一種基于TALEN 介導的Sp110 巨噬細胞特異打靶載體及重組細胞的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種基于TALEN介導的Sp110巨噬細胞特異打靶載體及重組細胞，對牛胎兒成纖維細胞進行基因打靶獲得的M-S位點定點敲入Sp110基因的牛胎兒成纖維細胞。利用打靶載體中的MSR1啟動子，使得定點敲入的Sp110在且僅在牛的外周血巨噬細胞中正常轉錄和表達。本發明利用電穿孔的方法將打靶載體和TALEN位點特異性核酸切割酶表達載體共轉染牛胎兒成纖維細胞，通過PCR和Southern Blotting篩選和驗證獲得了打靶的陽性克隆細胞。以該陽性克隆細胞為核供體移入牛去核卵母細胞，獲得轉基因克隆胚胎。將轉基因克隆胚胎移植到發情的受體牛子宮中，最終生產成活的轉基因克隆牛。
【專利說明】-種基于TALEN介導的Sp110巨噬細胞特異打靶載體及 重組細胞
【技術領域】
[0001] 本發明屬于轉基因克隆動物【技術領域】，涉及一種基于TALEN介導的SpllO巨噬細 胞特異打祀載體及重組細胞。
【背景技術】
[0002] 牛結核病是由牛分支桿菌（Mycobacterium bovis, M. bovis)和結核分支桿菌 (Mycobacterium tuberculosis, MTB)等結核分支桿菌復合群引起的一種慢性消耗性傳染 疾病，其主要表現為牛生產力明顯下降、乳房炎和結核性胸膜炎等癥狀。牛結核的傳播和流 行嚴重影響了地區農業經濟的發展，特別是對動物及動物產品的國際貿易有著重大的影響 (Biet et al.，2005)。
[0003] SPllO核體蛋白基因 （SPllOnuclear body protein)是新近發現的介導結核分枝 桿菌天然免疫的一個基因，該基因能夠限制結核分枝桿菌在巨噬細胞內的繁殖，并且能調 節巨噬細胞的死亡方式（Behar，2011)。SPllO基因的發現為預防牛結核病的流行和傳播提 供了一種新思路。
[0004] TALEN(Transcription Activator-Like Effector nucleases)是由植物致病細 菌Xanthomonas分泌的一類具有轉錄激活功能的蛋白。由于TALE的DNA結合域中的重復 氨基酸序列模塊可以與單堿基發生特異性結合，因此理論上可以任意選擇靶DNA序列進行 改造，是一種非常有效的基因組改造工具酶。TALENs由于具有一些比鋅指核酸酶（ZFNs)更 優越的特點，現在成為了科研人員用于研究基因功能和潛在基因治療應用的重要工具。應 用TALEN介導的基因組修飾已成功應用于多種模式動物，如果蠅、斑馬魚、小鼠、大鼠等。
[0005] 轉基因動物在家畜品種改良方面具有巨大的應用潛力。在實際生產中，轉基因 技術可以改善動物肉質，提高增長率、飼料利用率，改善乳質及其成分，改良繁殖性能等 (Niemann et al.，2005)。通過轉基因技術，提高動物自身對結核分支桿菌的抵抗力將是今 后控制牛結核病的重要思路。
【發明內容】
[0006] 本發明解決的問題在于提供一種基于TALEN介導的SpllO巨噬細胞特異打靶載體 及重組細胞，在牛28號染色體M-S位點定點整合SPllO基因構建牛胎兒成纖維細胞系，以 該細胞系作為核供體細胞，為研制抗結核病的轉基因牛提供堅實的基礎。
[0007] 本發明是通過以下技術方案來實現：
[0008] -種基于TALEN介導的SpllO巨噬細胞特異打靶載體，包括TALEN真核表達載體 和打靶載體；
[0009] 所述的TALEN真核表達載體包括TALEN左臂表達載體和TALEN右臂臂表達載體， 分別識別TALEN靶點的上游和下游識別位點，TALEN靶點位于牛基因組28號染色體SFTPAl 和MATlA基因的基因間序列；
[0010] 所述的打靶載體上克隆有重組基因 MSRl-SpllO-PolyA，并克隆有作為同源臂的 TALEN靶點上游和下游的同源序列；
[0011] 所述的重組基因 MSRl-SplIO-PolyA是在SpllO基因的上游連接牛巨噬細胞特異 性啟動子MSR1，在下游連接PolyA。
[0012] 所述的TALEN左臂表達載體上克隆有TALEN左臂，其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1 所示；
[0013] 所述的TALEN右臂表達載體上克隆有TALEN右臂，其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2 所示。
[0014] 所述還在TALEN左臂/TALEN右臂的下游連接T2A間隔、熒光標簽GFP和mCherry。
[0015] 所述的重組基因 MSRl-SPlIO-PloyA中，SPl 10的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示， MSRl的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示。
[0016] 所述的同源臂包括分別位于重組基因 MSRl-SPllO-PloyA上游、下游的上游同源 臂和下游同源臂，上游同源臂與MSRl-SPllO-PloyA之間還設有一對同向的Loxp，Loxp之 間設有第一篩選基因，下游同源臂的下游還設有第二篩選基因。
[0017] 所述上游同源臂的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 5所示，下游同源臂的核苷酸序列如 SEQ. ID. NO. 6 所示。
[0018] 所述的TALEN真核表達載體為pCS2-TALEN，其TALEN左臂表達載體和TALEN右臂 表達載體，分別通過在pCS2-Fok I載體上連接TALEN左臂、TALEN右臂而構建；
[0019] 所述的打靶載體為pLR-SP110-Neo,是將MSRl-SPllO-PloyA插入到打靶骨架載體 pCS2-Neo的第二Loxp的下游，將上游同源臂連接在第一 Loxp的上游，將下游同源臂連接在 MSRl-SPllO-PloyA的下游而構建。
[0020] 一種基于所述的TALEN介導的SpllO巨噬細胞特異打靶載體構建的重組細胞，以 牛胎兒成纖維細胞為宿主細胞，通過TALEN真核表達載體和打靶載體共同轉染到宿主細胞 中，將目的基因 SpllO整合到宿主細胞的基因組的28號染色體M-S位點。
[0021] 所述的共同轉染是將TALEN真核表達載體和打靶載體共同電轉到宿主細胞中，電 轉染參數設置如下：電壓：510V ;脈沖時間：3ms ;電擊次數1次。
[0022] 所述的TALEN介導的SpllO巨噬細胞特異打靶載體構建的重組細胞作為核移植構 建轉基因克隆胚的核供體細胞的應用。
[0023] 與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果：
[0024] 本發明提供的基于TALEN介導的SpllO巨噬細胞特異打靶載體及重組細胞，是通 過TALEN進行介導、定點打靶、特異啟動子啟動、目的基因 SpllO表達與膠原樣凝集素家族 的成員協調作用來進行細胞的重組，進而構建抗結核病的轉基因牛。
[0025] 本發明構建的TALEN介導中，TALEN靶點位于牛基因組28號染色體SFTPA1和 MATlA基因的基因間序列。該位點附近的SFTPD，MBLl和SFTPAl均屬于膠原樣凝集素家族 的成員，且在巨噬細胞表面存在受體，可以識別結合并介導結核桿菌進入巨噬細胞，促進巨 噬細胞的吞噬和殺傷能力。在TALEN識別、切割后產生雙鏈斷裂，啟動DNA雙鏈斷裂修復， 同時引入同源臂載體，利用DNA雙鏈斷裂引發的DNA重組修復過程，使組裝的目的DNA序列 特異的插入該區域。
[0026] 在TALEN的介導下，通過基因打靶技術使SpllO基因定點整合到牛28號染色體 M-S位點（牛28號染色體ΜΑΤΙΑ和SFTPAl基因間序列）。該位點附近的SFTPD，MBLl和 SFTPAl均屬于膠原樣凝集素家族的成員，且在巨噬細胞表面存在受體，可以識別結合并介 導結核桿菌進入巨噬細胞，促進巨噬細胞的吞噬和殺傷能力。將SPllO插入到該區域，使其 有可能協同作用于巨噬細胞，進一步提高巨噬細胞抗結核感染的能力。
[0027] 進一步的，本發明通過基因打靶技術使SpllO基因定點整合到牛28號染色體M-S 位點。由于該位點附近基因簇的功能對于巨噬細胞非常重要，因此可以確定該段染色質在 巨噬細胞中處于活化狀態。將SPllO插入到該區域，可以避免插入的外源基因由于異染色 質化而失活。
[0028] 本發明構建的巨噬細胞特異性打靶載體，目的基因 SpllO是由巨噬細胞清道夫受 體1啟動子啟動轉錄。這樣可以使得目的基因 SpllO在且僅在牛的外周血巨噬細胞中正常 轉錄和表達。這樣可以提高轉基因動物的安全性。
[0029] 本發明通過共轉染打靶載體pLR-SPllO-Neo和對應的TALEN位點特異性核酸切割 酶表達載體，構建轉基因的牛胎兒成纖維細胞系。經G418篩選獲得陽性克隆細胞，并進行 PCR和Southern Blotting鑒定證實目的基因 SPllO定點整合到牛胎兒成纖維細胞基因組 M-S位點。以包含目的基因 SPllO的牛胎兒成纖維細胞作為核移植構建轉基因克隆牛的核 供體細胞，通過SCNT獲得轉基因克隆牛，該克隆牛能夠檢測到SPllO基因的表達，而且侵 染、感染結果表明對牛分支桿菌具有一定的抗性，為預防牛結核打下了堅實的基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0030] 圖1-1是TALEN模塊組裝方法的示意圖；
[0031] 圖1-2是TALEN表達載體的構建示意圖。
[0032] 圖2是TALEN真核表達載體的圖譜。
[0033] 圖3是Surveyor nuclease assay對TALEN切割活性檢測結果圖。
[0034] 圖4是打靶載體pLR-SPIlO-Neo的圖譜。
[0035] 圖5是打靶載體pLR-SPllO-Neo經NotI酶切線性化的瓊脂糖凝膠電泳檢測圖。M 為 DNA marker，泳道 1 為 NotI 酶切線性化的 pLR-SP110-Neo,泳道 2 為 pLR-SPllO-Neo
[0036] 圖6是打靶載體pSPlIO-Neo經Sail和NheI雙酶切鑒定的瓊脂糖凝膠電泳檢測 圖。M 為 DNA marker，泳道 1 為 Sail 和 NheI 雙酶切的 pLR-SPlIO-Neo。
[0037] 圖7是轉染打靶載體pLR-SPllO-Neo的牛胎兒成纖維細胞經G418篩選出來的單 細胞克隆圖。
[0038] 圖8是陽性單克隆細胞鑒定示意圖。
[0039] 圖9a?圖9c是一些具有代表性的單克隆細胞的junction PCR鑒定結果圖，其中 圖 9a 是 3' -junction 結果圖，圖 9b 是 5' -junction 結果圖，圖 9c 是 long range PCR 結 果圖。
[0040] 圖IOa?圖IOb是對經PCR驗證為發生了 SPllO基因定點整合的9個單克隆細胞 進行Southern bloting驗證的結果圖。
[0041] 圖11是利用基因打靶的陽性克隆細胞制備的轉基因克隆胚胎。
[0042] 圖12是利用基因打靶的陽性克隆細胞制備的轉基因克隆牛。
【具體實施方式】
[0043] 本發明首先構建了含有3?110基因的巨噬細胞特異性打靶載體？1^-5?110-他〇， 然后用電穿孔法將打靶載體pLR-SPlIO-Neo和對應的TALEN位點特異性核酸切割酶表達 載體共轉染到牛胎兒成纖維細胞，經G418篩選獲得陽性克隆細胞，并進行PCR和Southern Blotting鑒定證實目的基因 SPllO定點整合到牛胎兒成纖維細胞基因組M-S位點（牛28 號染色體MATlA和SFTPAl基因間序列）。最后，將確認整合的陽性克隆細胞做為核供體細 胞移入牛去核卵母細胞，獲得抗結核病的轉基因克隆牛。
[0044] 具體所涉及的試劑和材料如下：胎牛血清、G418、DMEM、DMEM/F12、Opti-MEM培養 基購自美國Invitrogen公司，EDTA和Trypsin購自美國Sigma公司，細胞培養板和培養皿 購自美國Corning公司，質粒提取試劑盒和細胞基因組提取試劑盒均購自美國Omega公司， PrimeSTAR DNA聚合酶和Solution I DNA連接酶購自Takara公司，電轉染儀（ECM2001)購 自美國BTX公司，限制性內切酶購自NEB公司。
[0045] 下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步的詳細說明，所述是對本發明解釋 的而不是限定。
[0046] I、TALEN真核表達載體的構建
[0047] I. ITALEN靶點設計及組裝
[0048] 為提高基因打靶效率，本發明通過TALEN(類轉錄激活因子效應物核酸酶）進行介 導。TALEN靶點位于牛基因組28號染色體SFTPAl和MATlA基因的基因間序列。該位點附 近的SFTPD，MBL1和SFTPAl均屬于膠原樣凝集素家族的成員，且在巨噬細胞表面存在受體， 可以識別結合并介導結核桿菌進入巨噬細胞，促進巨噬細胞的吞噬和殺傷能力。在TALEN 識別、切割后產生雙鏈斷裂，啟動DNA雙鏈斷裂修復，同時引入同源臂載體，利用DNA雙鏈斷 裂引發的DNA重組修復過程，使組裝的目的DNA序列特異的插入該區域。在SPllO插入到 該區域后，使其有可能協同作用于巨噬細胞，進一步提高巨噬細胞抗結核感染的能力。
[0049] 另外，由于該位點附近基因簇的功能對于巨噬細胞非常重要，因此可以確定該段 染色質在巨噬細胞中處于活化狀態。將SPllO插入到該區域，可以避免插入的外源基因由 于異染色質化而失活。
[0050] 利用在線TALEN革巴點設計工具（https://tale_nt· cac. Cornell, edu/)進行革巴 點設計，TALEN識別的靶DNA序列如下（其中下劃線部分分別為TALEN上游和下游識別位 點）：
[0051] 5' -t GACCCTTAGGTTCCT cacgaatccttatgg AACACACATACCATCCA a_3'
[0052] 3, -a CTGGGAATCCAAGGA gtgcttaggaatacc TTGTGTGTATGGTAGGT t_5，
[0053] 針對所識別的上游位點和下游位點，按照通過酶切連接的方法（Huang et.al，2011.參見圖1-1)把TALEN模塊組裝（TALEN模塊購自北京康為世紀生物技術有限 公司）起來。其中模塊順序為：
[0054] 上游識別 TALEN (左臂）：NN HI HD HD HD NG NG NI NN NN NG NG HD HD NG ;
[0055] 下游識別 TALEN (右臂）：NN HI HD HD HD NG NG NI NN NN NG NG HD HD NG。
[0056] 組裝后TALEN左臂的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示、TALEN右臂的核苷酸序列 如 SEQ. ID. NO. 2 所示。
[0057] 在TALEN左臂、右臂組裝完成之后，分別對其進行載體構建：將其分別用Spel、 Nhel雙酶切之后，與用Nhel酶切的pCS2-Fok I載體連接，構建pCS2-TALEN載體（參見圖 1-2)；
[0058] 為了便于TALEN載體的篩選，進一步在TALEN的下游連接熒光標簽GFP和 mCherry，并用T2A間隔，得到如圖2所示的TALEN表達載體pCS2-TALEN-t2a-G/m ;可以在 TALEN表達載體轉染細胞3d后通過流式細胞術收集表達紅色和綠色熒光的細胞進行轉染 陽性的篩選和富集，能夠克服轉染效率低下的問題。
[0059] I. 2TALEN切割活性檢測
[0060] 利用Surveyor nuclease assay的方法對TALEN切割活性進行檢測。
[0061] 將TALEN位點特異性核酸切割酶表達載體轉染牛胎兒成纖維細胞。具體采用電 穿孔法：當細胞生長到90 %匯合時，胰酶消化細胞后IOOOrpm低速離心5min，用無血清的 Opti-MEM培養液洗滌細胞2次。將10 μ g的TALEN位點特異性核酸切割酶表達載體（左 臂表達載體、右臂表達載體各5μ g)加入到600μ L電轉液（Kcl:120mM ;Cacl2:0. 15mM ; K2HP04:10mM;Mgcl2:50mM;調PH至7.6)中，混勻，靜置lOmin。電轉染參數設置如下：電 壓：510V ;脈沖時間：3ms ;電擊次數1次。
[0062] 轉染完成后，靜置lOmin，然后將細胞懸液全部轉移到60_培養皿中，將培養液置 于37°、5%的0) 2培養箱中，待細胞貼壁后，更換新鮮培養液。3d后消化細胞并提取細胞 基因組。
[0063] 以提取的細胞基因組為模板，PCR擴增一段包含TALEN識別靶DNA的序列并進行 Surveyor nuclease酶切。引物如下：
[0064] Cel-I-F :5'-CCTTCCGCCTCTGTAGGTACAGA-3'
[0065] Cel-I-R :5,-GTAGGACACAGTGCCGCAAACCC-3'
[0066] Surveyor nuclease 酶切使用 Transgenomic 公司的 Nucleic Acid Fragment Analysis System試劑盒，具體操作詳見試劑盒說明書。酶切產物進行電泳檢測。檢測結果 見圖3。
[0067] 如果TALEN在識別靶位點進行了 DNA切割，細胞通過非同源末端修復切割的DNA， 這個過程會產生插入或者缺失突變。這種插入缺失的突變只在產生了 TALEN切割的細胞 里面才有，沒有發生切割的細胞DNA仍為野生型。通過PCR擴增的變性，退火過程，突變的 DNA單鏈和野生型的單鏈會隨機配對成雙鏈DNA。這樣PCR產物里面會有一部分DNA雙鏈 在TALEN識別祀位點不完全匹配。而Surveyor nuclease酶可以特異性的識別不匹配的位 點并進行切割。圖3中擴增產物長度為383bp。TALEN識別靶位點位于距離兩端147bp和 236bp處。如泳道2所示TALEN切割產物為5. 85%。切割條帶的比率由Image J軟件分析 得到。
[0068] 2、SpllO巨噬細胞特異性打靶載體pLR-SPlIO-Neo的構建
[0069] 2.1目的基因的克隆
[0070] 根據小鼠 SPllO序列（GenBank登陸號：NM_175397. 4)，設計引物如下：
[0071] SPlIO-EcoRI-F:5' -TCAGAATTCGAACCCCTTAACTAATCCAG-3;；
[0072] SPl10-BamHI-R:5; -CTAGGATCCGCTGGGACACTCAGAGGCTC-3;
[0073] 50μ L 的 PCR 反應體系為：10XPCR Buffer :5μ L，dNTPs(2. 5mmol/L) :4μ L， SP110-EcoRI-F(10ymol/L) :lyL，SP110-BamHI-R(10ymol/L) :lyL，PrimeSTAR DNA 聚 合酶（5U/ μ L) :0· 5 μ L，牛cDNA模板3 μ L，加超純水至50 μ L。
[0074] PCR 反應條件為：95°C預變性 5min，95°C變性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 2min， 32個PCR循環，72°C再延伸5min ;PCR膠回收產物經EcoRI和BamHI雙酶切，經Solution I 連接至PEGFP-Cl載體，暫命名為pSPlIO-Cl。其中，SPl 10基因的核酸序列如SEQ. ID. NO. 3 所示。
[0075] 2. 2MSR1啟動子的克隆
[0076] 根據牛的MSRl序列（GenBank登陸號：NC_007328)，設計引物序列如下：
[0077] pMSR-Bglll-F:5，-TGAAGATCTACCATCTCTTGATAGAAAGT-3'
[0078] pMSR-HindllI-R:5，-TACAAGCTTGACACACAAAAATACAGAG-3'
[0079] 50μ L 的 PCR 反應體系為：10XPCR Buffer :5μ L，dNTPs(2. 5mmol/L) :4μ L， pMSR-BglII-F(10ymol/L) :lyL，pMSR-HindIII-R(10ymol/L) :lyL，PrimeSTAR DNA 聚 合酶（5U/ μ L) :0. 5 μ L，牛基因組模板2 μ L，加超純水至50 μ L。
[0080] PCR 反應條件為：95°C預變性 5min，95°C變性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 lmin， 32個PCR循環，72°C再延伸5min ;PCR膠回收產物經BglII和HindIII雙酶切，經Solution I連接至PSP110-C1載體中SPllO的上游，暫命名為pMSRl-SP110。其中，MSRl啟動子的核 酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示。
[0081] 2. 3MSR1-SP1 IO-PloyA表達框插入到打靶骨架載體pCS2_Neo
[0082] 以pMSRl-SP110序列為模板，設計引物把MSR1-SP110和pEGFP-Cl骨架載體上的 PloyA-起擴增下來。引物序列如下：
[0083] MSP-SalI-F ：TGAGTCGACGGACCATCTCTTGATAGAAAG
[0084] MSP-NheI-R ： TATGCTAGCTACGCGTTAAGATACATTGAT
[0085] 50μ L 的 PCR 反應體系為：10XPCR Buffer :5μ L，dNTPs(2. 5mmol/L) :4μ L， MSP-SalI-F(10ymol/L) :lyL，MSP-NheI-R(10ymol/L) :lyL，PrimeSTAR DNA聚合酶 (5U/ μ L) :0· 5 μ L，pMSRl-SPl 10 質粒模板 I μ L，加超純水至 50 μ L。
[0086] PCR 反應條件為：95°C預變性 5min，95°C變性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 3min， 32個PCR循環，72°C再延伸5min ;PCR膠回收產物經Sail和NheI雙酶切，經Solution I連 接至pCS2-Neo打靶骨架載體中第二Loxp的下游，命名為pSP110-Neo。
[0087] 2. 4巨噬細胞特異性打靶載體pLR-SPlIO-Neo的構建
[0088] 同源臂以牛基因組為模板擴增，分別為牛28號染色體M-S位點的上游525bp和下 游466bp。設計引物如下：
[0089] LA-NotI-F ：TAAGCGGCCGCGTTGTGAATTCTATTGGAA
[0090] LA-XhoI-R ： TCACTCGAGGTGCATAATCCCTCACCC
[0091] RA-NheI-F:TGAGCTAGCGCACTTTAGAAGGCAAAGGGA
[0092] RA-KpnI-R ： TCTGGTACCGGCAAGAATACTGGAATGG
[0093] 同源左臂的核酸序列如SEQ. ID. NO. 5所示，同源右臂的核酸序列如SEQ. ID. NO. 6 所示。
[0094] 50μ L 的 PCR 反應體系為：10XPCR Buffer :5μ L，dNTPs(2. 5mmol/L) :4μ L， LA-SalI-F(10y mol/L) :1 μ L，RA-NheI-R(10y mol/L) :1 μ L，PrimeSTARDNA 聚合酶（5U/ μ L) :0· 5 μ L，pMSRl-SPllO 質粒模板 I μ L，加超純水至 50 μ L。
[0095] PCR 反應條件為：95°C預變性 5min，95°C變性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 3min， 32個PCR循環，72°C再延伸5min ;
[0096] PCR膠回收產物經Sail和NheI雙酶切，經Solution I連接至pCS2_Neo載體，其 中上游同源臂LA連接在第一 Loxp的上游，下游同源臂連接在SPllO的下游，所構建的載體 命名為pLR-SP110-Neo,其圖譜如圖4所示：
[0097] 其中目的基因 SPllO的上游連接有特異啟動子MSR1，其下游連接有終止表達的 PolyA，在巨噬細胞中MSRl啟動子特異性的啟動SPllO的表達，使得目的基因 SpllO在且僅 在牛的外周血巨噬細胞中正常轉錄和表達，從而提高轉基因動物的安全性；
[0098] 目的基因 SPllO的上游、下游分別設有LA、RA同源臂；在TALEN對SFTPAl和MATlA 基因間的識別位點切割之后，LA、RA之間的序列通過重組整合到細胞基因組中，實現M-S位 點的打靶重組；該位點附近的SFTPD，MBLl和SFTPAl均屬于膠原樣凝集素家族的成員，且在 巨噬細胞表面存在受體，可以識別結合并介導結核桿菌進入巨噬細胞，促進巨噬細胞的吞 噬和殺傷能力。將SPllO插入到該區域，使其有可能協同作用于巨噬細胞，進一步提高巨噬 細胞抗結核感染的能力。
[0099] 在LA與MSRl啟動子之間設有一對同向的Loxp，Loxp之間設有篩選基因 ΝΕ0,在 進行重組之后可以通過Cre酶將Loxp切割掉；發生同源重組后，載體中neo基因部分將定 點整合至基因組中與同源臂同源的區域，使中靶細胞獲得新霉素抗性，并且不會整合tk自 殺基因；通過NEO與TK兩個篩選基因便于陽性克隆的篩選。
[0100] 圖5所示是打靶載體pLR-SPlIO-Neo經NotI酶切線性化的瓊脂糖凝膠電泳檢測 圖。M 為 DNA marker，泳道 1 為 NotI 酶切線性化的 pLR-SPl ΙΟ-Neo,泳道 2 為 pLR-SPl IO-Neo。
[0101] 圖6是打靶載體pSPlIO-Neo經Sail和NheI雙酶切鑒定的瓊脂糖凝膠電泳檢測 圖。M為DNA marker，泳道1為Sail和NheI雙酶切的pLR-SP110-Neo。酶切鑒定結果表明 載體構建成功。
[0102] 3、SpllO巨噬細胞特異性打靶載體pLR-SPllO-Neo與TALEN位點特異性核酸切割 酶表達載體共轉染牛胎兒成纖維細胞構建核供體細胞系
[0103] 3. 1牛胎兒成纖維細胞培養
[0104] 從液氮中取一管第二代荷斯坦奶牛的牛胎兒成纖維細胞于37°C解凍，離心。棄去 廢液，加 Iml含10% FBS的DMEM重懸，接種于60_的培養皿中，置于CO2培養箱中37°C條 件下培養。
[0105] 待細胞生長到90%匯合時，胰酶消化，并按1 : 2的比例傳代培養，選取3?5代 傳代的細胞達到90%匯合的牛胎兒成纖維細胞，作為用于轉染的宿主細胞。
[0106] 3. 2陽性細胞克隆的篩選
[0107] pLR-SPl IO-Neo打靶載體與TALEN位點特異性核酸切割酶表達載體電轉染牛胎兒 成纖維細胞。
[0108] 具體采用電穿孔法：當細胞生長到90 %匯合時，胰酶消化細胞后IOOOrpm低速離 心5min，用無血清的Opti-MEM培養液洗滌細胞2次。將10 μ g的TALEN位點特異性核酸切割 酶表達載體（左臂表達載體、右臂表達載體各5yg)與打靶載體pLR-SPllO-Neo共同電轉， 將其共同加入到 600μ L 電轉液（Kcl:120mM ;Cacl2:0. 15mM ;K2HP04:10mM ;Mgcl2:50mM ;調 PH至7. 6)中，混勻，靜置lOmin。電轉染參數設置如下：電壓：510V;脈沖時間：3ms;電擊次 數1次。
[0109] 轉染完成后，靜置lOmin，然后將細胞懸液全部轉移到60mm培養皿中，將培養液置 于37°、5%的CO 2培養箱中，待細胞貼壁后，更換新鮮培養液。
[0110] 轉染完3d后消化細胞并轉移至90mm培養皿中，同時加入600 μ g/mL的G418進行 藥物篩選。篩選IOd后，對照組的細胞全部死亡，而轉染組的細胞逐漸形成單克隆細胞團， 單克隆細胞微觀示意圖如圖7所示。
[0111] 3. 3PCR鑒定基因打靶的陽性細胞克隆
[0112] 取擴大培養后的穩定轉染pLR-pSPlIO-Neo的牛胎兒成纖維細胞，提取細胞基因 組DNA，以基因組DNA為模板，PCR鑒定SPllO基因是否定點整合到M-S位點，陰性對照為未 轉染的正常牛胎兒成纖維細胞，junction PCR鑒定所用引物對為：
[0113] 5，-junction :
[0114] 5 j-F (5，-GAAGTCTGGCTGTAGTCCAGGGGGT-3，）
[0115] 5j-R(5,-CTTTCTCGGCAGGAGCAAGGTGA-3,）；
[0116] 3，-junction :
[0117] 3j-F (5，-GAAAAACCACTCCAGTGTCCTCC-3，）
[0118] 3j-R(5,-CACCAGCTATGTCTGCTTCCATA-3,）；
[0119] long-range PCR ：
[0120] lr-F(5, -TGCTGAAGCGGAAACTCCAATAC-3,）
[0121] Ir-R (5，-GACTCAAGACCAGAGGGCACACA-3，）·
[0122] 參見圖8所示的junction PCR鑒定示意圖，其中，5'-junction的上游引物位于同 源左臂外側，下游引物位于NEO基因表達框，如果PCR出現I. 49kb條帶則判為陽性并進入 3'-junction鑒定。3'-junction的上游引物位于SPllO基因表達框，下游引物位于同源右 臂外側，如果PCR出現I. 67kb條帶則判為陽性并進入long-range PCR鑒定。long-range 的上游引物位于同源左臂外側，下游引物位于同源右臂外側，如果PCR出現1.64kb的野生 型條帶和一條5. 98kb的重組條帶則判為發生了單等位基因位點特異性整合的陽性克隆。
[0123] PCR反應條件為：95 °C預變性5min ;95 °C變性30s，57 °C退火30s，72 °C延伸 211^11(1〇1^-四叩6?0?延伸5111丨11)，35個？0?循環；721：再延伸5111丨11 ;?0?產物進行0.8%瓊 脂糖凝膠電泳檢測。
[0124] PCR檢測結果如圖9a?圖9c所示，其中，泳道M為DNA Marker，泳道NC為未轉染 的牛胎兒成纖維細胞，圖9a為5'-junction檢測結果可以看到有6個陽性克隆具有I. 49kb 的目標條帶，其5'同源臂發生了重組；圖9b為3'-junction檢測結果，可以看到在6個5' 同源臂發生了重組陽性克隆中只有4個具有I. 67kb的目標條帶，其5'、3'同源臂同時發生 了重組；圖9c為long-range PCR檢測結果，結果表明由3個陽性克隆發生了完整的重組， 擴增出一條I. 64kb的野生型條帶和一條5. 98kb的重組條帶，表明其發生了單等位基因位 點打靶重組。
[0125] 3. 4Southern blot鑒定基因打祀的細胞克隆
[0126] 取經上述經PCR驗證為陽性的打靶的細胞克隆，提取細胞基因組DNA，用限制性內 切酶HindIII將基因組DNA切成小片段有利于雜交。用5'同源臂外側探針雜交。設計引 物如下：
[0127] Probel-F :5'-ACAGACTTTATTTTGGGGGG-3'
[0128] Probel-R :5'-TGGACTACAGCCAGACTTCC-3' ；
[0129] Probe2-F : 5'-GTATCCTTTCCTACTCTGCTTTGT-3'
[0130] Probe2-R : 5'-CCGATTTATCTACTTCCCTCTTG-3'
[0131] 以牛基因組為模板進行PCR擴增，PCR反應條件為：95°C預變性5min ;95°C變性 308,571：退火308,721：延伸308,35個？〇?循環；721：再延伸51^11屮〇?產物進行1%瓊脂 糖凝膠電泳檢測。
[0132] DNA 產物使用 Roche 公司的 DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II試劑盒將探針標記上地高辛，即為探針。Southern blot雜交方法按Roche 公司的 DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II 試劑盒進行。詳 細步驟見試劑盒說明書，雜交之后進行電泳鑒定。
[0133] 若單等位基因位點的M-S位點發生了重組，在雜交時基因打靶敲入外源基因會較 長，其電泳檢測會顯示兩條帶：野生型的M-S等位基因雜出5. 9kb的帶，發生基因打靶的 M-S等位基因雜出6. 8kb的帶，如圖IOa所示，泳道Con為未轉染的牛胎兒成纖維細胞。探 針位于SPllO基因上，因此發生了打靶的細胞會有一條6. 8kb的帶，而沒有中靶的細胞則沒 有條帶。如圖10中的Probe2所示，泳道Con為未轉染的牛胎兒成纖維細胞，而顯示6. 8kb 帶的為M-S位點發生了定點重組。
[0134] 這樣經過PCR及Southern blot鑒定的篩選，獲得了 M-S位點定點整合了 SPllO 的牛胎兒成纖維細胞。
[0135] 4、以上述基因組定點整合了目的基因 SPllO的牛胎兒成纖維細胞為核供體細胞， 構建轉基因克隆牛
[0136] 4. 1卵母細胞的成熟培養
[0137] 卵巢采自西安市屠宰場，在37°C無菌生理鹽水中4?6小時內運回實驗室，抽取 3?8mm直徑的卵泡，收集卵丘卵母細胞復合體，實體顯微鏡下挑選具有完整的三層以上卵 丘細胞，胞質均勻的卵母細胞用于成熟培養。成熟培養20h后用0.2%透明質酸酶去除卵丘 細胞，以第一極體的排放作為卵母細胞成熟的判定標志，挑選成熟卵母細胞用于核移植試 驗。
[0138] 4. 2轉基因克隆胚的構建
[0139] 采用體細胞核移植技術將供體細胞轉移到去除細胞核的成熟卵母細胞中。核移植 具體為：顯微操作液為含10%胎牛血清，5 μ g/mL細胞松弛素 B的PBS,用內徑20 μ m的去 核管在顯微操作儀上吸出第一極體及部分胞質，以IOu g/ml Hoechst 33342染色IOmin, 在熒光顯微鏡下挑出完全去核的卵母細胞；完全去除第一極體及染色體的卵母細胞被用于 核移植。
[0140] 卵母細胞的注核與融合，具體過程如下：胰酶消化經篩選驗證的陽性單克隆胎兒 成纖維細胞用做供核細胞。用去核管將供體細胞注入去核成功的卵母細胞透明帶下。核質 復合體在電融合液中平衡3min，用微電極法進行融合，用與顯微操作儀連接的微電極尖部 排列重組體，使膜接觸面與兩電極的連線垂直，用微電極尖輕輕壓住重組體，給予電脈沖進 行電融合。融合電壓為28V，融合時間為10 μ m。融合后的重組體放入10%胎牛血清的M199 中，38. 5°C、5% CO2、飽合濕度下培養，2h后觀察融合情況。
[0141] 4. 3轉基因克隆胚的激活及體外培養
[0142] 融合的重組胚平衡2h后，用含5ymol/L離子霉素（Ionomycin，購自SIGM公 司）的mSOFaa培養液（購自SIGMA公司）處理5min，然后在含2mmol/L二甲基氨基嘌呤 (6-DMAP)的mSOFaa培養液內培養4h，清洗3次后轉入礦物油覆蓋并預先在C02培養箱中 平衡至少2h的mSOFaa中培養，培養密度為5 μ L每個重組胚，在38. 5°C、5% CO2、飽和濕度 下培養，第7天挑選正常發育的囊胚進行核移植，如圖11所示。
[0143] 4. 4轉基因克隆牛的制備
[0144] 第7天的囊胚用非手術法移入自然發情后第七天的荷斯坦受體牛子宮內，每個受 體牛移植2-3枚囊胚。受體牛移植后觀察其返情情況，對未返情的在移植后60d用B超做 懷孕檢查。以后每隔一月檢查一次，以觀察妊娠維持情況。10個月后，成功產下成活的基 因打靶的轉基因克隆牛（圖12)。M-S位點定點整合SPllO基因的轉基因克隆牛的制備成 功，該克隆牛能夠檢測到SPllO基因的表達，而且侵染、感染結果表明對牛分支桿菌具有一 定的抗性，為預防牛結核打下了堅實的基礎。
【權利要求】
1. 一種基于TALEN介導的Spl 10巨噬細胞特異打靶載體，其特征在于，包括TALEN真核 表達載體和打靶載體； 所述的TALEN真核表達載體包括TALEN左臂表達載體和TALEN右臂臂表達載體，分別 識別TALEN靶點的上游和下游識別位點，TALEN靶點位于牛基因組28號染色體SFTPA1和 ΜΑΤΙΑ基因的基因間序列； 所述的打靶載體上克隆有重組基因 MSRl-SpllO-PolyA，并克隆有作為同源臂的TALEN 靶點上游和下游的同源序列； 所述的重組基因 MSRl-SpllO-PolyA是在SpllO基因的上游連接牛巨噬細胞特異性啟 動子MSR1，在下游連接PolyA。
2. 如權利要求1所述的基于TALEN介導的SpllO巨噬細胞特異打靶載體，其特征在于， 所述的TALEN左臂表達載體上克隆有TALEN左臂，其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示； 所述的TALEN右臂表達載體上克隆有TALEN右臂，其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。
3. 如權利要求2所述的基于TALEN介導的SpllO巨噬細胞特異打靶載體，其特征在于， 還在TALEN左臂/TALEN右臂的下游連接T2A間隔、熒光標簽GFP和mCherry。
4. 如權利要求1所述的基于TALEN介導的SpllO巨噬細胞特異打靶載體，其特征在于， 所述的重組基因 MSRl-SP110-PloyA中，SP110的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示，MSR1的 核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示。
5. 如權利要求1所述的基于TALEN介導的SpllO巨噬細胞特異打靶載體，其特征在于， 所述的同源臂包括分別位于重組基因 MSRl-SPllO-PloyA上游、下游的上游同源臂和下游 同源臂，上游同源臂與MSR1-SP110-P1 oyA之間還設有一對同向的Loxp，Loxp之間設有第一 篩選基因，下游同源臂的下游還設有第二篩選基因。
6. 如權利要求5所述的基于TALEN介導的SpllO巨噬細胞特異打靶載體，其特征在于， 上游同源臂的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 5所示，下游同源臂的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 6 所示。
7. 如權利要求1所述的基于TALEN介導的Spl 10巨噬細胞特異打靶載體，其特征在于， 所述的TALEN真核表達載體為pCS2-TALEN，其TALEN左臂表達載體和TALEN右臂表達載體， 分別通過在pCS2-Fok I載體上連接TALEN左臂、TALEN右臂而構建； 所述的打靶載體為pLR-SPl 10-Neo，是將MSR1-SP1 ΙΟ-PloyA插入到打靶骨架載體 pCS2-Neo的第二Loxp的下游，將上游同源臂連接在第一 Loxp的上游，將下游同源臂連接在 MSRl-SPllO-PloyA的下游而構建。
8. -種基于權利要求1所述的TALEN介導的SpllO巨噬細胞特異打靶載體構建的重 組細胞，其特征在于，以牛胎兒成纖維細胞為宿主細胞，通過TALEN真核表達載體和打靶載 體共同轉染到宿主細胞中，將目的基因 SpllO整合到宿主細胞的基因組的28號染色體M-S 位點。
9. 如權利要求8所述的TALEN介導的SpllO巨噬細胞特異打靶載體構建的重組細胞， 其特征在于，所述的共同轉染是將TALEN真核表達載體和打靶載體共同電轉到宿主細胞 中，電轉染參數設置如下：電壓：510V ;脈沖時間：3ms ;電擊次數1次。
10. 權利要求8所述的TALEN介導的SpllO巨噬細胞特異打靶載體構建的重組細胞作 為核移植構建轉基因克隆胚的核供體細胞的應用。
【文檔編號】C12N5/10GK104293833SQ201410528091
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月9日 優先權日:2014年10月9日
【發明者】張涌, 吳海波, 王勇勝, 張艷, 呂佳星 申請人:西北農林科技大學, 楊凌科元克隆股份有限公司