Noey2基因突變檢測(cè)體系及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種NOEY2基因突變檢測(cè)體系及其試劑盒，包括用于檢測(cè)NOEY25205T>C、5813DELA、6141G>A及6270G>A四個(gè)突變位點(diǎn)的引物序列，還包括可靠性高、獲取簡(jiǎn)便、可規(guī)?；瘧?yīng)用的對(duì)應(yīng)野生型和突變型對(duì)照。本發(fā)明的NOEY2基因突變檢測(cè)體系及其試劑盒揭示了用于檢測(cè)的HRM反應(yīng)體系，可以覆蓋多突變位點(diǎn)檢測(cè)，特異性強(qiáng)，具有快速、準(zhǔn)確、高靈敏度等特點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】N0EY2基因突變檢測(cè)體系及其試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)計(jì)涉及一種基因突變的檢測(cè)產(chǎn)品以及該產(chǎn)品所用到的特異性引物，屬于 生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002] ARHI (Aplysia Ras Homology member I)基因是1999年發(fā)現(xiàn)的母源印記抑癌基 因，又名N0EY2,定位于1ρ31，大約8kb，包括一個(gè)啟動(dòng)子、兩個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子，帶一個(gè) 687bp的蛋白編碼區(qū)編碼一個(gè)26KD的小GTP結(jié)合蛋白，是ras/rap超家族成員之一，與該家 族成員有50-60%的家族同源性，在肝臟、胰腺、腦、膀胱和前列腺等人體多種組織中均有表 達(dá)，在正常卵巢組織中ARHI表達(dá)最高。
[0003] ARHI (N0EY2)相當(dāng)于功能上的單倍體，正常細(xì)胞中母源性ARHI等位基因上發(fā)生 CpG島甲基化修飾，使其轉(zhuǎn)錄活性受到抑制而不表達(dá)，但可依靠父源性ARHI等位基因轉(zhuǎn)錄、 翻譯具有正常功能的ARHI蛋白；還可起到抑制癌細(xì)胞增殖的作用。而一旦父源性等位基因 受損或丟失，相當(dāng)于兩個(gè)抗癌的等位基因序列丟失，從而導(dǎo)致ARHI基因失活，增加了腫瘤 的易感性。諸多研究表明ARHI在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面起重要作 用。研究還顯示在卵巢癌組織中常出現(xiàn)ARHI基因表達(dá)下調(diào)或缺失；ARCHl的表達(dá)缺失也可 能與乳腺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制有關(guān)；ARHI在胰腺癌等組織中也有較高比例的缺失。
[0004] ARHI (N0EY2)基因的失活原因主要有雜合性丟失（loss of heterozygosity)、甲 基化或乙?；惓＜盎蛲蛔儭Ｑ芯匡@示ARHI基因突變與早期癌變相關(guān)。2009年JuLun Yang 等（N0EY2 mutations in primary breast cancers and breast hyperplasia, The breast，2009,18 (3)，197 - 203 )通過(guò)對(duì)50例乳腺癌及相應(yīng)癌旁組織，和50例乳腺良性 病變組織的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后測(cè)序分析N0EY2基因的啟動(dòng)子、外顯子和內(nèi)含子區(qū)域的 突變情況，其蛋白表達(dá)情況通過(guò)免疫組化方法驗(yàn)證；結(jié)果發(fā)現(xiàn)42%的乳腺癌組織發(fā)生N0EY2 基因突變，34%癌旁組織發(fā)生N0EY2基因突變，乳腺良性病變組織N0EY2基因無(wú)突變。多方 面的研究均顯示N0EY2基因的突變檢測(cè)可為早期腫瘤的基因診斷提供借鑒信息。
[0005] 因此，開(kāi)發(fā)一種檢測(cè)N0EY2基因熱點(diǎn)突變的產(chǎn)品，以實(shí)現(xiàn)高靈敏度、低成本、方便 快捷的N0EY2基因突變檢測(cè)是非常有必要的。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種可以覆蓋多突變位點(diǎn)檢測(cè)，且快速、準(zhǔn)確、高 靈敏度的N0EY2基因突變檢測(cè)體系及其試劑盒。
[0007] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題提出的一種技術(shù)方案是：一種N0EY2基因突變檢測(cè)體 系，其特征在于：包括用于檢測(cè)N0EY2 5205T>C突變位點(diǎn)的正向檢測(cè)引物N0EY1F和反向檢 測(cè)引物N0EY1R，用于檢測(cè)N0EY2 5813 DEL A突變位點(diǎn)的正向檢測(cè)引物N0EY2F和反向檢測(cè) 引物N0EY2R，用于檢測(cè)N0EY2 6141G>A突變位點(diǎn)的正向檢測(cè)引物N0EY3F和反向檢測(cè)引物 N0EY34R，以及用于檢測(cè)N0EY2 6270G>A突變位點(diǎn)的正向檢測(cè)引物N0EY4F和反向檢測(cè)引物 N0EY34R ； 所述NOEYlF的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示； 所述NOEYlR的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示； 所述N0EY2F的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示； 所述N0EY2R的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示； 所述N0EY3F的核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示； 所述N0EY34R的核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示； 所述N0EY4F的核苷酸序列如SEQ ID No. 7所示。
[0008] 上述技術(shù)方案的一種優(yōu)選是：上述N0EY2基因突變檢測(cè)體系還包括陰性對(duì)照和陽(yáng) 性對(duì)照； 所述陰性對(duì)照分別是針對(duì)檢測(cè)N0EY2 5205T>C突變位點(diǎn)的野生型對(duì)照一、針對(duì)檢測(cè) N0EY2 5813 DEL A突變位點(diǎn)的野生型對(duì)照二、針對(duì)檢測(cè)N0EY2 6141G>A突變位點(diǎn)的野生型 對(duì)照三和針對(duì)檢測(cè)N0EY2 6270G>A突變位點(diǎn)的野生型對(duì)照四； 所述陽(yáng)性對(duì)照分別是針對(duì)檢測(cè)N0EY2 5205T>C突變位點(diǎn)的突變型對(duì)照一、針對(duì)檢測(cè) N0EY2 5813 DEL A突變位點(diǎn)的突變型對(duì)照二、針對(duì)檢測(cè)N0EY2 6141G>A突變位點(diǎn)的突變型 對(duì)照三和針對(duì)檢測(cè)N0EY2 6270G>A突變位點(diǎn)的突變型對(duì)照四。
[0009] 上述技術(shù)方案的一種優(yōu)選是：上述野生型對(duì)照一是以未突變基因組為模板，以 N0EY1F和N0EY1R為引物進(jìn)行擴(kuò)增，而獲得的產(chǎn)物； 所述野生型對(duì)照二是以未突變基因組為模板，以N0EY2F和N0EY2R為引物進(jìn)行擴(kuò)增，而 獲得的產(chǎn)物； 所述野生型對(duì)照三是以未突變基因組為模板，以N0EY3F和N0EY34R為引物進(jìn)行擴(kuò)增， 而獲得的產(chǎn)物； 所述野生型對(duì)照四是以未突變基因組為模板，以N0EY4F和N0EY34R為引物進(jìn)行擴(kuò)增， 而獲得的產(chǎn)物。
[0010] 上述技術(shù)方案的一種優(yōu)選是：上述突變型對(duì)照一是以含N0EY2 5205T>C突變位點(diǎn) 的基因組為模板，以N0EY1F和N0EY1MR為引物，以N0EY1MF和N0EY1R為引物，分兩組進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，再將獲得的兩組產(chǎn)物等量混合，以N0EY1F和N0EY1R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將獲 得的產(chǎn)物，按體積比與野生型對(duì)照一進(jìn)行混合，而獲得的混合物； 所述突變型對(duì)照二是以含N0EY2 5813 DEL A突變位點(diǎn)的基因組為模板，以N0EY2F和 N0EY2MR為引物，以N0EY2MF和N0EY2R為引物，分兩組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將獲得的兩組產(chǎn)物 等量混合，以N0EY2F和N0EY2R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將獲得的產(chǎn)物，按體積比與野生型 對(duì)照二進(jìn)行混合，而獲得的混合物； 所述突變型對(duì)照三是以含N0EY2 6141G>A突變位點(diǎn)的基因組為模板，以N0EY3F和 N0EY3MR為引物，以及N0EY3MF和N0EY34R為引物，分兩組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將獲得的兩組產(chǎn) 物等量混合，以N0EY3F和N0EY34R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將獲得的產(chǎn)物，按體積比與野生 型對(duì)照三進(jìn)行混合，而獲得的混合物； 所述突變型對(duì)照四是以含N0EY2 6270G>A突變位點(diǎn)的基因組為模板，以N0EY4F和 N0EY4MR為引物，以及N0EY4MF和N0EY34R為引物，分兩組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將獲得的兩組產(chǎn) 物等量混合，以N0EY4F和N0EY34R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將獲得的產(chǎn)物，按體積比與野生 型對(duì)照四進(jìn)行混合，而獲得的混合物； 所述體積比的比值是1 : 9、1 : 99或1 : 999; 所述N0EY1MF是覆蓋N0EY2 5205T>C突變點(diǎn)堿基的正向檢測(cè)引物，所述N0EY1MR是覆 蓋N0EY2 5205T>C突變點(diǎn)堿基的反向檢測(cè)引物； 所述N0EY2MF是覆蓋N0EY2 5813 DEL A突變點(diǎn)堿基的正向檢測(cè)引物，所述N0EY2MR是 覆蓋N0EY2 5813 DEL A突變點(diǎn)堿基的反向檢測(cè)引物； 所述N0EY3MF是覆蓋N0EY2 6141G>A突變點(diǎn)堿基的正向檢測(cè)引物，所述N0EY3MR是覆 蓋N0EY2 6141G>A突變點(diǎn)堿基的反向檢測(cè)引物； 所述N0EY4MF是覆蓋N0EY2 6270G>A突變點(diǎn)堿基的正向檢測(cè)引物，所述N0EY4MR是覆 蓋N0EY2 6270G>A突變點(diǎn)堿基的反向檢測(cè)引物。
[0011] 上述技術(shù)方案的一種優(yōu)選是：上述突變型對(duì)照一是以含N0EY2 5205T>C未突變位 點(diǎn)的基因組為模板，以NOEYlF和N0EY1MR為引物，以N0EY1MF和NOEYlR為引物，分兩組進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，再將獲得的兩組產(chǎn)物等量混合，以NOEYlF和NOEYlR為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再 將獲得的產(chǎn)物，按體積比與野生型對(duì)照一進(jìn)行混合，而獲得的混合物； 所述突變型對(duì)照二是以含N0EY2 5813 DEL A未突變位點(diǎn)的基因組為模板，分別以 N0EY2F和N0EY2MR為引物，以N0EY2MF和N0EY2R為引物，分兩組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將獲得的 兩組產(chǎn)物等量混合，以N0EY2F和N0EY2R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將獲得的產(chǎn)物，按體積比 與野生型對(duì)照二進(jìn)行混合，而獲得的混合物； 所述突變型對(duì)照三是以含N0EY2 6141G>A未突變位點(diǎn)的基因組為模板，分別以N0EY3F 和N0EY3MR為引物，以N0EY3MF和N0EY34R為引物，分兩組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將獲得的兩組 產(chǎn)物等量混合，以N0EY3F和N0EY34R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將獲得的產(chǎn)物，按體積比與野 生型對(duì)照三進(jìn)行混合，而獲得的混合物； 所述突變型對(duì)照四是以含N0EY2 6270G>A未突變位點(diǎn)的基因組為模板，以N0EY4F和 N0EY4MR為引物，以及N0EY4MF和N0EY34R為引物，分兩組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將獲得的兩組產(chǎn) 物等量混合，以N0EY4F和N0EY34R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將獲得的產(chǎn)物，按體積比與野生 型對(duì)照四進(jìn)行混合，而獲得的混合物； 所述體積比的比值是1 : 9、1 : 99或1 : 999; 所述N0EY1MF是覆蓋N0EY2 5205T>C突變點(diǎn)堿基的正向檢測(cè)引物，所述N0EY1MR是覆 蓋N0EY2 5205T>C突變點(diǎn)的堿基的反向檢測(cè)引物； 所述N0EY2MF是覆蓋N0EY2 5813 DEL A突變點(diǎn)堿基的正向檢測(cè)引物，所述N0EY2MR是 覆蓋N0EY2 5813 DEL A突變點(diǎn)堿基的反向檢測(cè)引物； 所述N0EY3MF是覆蓋N0EY2 6141G>A突變點(diǎn)堿基的正向檢測(cè)引物，所述N0EY3MR是覆 蓋N0EY2 6141G>A突變點(diǎn)堿基的反向檢測(cè)引物； 所述N0EY4MF是覆蓋N0EY2 6270G>A突變點(diǎn)堿基的正向檢測(cè)引物，所述N0EY4MR是覆 蓋N0EY2 6270G>A突變點(diǎn)堿基的反向檢測(cè)引物 上述技術(shù)方案的一種優(yōu)選是：上述N0EY1MF的核苷酸序列如SEQ ID No. 8所示； 所述N0EY1MR的核苷酸序列如SEQ ID No. 9所示； 所述N0EY2MF的核苷酸序列如SEQ ID No. 10所示； 所述N0EY2MR的核苷酸序列如SEQ ID No. 11所示； 所述N0EY3MF的核苷酸序列如SEQ ID No. 12所示； 所述N0EY3MR的核苷酸序列如SEQ ID No. 13所示； 所述N0EY4MF的核苷酸序列如SEQ ID No. 14所示； 所述N0EY4MR的核苷酸序列如SEQ ID No. 15所示。
[0012] 上述技術(shù)方案的一種優(yōu)選是：上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)稀釋后最優(yōu)濃度為25?30ng/ μ?〇
[0013] 上述技術(shù)方案的一種優(yōu)選是：上述Ν0ΕΥ2基因突變檢測(cè)體系，其特征在于：還包括 PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液由HRM Master Mix和MgCl2配置而成。
[0014] 為了保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和靈敏度，上述技術(shù)方案的一種優(yōu)選是：上 述體系的體積為ιομ?; 所述用于檢測(cè)Ν0ΕΥ2 5205T>C突變位點(diǎn)的體系中的各組分及其用量是25mM的MgCl2為 L 2μ1，1〇μΜ 的 N0EY1F 為 0· 2μ1，1〇μΜ 的 N0EY1R 為 0· 2μ1，模板 DNA 為 5 ?10ng，HRM Master Mix為5μ1，其余是純水； 所述用于檢測(cè)Ν0ΕΥ2 5813 DEL A突變位點(diǎn)的體系中的各組分及其用量是25mM的 MgCl2 為 L 2μ1，1〇μΜ 的 N0EY2F 為 0· 2μ1，1〇μΜ 的 N0EY2R 為 0· 2μ1，模板 DNA 為 5 ?IOng, HRM Master Mix為5μ1，其余是純水； 所述用于檢測(cè)Ν0ΕΥ2 6141G>A突變位點(diǎn)的體系中的各組分及其用量是25mM的MgCl2 為 L 2μ1，1〇μΜ 的 N0EY3F 為 0· 2μ1，1〇μΜ 的 N0EY34R 為 0· 2μ1，模板 DNA 為 5 ?10ng，HRM Master Mix為5μ1，其余是純水； 所述用于檢測(cè)Ν0ΕΥ2 6270G>A突變位點(diǎn)的體系中的各組分及其用量是25mM的MgCl2 為 L 2μ1，1〇μΜ 的 N0EY4F 為 0· 2μ1，1〇μΜ 的 N0EY34R 為 0· 2μ1，模板 DNA 為 5 ?10ng，HRM Master Mix為5μ1，其余是純水； 所述模板DNA是樣品、陽(yáng)性對(duì)照或陰性對(duì)照。
[0015] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題提出的另一種技術(shù)方案是：一種采用上述檢測(cè)體系的 Ν0ΕΥ2基因突變檢測(cè)試劑盒。
[0016] 本發(fā)明具有積極的效果： (1)本發(fā)明的Ν0ΕΥ2基因突變檢測(cè)體系及其試劑盒利用高分辨率熔解曲線法（HRM法)， 采用特異引物組合，制備了可靠性高，獲取簡(jiǎn)便，適于規(guī)模化應(yīng)用的野生型對(duì)照及突變型對(duì) 照作為陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，能檢出〇. 1%的突變，極大地提高了檢出率。采用本發(fā)明的 Ν0ΕΥ2基因突變檢測(cè)體系及其試劑盒，檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)測(cè)序結(jié)果的符合度為100%，靈敏度 更高。
[0017] (2)本發(fā)明的Ν0ΕΥ2基因突變檢測(cè)體系及其試劑盒，檢測(cè)過(guò)程閉管操作，檢測(cè)時(shí)間 在1小時(shí)以內(nèi)，方便快捷，且通量更高。
[0018] (3)本發(fā)明的Ν0ΕΥ2基因突變檢測(cè)體系及其試劑盒能覆蓋檢測(cè)四種Ν0ΕΥ2基因的 熱點(diǎn)突變，采用特異的引物組合及合適的Mg 2+濃度，使得檢測(cè)結(jié)果無(wú)雜峰，具有高特異性。
[0019] (4)本發(fā)明的N0EY2基因突變檢測(cè)體系及其試劑盒成本極低，每樣品檢測(cè)試劑耗 材成本控制在人民幣8元左右。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1是以陰性對(duì)照為基線，以NOEYlF和NOEYlR為引物檢測(cè)樣本1的N0EY2 5205T>C突變位點(diǎn)的差異視圖。
[0021] 圖2是以陰性對(duì)照為基線，以N0EY2F和N0EY2R為引物檢測(cè)10%、1%及0. 1%的突 變對(duì)照二的差異視圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，有必要在此指出的是以下實(shí)施例只用 于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)人員可 以根據(jù)上述本
【發(fā)明內(nèi)容】
對(duì)本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。下述實(shí)施例中，若非特意 表明，所用的試劑均為分析純，所用試劑均可從商業(yè)渠道獲得。文中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn) 方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著的科學(xué)出版社2002年出版的《分子克隆實(shí) 驗(yàn)指南》一書(shū)中所述的條件，或按照制造商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所 有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或 均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。 實(shí)施例
[0023] 一、試劑盒的組成。
[0024] 本實(shí)施例的N0EY2基因突變檢測(cè)試劑盒包括PCR反應(yīng)液、引物混合液、突變型對(duì)照 液(陽(yáng)性對(duì)照液)和野生型對(duì)照液(陰性對(duì)照液)。PCR反應(yīng)液、引物混合液、突變型對(duì)照液和 野生型對(duì)照液分別置于不同的試管中，如表1所示。
[0025] 表1試劑盒組成表
【權(quán)利要求】
1. 一種N0EY2基因突變檢測(cè)體系，其特征在于：包括用于檢測(cè)N0EY2 5205T>C突變位 點(diǎn)的正向檢測(cè)引物N0EY1F和反向檢測(cè)引物N0EY1R，用于檢測(cè)N0EY2 5813 DEL A突變位點(diǎn) 的正向檢測(cè)引物N0EY2F和反向檢測(cè)引物N0EY2R，用于檢測(cè)N0EY2 6141G>A突變位點(diǎn)的正 向檢測(cè)引物N0EY3F和反向檢測(cè)引物N0EY34R，以及用于檢測(cè)N0EY2 6270G>A突變位點(diǎn)的正 向檢測(cè)引物N0EY4F和反向檢測(cè)引物N0EY34R ; 所述N0EY1F的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示； 所述N0EY1R的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示； 所述N0EY2F的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示； 所述N0EY2R的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示； 所述N0EY3F的核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示； 所述N0EY34R的核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示； 所述N0EY4F的核苷酸序列如SEQ ID No. 7所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的N0EY2基因突變檢測(cè)體系，其特征在于：還包括陰性對(duì)照和 陽(yáng)性對(duì)照； 所述陰性對(duì)照分別是針對(duì)檢測(cè)N0EY2 5205T>C突變位點(diǎn)的野生型對(duì)照一、針對(duì)檢測(cè) N0EY2 5813 DEL A突變位點(diǎn)的野生型對(duì)照二、針對(duì)檢測(cè)N0EY2 6141G>A突變位點(diǎn)的野生型 對(duì)照三和針對(duì)檢測(cè)N0EY2 6270G>A突變位點(diǎn)的野生型對(duì)照四； 所述陽(yáng)性對(duì)照分別是針對(duì)檢測(cè)N0EY2 5205T>C突變位點(diǎn)的突變型對(duì)照一、針對(duì)檢測(cè) N0EY2 5813 DEL A突變位點(diǎn)的突變型對(duì)照二、針對(duì)檢測(cè)N0EY2 6141G>A突變位點(diǎn)的突變型 對(duì)照三和針對(duì)檢測(cè)N0EY2 6270G>A突變位點(diǎn)的突變型對(duì)照四。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的N0EY2基因突變檢測(cè)體系，其特征在于： 所述野生型對(duì)照一是以未突變基因組為模板，以N0EY1F和N0EY1R為引物進(jìn)行擴(kuò)增，而 獲得的產(chǎn)物； 所述野生型對(duì)照二是以未突變基因組為模板，以N0EY2F和N0EY2R為引物進(jìn)行擴(kuò)增，而 獲得的產(chǎn)物； 所述野生型對(duì)照三是以未突變基因組為模板，以N0EY3F和N0EY34R為引物進(jìn)行擴(kuò)增， 而獲得的產(chǎn)物； 所述野生型對(duì)照四是以未突變基因組為模板，以N0EY4F和N0EY34R為引物進(jìn)行擴(kuò)增， 而獲得的產(chǎn)物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的N0EY2基因突變檢測(cè)體系，其特征在于：所述突變型對(duì)照一 是以含N0EY2 5205T>C突變位點(diǎn)的基因組為模板，以N0EY1F和N0EY1MR為引物，以N0EY1MF 和N0EY1R為引物，分兩組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將獲得的兩組產(chǎn)物等量混合，以N0EY1F和 N0EY1R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將獲得的產(chǎn)物，按體積比與野生型對(duì)照一進(jìn)行混合，而獲得 的混合物； 所述突變型對(duì)照二是以含N0EY2 5813 DEL A突變位點(diǎn)的基因組為模板，以N0EY2F和 N0EY2MR為引物，以N0EY2MF和N0EY2R為引物，分兩組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將獲得的兩組產(chǎn)物 等量混合，以N0EY2F和N0EY2R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將獲得的產(chǎn)物，按體積比與野生型 對(duì)照二進(jìn)行混合，而獲得的混合物； 所述突變型對(duì)照三是以含N0EY2 6141G>A突變位點(diǎn)的基因組為模板，以N0EY3F和 N0EY3MR為引物，以及N0EY3MF和N0EY34R為引物，分兩組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將獲得的兩組產(chǎn) 物等量混合，以N0EY3F和N0EY34R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將獲得的產(chǎn)物，按體積比與野生 型對(duì)照三進(jìn)行混合，而獲得的混合物； 所述突變型對(duì)照四是以含N0EY2 6270G>A突變位點(diǎn)的基因組為模板，以N0EY4F和 N0EY4MR為引物，以及N0EY4MF和N0EY34R為引物，分兩組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將獲得的兩組產(chǎn) 物等量混合，以N0EY4F和N0EY34R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將獲得的產(chǎn)物，按體積比與野生 型對(duì)照四進(jìn)行混合，而獲得的混合物； 所述體積比的比值是1 : 9、1 : 99或1 : 999; 所述N0EY1MF是覆蓋N0EY2 5205T>C突變點(diǎn)堿基的正向檢測(cè)引物，所述N0EY1MR是覆 蓋N0EY2 5205T>C突變點(diǎn)堿基的反向檢測(cè)引物； 所述N0EY2MF是覆蓋N0EY2 5813 DEL A突變點(diǎn)堿基的正向檢測(cè)引物，所述N0EY2MR是 覆蓋N0EY2 5813 DEL A突變點(diǎn)堿基的反向檢測(cè)引物； 所述N0EY3MF是覆蓋N0EY2 6141G>A突變點(diǎn)堿基的正向檢測(cè)引物，所述N0EY3MR是覆 蓋N0EY2 6141G>A突變點(diǎn)堿基的反向檢測(cè)引物； 所述N0EY4MF是覆蓋N0EY2 6270G>A突變點(diǎn)堿基的正向檢測(cè)引物，所述N0EY4MR是覆 蓋N0EY2 6270G>A突變點(diǎn)堿基的反向檢測(cè)引物。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的N0EY2基因突變檢測(cè)體系，其特征在于：所述突變型對(duì)照 一是以含N0EY2 5205T>C未突變位點(diǎn)的基因組為模板，以N0EY1F和N0EY1MR為引物，以 N0EY1MF和N0EY1R為引物，分兩組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將獲得的兩組產(chǎn)物等量混合，以N0EY1F 和N0EY1R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將獲得的產(chǎn)物，按體積比與野生型對(duì)照一進(jìn)行混合，而獲 得的混合物； 所述突變型對(duì)照二是以含N0EY2 5813 DEL A未突變位點(diǎn)的基因組為模板，分別以 N0EY2F和N0EY2MR為引物，以N0EY2MF和N0EY2R為引物，分兩組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將獲得的 兩組產(chǎn)物等量混合，以N0EY2F和N0EY2R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將獲得的產(chǎn)物，按體積比 與野生型對(duì)照二進(jìn)行混合，而獲得的混合物； 所述突變型對(duì)照三是以含N0EY2 6141G>A未突變位點(diǎn)的基因組為模板，分別以N0EY3F 和N0EY3MR為引物，以N0EY3MF和N0EY34R為引物，分兩組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將獲得的兩組 產(chǎn)物等量混合，以N0EY3F和N0EY34R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將獲得的產(chǎn)物，按體積比與野 生型對(duì)照三進(jìn)行混合，而獲得的混合物； 所述突變型對(duì)照四是以含N0EY2 6270G>A未突變位點(diǎn)的基因組為模板，以N0EY4F和 N0EY4MR為引物，以及N0EY4MF和N0EY34R為引物，分兩組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將獲得的兩組產(chǎn) 物等量混合，以N0EY4F和N0EY34R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將獲得的產(chǎn)物，按體積比與野生 型對(duì)照四進(jìn)行混合，而獲得的混合物； 所述體積比的比值是1 : 9、1 : 99或1 : 999; 所述N0EY1MF是覆蓋N0EY2 5205T>C突變點(diǎn)堿基的正向檢測(cè)引物，所述N0EY1MR是覆 蓋N0EY2 5205T>C突變點(diǎn)的堿基的反向檢測(cè)引物； 所述N0EY2MF是覆蓋N0EY2 5813 DEL A突變點(diǎn)堿基的正向檢測(cè)引物，所述N0EY2MR是 覆蓋N0EY2 5813 DEL A突變點(diǎn)堿基的反向檢測(cè)引物； 所述N0EY3MF是覆蓋N0EY2 6141G>A突變點(diǎn)堿基的正向檢測(cè)引物，所述N0EY3MR是覆 蓋N0EY2 6141G>A突變點(diǎn)堿基的反向檢測(cè)引物； 所述N0EY4MF是覆蓋N0EY2 6270G>A突變點(diǎn)堿基的正向檢測(cè)引物，所述N0EY4MR是覆 蓋N0EY2 6270G>A突變點(diǎn)堿基的反向檢測(cè)引物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的N0EY2基因突變檢測(cè)體系，其特征在于：所述N0EY1MF的 核苷酸序列如SEQ ID No. 8所示； 所述N0EY1MR的核苷酸序列如SEQ ID No. 9所示； 所述N0EY2MF的核苷酸序列如SEQ ID No. 10所示； 所述N0EY2MR的核苷酸序列如SEQ ID No. 11所示； 所述N0EY3MF的核苷酸序列如SEQ ID No. 12所示； 所述N0EY3MR的核苷酸序列如SEQ ID No. 13所示； 所述N0EY4MF的核苷酸序列如SEQ ID No. 14所示； 所述N0EY4MR的核苷酸序列如SEQ ID No. 15所示。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3至5之一所述的N0EY2基因突變檢測(cè)體系，其特征在于：所述PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物經(jīng)稀釋濃度達(dá)到25?30ng/W。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的N0EY2基因突變檢測(cè)體系，其特征在于：還包括PCR反 應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液由HRM Master Mix和MgCl2配置而成。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的N0EY2基因突變檢測(cè)體系，其特征在于：所述體系的體積為 iom ； 所述用于檢測(cè)N0EY2 5205T>C突變位點(diǎn)的體系中的各組分及其用量是25mM的MgCl2為 1. 2Pl，10剛的 N0EY1F 為 0? 2Pl，10剛的 N0EY1R 為 0? 2W，模板 DNA 為 5 ?10ng，HRM Master Mix為5W，其余是純水； 所述用于檢測(cè)N0EY2 5813 DEL A突變位點(diǎn)的體系中的各組分及其用量是25mM的 MgCl2 為 1. 2W，10剛的 N0EY2F 為 0? 2W，10剛的 N0EY2R 為 0? 2W，模板 DNA 為 5 ?10ng， HRM Master Mix為5W，其余是純水； 所述用于檢測(cè)N0EY2 6141G>A突變位點(diǎn)的體系中的各組分及其用量是25mM的MgCl2為 1. 2W，10剛的 N0EY3F 為 0? 2W，10剛的 N0EY34R 為 0? 2W，模板 DNA 為 5 ?10ng，HRM Master Mix為5Ml，其余是純水； 所述用于檢測(cè)N0EY2 6270G>A突變位點(diǎn)的體系中的各組分及其用量是25mM的MgCl2為 1. 2W，10剛的 N0EY4F 為 0? 2W，10剛的 N0EY34R 為 0? 2W，模板 DNA 為 5 ?10ng，HRM Master Mix為5Ml，其余是純水； 所述模板DNA是樣品、陽(yáng)性對(duì)照或陰性對(duì)照。
10. -種采用如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)體系的N0EY2基因突變檢測(cè)試劑盒。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104388540SQ201410542659
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月15日
【發(fā)明者】王明 申請(qǐng)人:上海賽安生物醫(yī)藥科技有限公司