lOmin。棄上清后，用75%的乙醇將沉淀出的DNA洗滌2次；待乙醇蒸發(fā) 干后，向EP管中加入50 μ L TE緩沖液溶解DNA ;加入2 μ L的RNase，混勻后放入37°C水浴 lh，放-20°C冰箱備用。
[0044] I. 2PCR分別擴(kuò)增AVI，ACl和AC3基因片段
[0045] 引物如下所示：
[0046] AVIF ：CGCGGATCCGAGCTCATTCGTCTTAACAC
[0047] AVlR ：ATATTTATTAAAATCATAGAAA
[0048] AC3F ：TTTCTATGATTTTAATAAATAT
[0049] AC3R ：TTCAAATTAAAGTATTTAAATA
[0050] AClF ：TATTTAAATACTTTAATTTGAA
[0051] ACIR ： GCTCTAGAGCGGCCGCGATCTGAGTCC
[0052] 以感病番茄中提取的基因組DNA為模板，分別以引物AV1F/AV1R，AC1F/AC1R和 AC3F/AC3R分別擴(kuò)增3個(gè)目的片段AVI，ACl和AC3。所述目的片段AVI，ACl和AC3的核苷 酸序列分別如 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2 和 SEQ ID No. 3 所示。
[0053] PCR 反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性 5min，（94°C變性 30sec，55°C退火 30sec，72°C延伸 lmin) 30個(gè)循環(huán)，72°C繼續(xù)延伸5min。I. 0 %瓊脂糖凝膠電泳分離并使用DNA凝膠回收試劑 盒（Axygen公司）回收目的片段AVI，ACl和AC3。
[0054] I. 3PCR 擴(kuò)增嵌合基因 AV1-AC1-AC3
[0055] 將1. 2擴(kuò)增的目的片段AVI，ACl和AC3混合做模板，以AVlF和AClR作為引物進(jìn) 行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性5min，（95°C變性60sec，55°C退火IOsec) 7個(gè)循 環(huán)，72°C繼續(xù)延伸 2min，（94°C變性 30sec，58°C退火 30sec，72°C延伸 lmin) 30 個(gè)循環(huán)，72°C 繼續(xù)延伸lOmin。I. 0%瓊脂糖凝膠電泳分離并使用DNA凝膠回收試劑盒（Axygen公司）回 收嵌合基因片段AV1-AC1-AC3，其核苷酸序列如SEQIDN0.4所示?；厥盏腁V1-AC1-AC3片 段，連接到pGEM-T vector中。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，涂板。次日挑取大腸桿菌菌 落，培養(yǎng)過夜后抽取質(zhì)粒，命名為PGEM-T-AV1-AC1-AC3。
[0056] L 4 克隆載體 pBluescript II SK(-)-RTMl 的構(gòu)建
[0057] 引物如下所示：
[0058] Fl：GCTCTAGATAGGACCTGTAGGGAAGC
[0059] Rl：GCGCGGCCGCACGCCATGAGATAGAAAA
[0060] 按照I. 1的方法提取擬南芥的基因組DNA，按照I. 2的方法，使用引物Fl和Rl 擴(kuò)增120bp的RTMl基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，按照1. 3的方法獲取 pGEM-T-RTMl。以pBluescript II SK(-)為出發(fā)克隆載體，將含有克隆載體pBluescript II SK(-)的大腸桿菌菌液以及含有質(zhì)粒pGEM-T-RTMl的大腸桿菌菌液接種到1.6mL LB液 體培養(yǎng)基（含有氨卞霉素）中，37°C，220rpm振蕩培養(yǎng)過夜，次日提取質(zhì)粒。限制性內(nèi)切酶 XbaI和NotI雙酶切質(zhì)粒pBluescript II SK (-)和質(zhì)粒pGEM-T-RTMl，瓊脂糖凝膠電泳回 收目的片段RTMl和載體片段pBluescript II SK (_)。將載體片段pBluescript II SK (-) 和目的片段1^￥1，41：連接過夜，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌0冊(cè)〇感受態(tài)細(xì)胞中，加入80(^1^ SOC液體培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)2h后，涂在加入氨卞霉素的LB固體平板上，37°C培養(yǎng)過夜。挑取 平板上的單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中（含有氨卞霉素），37°C震蕩培養(yǎng)過夜，次日提取 質(zhì)粒進(jìn)行XbaI和NotI雙酶切鑒定。酶切結(jié)果正確表明目的片段RTMl已正確連接到載體 pBluescript II SK(-)上，重組質(zhì)粒命名為 pBluescript II SK(-)-RTMl。
[0061] 1. 5嵌合基因正向片段的構(gòu)建
[0062] 使用限制性內(nèi)切酶XbaI和BamHI雙酶切質(zhì)粒pBluescript II SK(_)-RTMl和質(zhì)粒 PGEM-T-AV1-AC1-AC3,連接，轉(zhuǎn)化，及重組質(zhì)粒的鑒定。方法同1.4。酶切結(jié)果正確表明AC3 正向片段已正確連接到載體pBluescript II SK(-)-RTMl上，重組質(zhì)粒命名為pBluescript II SK(-)-AVl-ACl-AC3-RTMl。
[0063] 1.6嵌合基因反向片段的構(gòu)建
[0064] 使用限制性內(nèi)切酶SacI和NotI雙酶切質(zhì)粒pBluescript II SK㈠ -AV1-AC1-AC3-RTM1和質(zhì)粒PGEM-T-AV1-AC1-AC3,連接，轉(zhuǎn)化，及重組質(zhì)粒的鑒定。方 法同1.4。酶切結(jié)果正確表明AV-AC1-AC3反向片段已正確連接到載體pBluescript II SK (-)-AVl-ACl-AC3-RTMl 上，重組質(zhì)粒命名為 pBluescript II SK (-)-AVl-ACl-AC3 (i/r)。
[0065] I. 7RNAi植物表達(dá)載體的構(gòu)建
[0066] 將構(gòu)建的干擾片段AV1-AC1-AC3從克隆載體pBluescript II SK㈠ -AV1-AC1-AC3 (i/r)上使用限制性內(nèi)切酶SacI和BamHI雙酶切切下，并連接到植物表 達(dá)載體PBIN19,轉(zhuǎn)化，及重組質(zhì)粒的鑒定。方法同1.4。酶切結(jié)果正確表明AV1-AC1-AC3反 向重復(fù)片段已正確連接到載體PBIN19上，重組質(zhì)粒命名為pBIN19-AVl-ACl-AC3 (i/r)。
[0067] 實(shí)施例2農(nóng)桿菌介導(dǎo)法瞬轉(zhuǎn)番茄
[0068] 2. 1農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞的制備
[0069] 挑取農(nóng)桿菌EHA105在含有25 μ g/mL利福平的YEP固體平板劃線，28 °C培養(yǎng) 36-48h ;挑取單菌落接種于2mLYEP培養(yǎng)基中，28°C，200rpm培養(yǎng)過夜；2mL菌液接種到 50mLYEP 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng) 6-8h，至 0D600 = 0. 5,冰浴 IOmin ;4°C，7, OOOrpm 離心 5min，棄 上清，將菌體重懸于5mL 20mM CaC12溶液中；4°C，7,000rpm離心Imin,棄上清，菌體用ImL 20mM預(yù)冷的CaC12輕輕懸浮，每管100 μ L分裝，液氮速凍，-80°C保存?zhèn)溆谩?br>
[0070] 注：實(shí)驗(yàn)中所有接觸空氣的步驟均在超凈臺(tái)操作，NaCl和CaC12配制完成后121°C 滅菌20min備用。
[0071] 2. 2RNAi載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0072] 將5 μ L重組質(zhì)粒pBIN19-AVl-ACl-AC3 (i/r)加入到100 μ L農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì) 胞中，輕輕吹吸混勻；將轉(zhuǎn)化的感受態(tài)放入液氮中冷凍lmin，取出后水浴鍋中37°C水浴 15min ;離心管中加入800 μ L無抗性YEP液體培養(yǎng)基，28°C，200rpm培養(yǎng)3h ;8, OOOrpm離心 lmin，棄掉大部分上清，剩余100 μ L重懸菌體，涂布在加入100mg/L卡那霉素和25mg/L利 福平的YEP固體平板上，28 °C培養(yǎng)36h ;待平板上長出單菌落后，挑取單菌落接種到2mL加 入卡那霉素和利福平的YEP液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)過夜；使用菌液PCR對(duì)農(nóng)桿菌進(jìn)行鑒定。 使用引物Fl和Rl擴(kuò)增，當(dāng)目的片段長度為120bp時(shí)，則檢測結(jié)果正確。結(jié)果正確的用于農(nóng) 桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。
[0073] 2. 3農(nóng)桿菌瞬轉(zhuǎn)番茄
[0074] 將結(jié)果正確的農(nóng)桿菌菌液接種到含2mL加入100mg/L卡那霉素和25mg/L利福平 的YEP液體培養(yǎng)基的試管中，28°C，200rpm震蕩培養(yǎng)約20h，使菌液0D600 = 0. 6左右；將 搖培的菌液轉(zhuǎn)入含50mL加入100mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的YEP液體培養(yǎng)基的錐形 瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)4-7h，檢測菌液濃度0D600 = 0. 6左右；離心搖培的菌液，收集菌體，使用農(nóng) 桿菌侵潤緩沖液將菌體稀釋至0D600 = 2. 0左右，室溫放置2h，即可用于侵染番茄植株；使 用無菌注射器的針頭在番茄植株已完全展開的第二片或第三片葉子上劃出傷口，傷口不宜 過大，不要扎透葉片，只需稍微劃破上表皮即可，注射器針筒吸取準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌侵染液， 以手指墊住番茄葉片傷口的背面，針筒對(duì)準(zhǔn)傷口靠壓力將侵染液注入到葉片兩個(gè)分葉脈之 間。含不同轉(zhuǎn)化載體的農(nóng)桿菌需用不同的注射器，同時(shí)對(duì)部分植株注射含空載體的菌液，作 為陰性對(duì)照。
[0075] 2. 4瞬轉(zhuǎn)番茄的PCR檢測
[0076] 攜帶抗病毒載體的農(nóng)桿菌侵染番爺植株一周后，隨機(jī)挑選其中8株番爺，按照I. 1 的方法提取注射葉片的總DNA，按照1. 2的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化片段的PCR檢測，使用的引物為 AV1AC1AC3F和AV1AC1AC3R。檢測結(jié)果如圖2所示，泳道M為DNA標(biāo)記，泳道1-8為隨機(jī) 所選的8株番茄。所選的番茄泳道中都能擴(kuò)增到200bp的目的片段，表明多基因嵌合體 AV1-AC1-AC3已經(jīng)成功轉(zhuǎn)到番茄中。
[0077] 引物的序列如下所示：
[0078] AV1AC1AC3F ：TCTATCTCATGGCGTGTA
[0079] AV1AC1AC3R ：AGGTAATGCGGATCTACG
[0080] 實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因番茄的TYLCV抗性鑒定
[0081] 3.1農(nóng)桿菌注射接種
[0082] 接種RNAi載體3周后，將含有TYLCV侵染質(zhì)粒的農(nóng)桿菌接種到轉(zhuǎn)基因番茄植株 的新葉上，對(duì)番茄進(jìn)行傳毒，以未轉(zhuǎn)化但傳毒的番茄植株為陽性對(duì)照，同時(shí)留下部分番茄植 株轉(zhuǎn)化空載做為陰性對(duì)照，方法同2. 3。接種5周后，觀察番茄葉片癥狀，結(jié)果如圖3、4、5 所示。由圖3可知，A是未轉(zhuǎn)化但傳毒的番茄植株，從葉片癥狀可以發(fā)現(xiàn)該番茄已經(jīng)嚴(yán)重 感染TYLCV ;由圖4可知，B是轉(zhuǎn)化空載的番茄植株，其葉片癥狀與A相似，說明該番茄也感 染TYLCV ;由圖5可知，C是轉(zhuǎn)化嵌合基因的番茄植株，其葉片生長正常，沒有發(fā)現(xiàn)任何感染 TYLCV的癥狀，說明轉(zhuǎn)化嵌合基因的番茄沒有感染TYLCV。
[0083] 3. 2轉(zhuǎn)基因番茄內(nèi)病毒的檢測
[0084] TYLCV接種5周后使用斑點(diǎn)雜交的方法來檢測番茄葉片中TYLCV的DNA含量。具 體操作步驟如下：
[0085] 剪膜：剪裁兩塊所需大小的尼龍膜（Hybond N+，Amersham Pharmacia, Germany), 用鈍頭鉛筆劃出〇. 5cmX0. 5cm方格圖；點(diǎn)樣：取0. Ig番茄葉片，使用0. 5mL 0. 4M NaOH處 理，取10 μ L處理液點(diǎn)在尼龍膜上，自然晾干；烤膜：將尼龍膜點(diǎn)有樣品的一面朝上，置于分 子雜交爐中于80°C條件下烘烤1?2h ;預(yù)雜交：將烤好的尼龍膜放入雜交袋中，加入已經(jīng) 預(yù)熱至42°C的預(yù)雜交液于搖床上溫和搖動(dòng)30min ;探針準(zhǔn)備：以提取的TYCLV的cDNA為模 板，體外合成以32P為標(biāo)簽的病毒探針，取適當(dāng)體積已標(biāo)記的探針在沸水中變性5min，迅速 置于冰上冷卻5min，加到已預(yù)熱至42°C的雜交液中，溫和充分混勻，避免產(chǎn)生氣泡；換雜交 液：傾去預(yù)雜交液，將尼龍膜放入雜交管中，裝入含探針的雜交液；雜交：置于分子雜交爐 中于42°C條件下溫和搖動(dòng)，保溫過夜；洗膜：將尼龍膜拿出，用洗膜液I洗兩次，每次5min， 于搖床上溫和搖動(dòng)。用預(yù)熱至65°C的洗膜液II在分子雜交爐中于65°C洗膜兩次，每次 15min，溫和搖動(dòng)；漂洗：洗膜后用Washing溶液將膜漂洗1?5min，于搖床上溫和搖動(dòng)；封 閉：將洗后的尼龍膜轉(zhuǎn)移至雜交袋中，用IXBlocking溶液封閉，于搖床上溫和搖動(dòng)30min。
[0086] 抗體作用：將封閉后的尼龍膜轉(zhuǎn)移至雜交袋中，用抗體溶液與膜相互作用，于搖床 上溫和搖動(dòng)30min ;平衡：用適量檢測溶液將膜平衡5min，于搖床上溫和搖動(dòng)；顯色：將封 閉后的尼龍膜轉(zhuǎn)移至新的雜交袋中，加5mL新配顯色液，置于暗處5?IOmin (不可搖動(dòng)）， 幾分鐘后有色素顆粒開始形成，一般16h后完成顯色反應(yīng)；拍照：顯色結(jié)束后以TE終止，用 掃描儀獲取圖像，保存結(jié)果。分析結(jié)果如圖6所示。
[0087] 由圖6可知，1是沒有轉(zhuǎn)化但接種TYLCV的番茄，檢測結(jié)果表明該番茄體內(nèi)含有大 量TYLCV ;3是沒有轉(zhuǎn)化也沒有接種TYLCV的番茄，該番茄中也沒有檢測到TYLCV ;2是轉(zhuǎn)化 嵌合基因的番茄，該番茄中沒有檢測到TYLCV，說明轉(zhuǎn)化了多基因嵌合體AV1-AC1-AC3的轉(zhuǎn) 基因番茄對(duì)TYLCV具有高抗性，從而篩選出高抗TYLCV番茄。
【權(quán)利要求】
1. 一種培育高抗TYLCV番茄的方法，包括如下步驟： 1) 將TYLCV的AVl基因片段、ACl基因片段和AC3基因片段嵌合得到多基因嵌合體 AV1-AC1-AC3,并構(gòu)建反向重復(fù)序列的RNAi載體；其中，AVI、ACl和AC3基因片段的核苷酸 序列分別如SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示，多基因嵌合體AV1-AC1-AC3 的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示； 2) 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將RNAi載體在番茄上瞬時(shí)表達(dá)得到轉(zhuǎn)化多基因嵌合體 AV1-AC1-AC3的轉(zhuǎn)基因番茄； 3) 轉(zhuǎn)基因番茄經(jīng)過TYLCV系統(tǒng)性侵染、鑒定抗病性，獲取對(duì)TYLCV具有抗性的高抗 TYLCV番茄。
2. -種培育高抗TYLCV番茄的方法，包括如下步驟： 1) 以感病番茄中提取的總DNA為模板，利用三對(duì)引物AV1F/AV1R，AC1F/AC1R和AC3F/ AC3R分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增AVl基因片段，ACl基因片段和AC3基因片段，所述AVUACl和AC3 基因片段的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示；引物AVlF/ AV1R，AC1F/AC1R 和 AC3F/AC3R 的序列具體為： AVIF ：CGCGGATCCGAGCTCATTCGTCTTAACAC AVlR ：ATATTTATTAAAATCATAGAAA AClF ：TATTTAAATACTTTAATTTGAA ACIR ： GCTCTAGAGCGGCCGCGATCTGAGTCC AC3F ：TTTCTATGATTTTAATAAATAT AC3R ：TTCAAATTAAAGTATTTAAATA 2) 將PCR產(chǎn)物混合，以引物AVlF和AClR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到多基因嵌合體 AV1-AC1-AC3,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。多基因嵌合體AV1-AC1-AC3與載體 pGEM-T Easy Vector 連接，得到質(zhì)粒 pGEM-T-AVl-ACl-AC3; 3) 使用限制性內(nèi)切酶XbaI和BamHI雙酶切質(zhì)粒pGEM-T-AVl-ACl-AC3和克隆載體 pBluescript II SK(-)-RTMl，將酶切片段和載體進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pBluescript II SK(-)-AVl-ACl-AC3-RTMl ； 4) 使用限制性內(nèi)切酶SacI和NotI雙酶切質(zhì)粒pBluescript II SK㈠-AV1-AC1-AC3-RTM1和質(zhì)粒pGEM-T-AVl-ACl-AC3,將酶切片段和載體進(jìn)行連接，得到 重組質(zhì)粒 pBluescript II SK(-)-AVl-ACl-AC3(i/r); 5) 將構(gòu)建的干擾片段AV1-AC1-AC3從重組質(zhì)粒pBluescript II SK㈠-AV1-AC1-AC3 (i/r)上使用限制性內(nèi)切酶SacI和BamHI雙酶切切下，并連接到植物表 達(dá)載體 PBIN19 上，構(gòu)建 RNAi 載體 pBIN19-AVl-ACl-AC3 (i/r); 6) 通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將RNAi載體pBIN19-AVl-ACl-AC3(i/r)注射到番茄幼苗，再用含 有TYLCV侵染質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染番茄植株，將TYLCV基因組導(dǎo)入番茄植株內(nèi)；通過提取番茄 DNA、斑點(diǎn)雜交檢測TYLCV含量來篩選出對(duì)TYLCV具有抗性的高抗TYLCV番茄。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的培育高抗TYLCV番茄的方法在提高番茄抗TYLCV中的應(yīng) 用。
【文檔編號(hào)】C12N15/84GK104313051SQ201410547125
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月16日
【發(fā)明者】孫勝, 邢國明, 邢曉娟, 亢秀萍, 陳志峰, 李興桃, 許小勇 申請(qǐng)人:山西農(nóng)業(yè)大學(xué)