一種用于細胞永生化的真核重組微環表達載體的制作方法

一種用于細胞永生化的真核重組微環表達載體的制作方法
【專利摘要】本發明屬于基因工程【技術領域】，具體涉及一種細胞永生化過程中所使用的真核重組微環表達載體Minicircle-MRPS18及其制備方法。該載體由微環質粒與豬的MRPS18基因重組構建，其堿基序列如序列表所示。該載體通過Tubofect試劑轉染法轉染Hela細胞可制備永生化細胞。本發明特異性的結合了Minicircle質粒載體與MRPS18基因的優點，所制備的真核重組微環表達載體，具有轉基因持續表達時間長；不會引起真核細胞的應激非病毒式誘導系統，低免疫源性，安全穩定的優點；且該質粒表達載體表達GFP，便于跟蹤反應；同時具備轉染效率高、簡單易用等優點，可以獲得較好的永生化細胞制備效果。
【專利說明】—種用于細胞永生化的真核重組微環表達載體

【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程【技術領域】，具體涉及一種細胞永生化過程中所使用的真核重組微環表達載體Minicircle-MRP S18及其制備方法。

【背景技術】
[0002]永生化細胞是指細胞在自然條件下或人為誘導條件下，從衰老的風險中逃脫而擁有無盡增殖能力的細胞。由于永生化細胞可以作為細胞生物學和組織學等學科研究的標準細胞，并且具有相對穩定的增殖特性和功能，因而具有廣闊的應用前景。
[0003]MRP S18 (mitochondrial ribosome protein S18)蛋白是一種線粒體核糖體蛋白，它能夠翻譯線粒體蛋白，現有研究表明，MRP S18基因與多種線粒體疾病存在密切的分子遺傳學聯系，并且與細胞的生長調控也有密切的關系。已有研究發現，MRP S18基因的過表達能夠引起小鼠胚胎成纖維細胞永生化(Kashuba E, Yenamandra S P, Darekar SD, et al.；MRPS18 - 2 protein immortalizes primary rat embryonic fibroblasts andendows them with stem cell-like properties ；Proceedings of the Nat1nal Academyof Sciences, 2009,106(47): 19866?19871) ;Elena 等發現 MRP S18 能特異性地結合視網膜蛋白(retinoblastoma，Rb)的磷酸化和去磷酸化形式，但它不與其它的口袋蛋白結合，如pl07和pl30，從而參與Rb通路的調控。在EB病毒轉染的小淋巴細胞中，EBNA-6蛋白能將MRPS18轉移到細胞核，替換E2F1結合Rb，導致游離的E2F1增加，促進Rb依賴的細胞周期進程，且MRPS18轉染的細胞發生了永生化(Kashuba E, Yurchenko M, Yenamandra S P,et al.；EBV-encoded EBNA-6 binds and targets MRSI8-2 to the nucleus, resultingin the disrupt1n of pRb-E2Fl complexes ；Proceedings of the Nat1nal Academy ofSciences,2008，105(14):5489?5494)。
[0004]由于體外培養細胞發生自發永生化的機率很低，因此，目前普遍采用轉基因技術將外源基因整合到細胞的染色體上，以增加永生化的發生機率。由于脂質體轉染法較其他方法的應用簡單易用，且轉染效率較高，可以轉染其他化學方法不容易轉染的細胞系，因而使用較為普遍。
[0005]載體是將外源基因導入宿主細胞的運載工具，基因表達載體系統包括病毒與非病毒兩種。病毒載體的應有常有一定安全隱患存在，主要原因在于病毒容易整合到基因組，具有免疫原性。傳統的質粒載體雖然比病毒載體安全，但是轉染效率卻很低，而且用于轉染的用量很大，達到毫克級，因而成本較高；其次傳統的質粒載體含有細菌的復制原點、抗性基因、未甲基化的CpG序列以及有些可能隱蔽的表達信號，雖然這些序列在質粒的復制時是必需的，但在目的基因的表達、治療中可能誘發非常嚴重的生物安全性問題。
微環DNA (Minicircle DNA,MC DNA)是一種環狀的DNA結構,Minicircle的原始質粒MP是美國SBI公司開發的一種新型真核表達載體，通過MP自身的特異性位點，在阿拉伯糖的誘導下可以使其轉變為微環載體Minicircle，它既沒有細菌的復制原點，又不含抗性基因，和其它載體相比長度更小。研究表明，Minicircle載體功能很強，在體內或體外的細胞和組織中能夠長期表達轉基因，和其他載體相比，轉基因持續表達的時間是其他載體的10-1000倍。同時并不會引發真核細胞的應激非病毒式誘導系統，而且表達綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP),便于觀察跟蹤,具備轉染效率高、體內長期表達等優點，并且簡單易用。
[0006]現有技術中，關于豬的MRP S18基因的真核表達載體研究使用過pcDNA3.1 (+)、PEGFP-Nl等載體，然而這些載體中都含有細菌復制起始位點和抗性基因，這些元件可能會使外源基因沉默，因而并不適于制備永生化細胞，而現有技術中，尚未見到較好的載體與MRP S18基因的重組微環表達載體的有關報道。


【發明內容】

[0007]本發明目的在于提供一種Minicircle質粒(也稱微環質粒)與豬的MRP S18基因構建的真核重組微環表達載體Minicircle-MRPS18,該表達載體可以轉染相關細胞用于制備永生化細胞。
[0008]本發明采取的技術方案如下:
一種用于細胞永生化的真核重組微環表達載體Minicircle-MRP S18,由微環質粒與豬的MRP S18基因重組構建，其喊基序列如序列表所不。
[0009]所述用于細胞永生化的真核重組微環表達載體Minicircle-MRP S18,其制備過程為:首先PCR克隆豬MRP S18基因，然后將克隆的MRP S18基因與質粒pMD19_T連接，構建PMD19-T-MRPS18重組質粒，將構建好的pMD19_T_MRPS18重組質粒和微環質粒進行雙酶切，連接，轉化，挑取陽性菌落進行菌液PCR和測序鑒定，將鑒定正確的載體收集即為重組微環表達載體 Minicircle-MRP S18 ；
詳細制備過程包括如下步驟:
(1)PCR克隆豬的MRP S18基因；
(2)將步驟(I)中克隆的MRPS18基因與pMD19-T質粒連接，構建pMD19_T_MRPS18重組質粒；
(3)將重組質粒pMD19-T-MRPS18與Minicircle質粒分別進行雙酶切，雙酶切產物進行連接，鑒定，獲得真核重組微環表達載體Minicircle-MRP S18。
[0010]所述述用于細胞永生化的真核重組微環表達載體Minicircle-MRP S18,通過Tubofect試劑轉染法轉化進入轉染細胞用于制備永生化細胞。
[0011]所述轉染細胞為Hela細胞。
[0012]本發明采用的外源永生化基因是豬線粒體核糖體蛋白MRP S18基因，該基因在豬的各個組織均有分布，相對其它外源基因來說容易獲得，因而是一個安全的、表達穩定的外源基因。本發明所提供的用于細胞永生化的真核重組微環表達載體Minicircle-MRPSIS，特異性地結合了 Minicircle質粒載體與MRP S18基因各自的優點，所制備的真核重組微環表達載體，具有轉基因持續表達時間長；不會引起真核細胞的應激非病毒式誘導系統，低免疫源性，安全穩定的優點；且該質粒表達載體表達GFP，便于跟蹤反應；同時具備轉染效率高、簡單易用等優點，因而適于轉染相關細胞，可以獲得較好的永生化細胞制備效果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為真核重組微環表達載體Minicircle-MRP S18的構建流程示意圖；
圖2為MRP S18基因PCR擴增結果，其中I為DNA分子質量標準DL2000，2—4為MRPS18基因PCR擴增結果；
圖3為pMD19-T-MRP S18質粒的菌液PCR結果，其中I為DNA分子質量標準DL2000，2—4為pMD19-T-MRP S18質粒的菌液PCR結果；
圖4為PMT19-MRP S18克隆載體的雙酶切結果，其中I為DNA分子質量標準DL2000，2為PMT19-MRP S18克隆載體的雙酶切結果；3為PMT19-MRP S18 ； 4為DNA分子質量標準Wide Range DL15000 ；
圖5為Minicircle載體的雙酶切結果，其中I為DNA分子質量標準Wide RangeDL15000 ； 2 為 Minicircle 載體的雙酶切結果；3 為 Minicircle ；
圖6為真核重組微環表達載體Minicircle-MRP S18的菌液PCR結果，其中I為DNA分子質量標準DL2000，2—5為真核重組微環表達載體Minicircle-MRP S18的菌液PCR結果；圖7為真核重組微環表達載體Minicircle-MRP S18的誘導結果，其中I為DNA分子質量標準Wide Range DL15000，2為Minicircle-MRP S18的單酶切鑒定結果，3— 4為Minicircle-MRP S18 的誘導結果；
圖8為Hela細胞中MRPS18基因的mRNA表達水平結果；
圖9為Hela細胞中GFP基因的mRNA表達水平結果；
圖10為Minicircle-MRP S18在HeLa細胞的持續時間表達；其中A為試驗組48h (1X)，B為試驗組第8d(10X)，C為試驗組第15d(10X)，D為試驗組第22d (1X)，E為陰性對照組48h (10X)，F為陰性對照組第22d(10X)；
圖11為MTT法繪制細胞生長曲線結果；
圖12為β_半乳糖苷酶活性檢測結果，其中A為試驗組(1X)，B為空白對照組(1X)，C為陽性對照組(1X)，D為陰性對照組(1X)；
圖13為免疫化學實驗檢測細胞中TERT的表達情況結果；其中A為試驗組48h (1X)，B為空白對照組48h (1X)，C為陰性對照組48h (1X)；
圖14為端粒酶TRAP結果；其中I為試驗組，2為空白對照組，3為陽性對照組。

【具體實施方式】
[0014]下面結合實施例對本發明做進一步的解釋說明，以使本領域技術人員便于理解和實施本發明。
[0015]介紹具體實施例前，對實施例中所用樣品來源、主要試劑、設備簡要介紹如下，未述及內容以本領域常用設備或試劑為準。
[0016]豬的MRP S18基因:取豬的肝臟組織，組織采用液氮速凍后保存于_80°C。
[0017]菌株和質粒:pMD19-T載體(Code N0.3271)、E.coli DH5 α 菌株(即 DH5a 感受態細胞，Code N0.9057)購自大連寶生物工程有限公司(TAKARA) ;MP質粒、ZYCY10P3S2TE.coli菌株購自美國SBI公司。
[0018]主要儀器:
溫度梯度PCR分析儀，B1metra, Germany ；
JY600C電泳儀與JY-SCZ-2電泳槽，北京君意東方電泳設備有限公司； 凝膠成像分析系統，UVP, Germany ；
微量紫外分光光度計，Thermo NAN0DR0P 1000 ；
VD-850型桌上式樣潔凈工作臺，蘇州凈化；
HH-S2數顯電熱恒溫水浴鍋，金怡；
臺式小型離心機 5424R, Eppendorf, Germany ；
申能博彩高精度數控搖床，上海堪鑫儀器設備有限公司；
自動高壓滅菌鍋，SANYO, Japan ；
恒溫孵育器，Eppendorf, Germany ；
微量移液器，Eppendorf, Germany。
[0019]主要試劑及配制:
質粒小量提取試劑盒(AxyPrep Plasmid Miniprep Kit)購自AXYGEN公司；
山羊抗兔抗體為日本中杉金橋公司產品；
SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒來自上海生工生物工程有限公司；
20% L-阿拉伯糖購自美國SBI公司；
Nhe I (Code No: 1622), Bam HI (Code No:1605), T4 DNA 連接酶、rTaq 酶(Code No:RR902A)、DL5000、DL2000、Wide Range DNA Markerl5000、Trizol、反轉錄試劑、5 X M-MLVBuffer (lot::A801A)>1mM dNTP mix (lot:BH2701A)、Ribonuclease Inhibitor (lot:Κ68010Α,40υ/μ? , M-MLV Reverse Transcriptase (lot:CK3401A，200U/^L)、oligo(dT)(lot:T401AA，14nmol)、Solut1n ICCode N0.6023)、10XGreen BufferCCode No:1605)、T4 DNA連接酶(Code No:2040A)U0XT4 DNA Ligase BufferCCode No:2040A),SYBR Greenmix (lot:AK3803)購自 TAKARA 公司；
轉染試劑TurboFect購自Thermo公司；
質粒中提試劑盒購自QIAGEN公司；
DMEM培養基、10%胎牛血清、0.25%胰酶為Gibco公司產品； β-半乳糖苷酶報告基因檢測試劑盒為碧云天生物技術研究所產品；
阿霉素購自南京凱基生物科技發展有限公司；
兔抗人hTERT抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；
DEPC 水(lot:3A600180)，北京鼎國；
切膠純化試劑盒(編號:SK8132)，上海生工生物工程有限公司。
[0020]LB 液體培養基:Tryptone (胰蛋白胨)10g, Yeast Extract (酵母提取物)5g,NaCl5g。配制方法，按照配方分別稱量，加入800ml去離子水，混勻使其充分溶解，隨后加入去離子水定容至100mL,用NaOH (5mol/L)溶液調pH值至7.0,高壓蒸汽滅菌30min。
[0021]氨芐青霉素(Ampicillin)貯存液:稱取Ig氨芐青霉素于15mL離心管中，加入適量滅菌水，充分溶解后，定容至1ml (終濃度為100mg/mL)，用0.22mm過濾膜進行過濾除菌，分裝，-20°C保存。使用時每ImL LB液體培養基加入IyL Amp貯存液，使用終濃度為
100μ g/mL。
[0022]卡那霉素(Kanamycin)忙存液:稱取0.5g Kanamycin置于15mL離心管中，加入適量滅菌水，充分溶解后，定容至1mL (終濃度為50mg/mL)，用0.22mm過濾膜進行過濾除菌，分裝(ImL/管)，-20°C保存。使用時每ImL LB液體培養基加入WL該Kana貯存液，使用終濃度為50Pg/mL。
[0023]IPTG (異丙基硫代_β -D半乳糖苷)貯存液:稱取1.2g IPTG置于50mL離心管中，加入適量滅菌水，充分溶解后，定容至50mL,終濃度為24mg/mL,用0.22mm過濾膜進行過濾除菌，分裝，_20°C保存。
[0024]X-gal (5-溴_4_氫_3_吲哚-β -D-半乳糖苷)貯存液:稱取Ig X-gal于50mL離心管中，加入40ml DMF (二甲基甲酰胺)，充分溶解后，定容至50mL，終濃度為(20mg/mL)，用0.22mm過濾膜進行過濾除菌，分裝，置于_20°C保存。
[0025]Amp+/LB固體培養基:按照配方先配制IL LB液體培養基,然后加入15g瓊脂粉(Agar powder),高壓蒸汽滅菌30min。待培養基冷卻至60°C時,加入Ampicilin忙存液，至終濃度為100 μ g/mL,充分混勻，鋪制平板培養皿，35mL/90mm培養皿。
[0026]Kana +/LB固體培養基:按照配方先配制IL LB液體培養基，然后加入15g瓊脂粉(Agar powder),高壓蒸汽滅菌30min。待培養基冷卻至60°C時,加入Kanamycin忙存液，至終濃度為50 μ g/mL,充分混勻，鋪制平板培養皿，35mL/90mm培養皿。
[0027]50 X TAE 電泳緩沖液(ρΗ8.0):稱取 242g Tris 和 37.2g EDTA置于 IL燒杯中，加雙蒸水800mL，充分溶解，加入57.1mL冰醋酸，充分混勻后調pH值為8.0，然后加入雙蒸水定容至1L。
[0028]5mg/ml的MTT溶液:稱取50mgMTT溶解于1ml磷酸鹽緩沖液中，配成5mg/ml濃度，抽濾除菌，分裝避光-20度保存。
[0029]10%胎牛血清培養基:900mlDMEM中加入已滅活的胎牛血清100ml，混勻后，調PH值為7.0，0.45um微孔濾膜過濾除菌，4°C保存。
[0030]大腸桿菌DH5a和ZYCY10P3S2T E.coli感受態細胞采用CaCl2法擴增培養，具體為:
(1)挑取原菌種，在LB瓊脂板上劃線，37°C培養過夜(12?16h)；
(2)從活化的菌平板上挑取一個單菌落，接種于2mLLB液體培養基中，于37°C搖床培養過夜；次日將該菌液以1%體積比例接種于50mL LB液體培養基中，37°C搖床2?3h，擴大培養；混濁后，每30min測一次OD6tltl,至OD6tltl為0.3左右，停止培養；
(3)冰浴lOmin，轉入 50mL 離心管中，4°C、4000r/min 離心 1min ；
(4)棄去上清液，用1mL冰浴的0.lmol/L CaCl2溶液(已高壓滅菌)重懸細胞后，冰浴30min ;然后于 4°C、4000r/min 離心 1min ；
(5)棄去上清液，加入2mL預冷的0.1 mo I/L CaCl2 (含15 %甘油，已高壓滅菌)，小心懸浮細胞；
(6)置于冰浴中，以ΙΟΟμ?ν管分裝于小管，置于_80°C保存。
[0031]注:以上工作在超凈工作臺中操作，以避免污染。
[0032]實施例1
本發明所提供的用于細胞永生化的真核重組微環表達載體Minicircle-MRPS18,由微環質粒與豬的MRP S18基因重組構建，其喊基序列如序列表所不。
[0033]真核重組微環表達載體Minicircle-MRPS18，其制備過程如圖1所示，具體為:首先PCR克隆豬MRP S18基因，然后將克隆的MRP S18基因與質粒pMD19_T連接，構建PMD19-T-MRPS18重組質粒，將構建好的pMD19_T_MRPS18重組質粒和微環質粒進行雙酶切，連接，轉化，挑取陽性菌落進行菌液PCR和測序鑒定，將鑒定正確的載體收集即為重組微環表達載體 MinicireIe-MRPS 18 ο
[0034]詳細制備過程介紹如下:
(I) PCR克隆豬的MRP S18基因；
①引物的設計和合成
根據MRP S18基因的核苷酸序列和表達載體克隆位點的要求,設計引物,引物由上海生工生物工程有限公司設計合成，具體序列如下:
F: 5 ’ -CTAGCTAGCGCCACCATGGCTGCCTCCATATTGAACGTG-3，，
R:5’ -CGGGATCCCTACAGAGCACTTTGCGG-3’。
[0035]②豬肝臟組織中總RNA的提取
總RNA提取采用TRIZOL法，步驟簡要介紹如下:
從液氮中取出保存的組織，于錫箔紙上取約lOOmg，放入2ml離心管中，加入I mLTrizol，用組織勻漿機冰浴下充分破碎45s，室溫靜置5min ;加入200 μ L氯仿，劇烈震蕩3min,室溫靜置2min ；4°C 12000 rpm離心15min,可觀察到樣品分為三層，小心吸取上層水相(約400 μ L)轉移至一新1.5mL離心管中，加入等體積的異丙醇，上下緩慢顛倒混勻后，室溫靜置20 min，沉淀RNA ;4°C 12000 rpm離心10 min，棄去上清，沉淀用ImL 75%乙醇(DEPC水配制)洗漆,彈起沉淀；4°C 12000 rpm離心10 min,棄去上清,沉淀用ImL無水乙醇懸浮；4°C 12000rpm離心5min,棄去上清,倒扣于吸水紙上，自然晾干；根據沉淀的多少用適量的DEPC水20?100 μ L溶解，_80°C保存。
[0036]③提取的總RNA反轉錄成cDNA
反轉錄:模版RNAl μ g, oligo (dT) I μ L,加DEPC水至6 μ L,混勻并瞬離,70°C 1min后立即冰浴5min，加入以下反轉錄體系:
5 X M-MLV Buffer,2μ? ；
1mM dNTP mix，0.5μ? ；
Ribonuclease Inhibitor，0.25μ? ;
M-MLV Reverse Transcriptase，I μ L ；
DEPC 水，0.25 μ L0
[0037]將以上配制好的產物放入PCR儀中，按以下反應程序進行:30°C 10 min,42°CIh，720C 1min，140C pause。
[0038]反應結束后，加50 μ L的DEPC水，將所得cDNA稀釋6倍，所得的cDNA置于_20°C保存備用。
[0039]④PCR擴增目的片段 PCR體系:
ddH20，8.5I^L ；
rTaq 酶，12.5I^L ；
步驟①中 Primer F (10 pmol/KL)，?μ? ;
步驟①中 Primer R (10 pmol/KL)，?μ? ;
步驟③中cDNA，2KL ；
反應條件:95°C 5min，95°C 30s、56°C 30s、72°C 70s，反應 39 個循環，72°C 1min0
[0040]PCR產物跑1%的瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖2，用切膠純化試劑盒進行回收。
[0041](2)將步驟(I)中克隆的MRP S18基因與pMD19-T質粒連接，構建pMD19-T-MRPS18
重組質粒
按照TaKaRa寶生物工程有限公司pMD_19T載體說明，將MRP S18基因與pMD_19T載體連接。
[0042]反應體系如下:
步驟(I)中PCR擴增后MRP S18基因，1.5μ?;
PMD-19T (50 ng /uL),?μ? ；
Solut1n I (TAKARA, Code N0.6023),5μ? ；
雙蒸水，2.5μ? ；
連接溫度16°C，時間12h，冰上放置5min。
[0043]取連接完成后取1PL液體轉化入DH5 α感受態細胞中，均勻涂在含氨芐青霉素(100 μ g/mL)的LB培養平板上(37°C、12?16h)。挑取單個菌落于含氨芐青霉素的(100 μ g/mL) LB培養液中培養(37°〇、511)，進行菌液PCR鑒定。
[0044]PCR鑒定體系如下: ddH20,8.5M-L ；
rTaq 酶，12.5M-L ；
步驟(I)中 Primer F (10 pmol/M-L), IM-L ；
步驟(I)中 Primer R (10 pmol/M-L), IM-L ；
菌液，2μ?。
[0045]反應條件:95°C 5min,95 °C 30s,56 °C 30s,72 °C 70s，反應 39 個循環，72°C 1min。
[0046]PCR產物跑1%的瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖3。
[0047](3)構建重組微環表達載體Minicircle_MRPS18
分別將重組質粒PMD19-T-MRPS18與Minicircle質粒進行雙酶切，雙酶切產物進行連接，鑒定，構建重組微環表達載體Minicircle-MRPS18。具體如下:
①Minicircle質粒和pMD19_T_MRP S18重組質粒分別進行雙酶切酶切體系:
NheI，?μ? ；
Bam HI, IM-1 ；
1XGreen Buffe, 2M-1 ；
Minicircle 質粒或步驟(2)中 pMD19T- MRP S18 (100ng/>L，9μ? ；
高壓雙蒸水，up to 20? ；
酶切溫度37°C，時間30min。
[0048]酶切產物跑1%的瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖4和圖5。用切膠純化試劑盒進行回收酶切產物。
[0049]②酶切產物進行連接連接體系:
T4 DNA 連接酶，?μ? ；
10XT4 DNA Ligase Buffer, 2.5? ；
步驟①中雙酶切MRP S18片段(20ng/^L)，WL ;
步驟①中雙酶切Minicircle質粒片段(32.1ng/μι), 3.5μ? ；
滅菌水，12μ? ；
連接溫度16°C，時間12h，冰上放置5min。
[0050]取1PL連接體系轉化入DH5 α感受態細胞中，均勻涂在含卡那霉素(5(^g/mL)的LB培養平板上。挑取單個菌落于含卡那霉素(5(^g/mL)的LB培養液中培養，進行菌液PCR鑒定。
[0051]PCR鑒定體系如下: ddH20,8.5M-L ；
rTaq 酶，12.5M-L ；
步驟(I)中 Primer F (10 pmol/M-L), IM-L ；
步驟(I)中 Primer R (10 pmol/M-L), IM-L ；
菌液，2μ?。
[0052]反應條件:95°C 5min,95°C 30s、56°C 30s,72 °C 70s，反應 39 個循環，72 °C1min0 PCR產物跑1%的瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖6。
[0053]③微環質粒Minicircle質粒誘導表達效果鑒定
將步驟②中構建得到的Minicircle-MRP S18重組微環表達載體轉化入ZYCY10P3S2T感受態細胞，經20% L-阿拉伯糖誘導后，用NheI酶切來鑒定微環誘導的效果。
[0054]酶切體系:
NheI, Iμ? ；
1XGreen Buffer, 2M-L ；
pMD19T- MRP S18(lOOng/μ? ,9μ? ；
高壓雙蒸水，up to 20μ1 ；
酶切溫度37°C，時間30min。
[0055]酶切產物跑1%的瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖7。結果表明微環質粒Minicircle質粒正確表達，所構建的Minicircle-MRP S18重組微環表達載體可以用來轉染細胞。
[0056]實施例2
為檢驗實施例1所構建的真核重組微環表達載體Minicircle-MRP S18在細胞永生化方面的具體技術效果，發明人將Minicircle-MRP S18轉染人子宮癌細胞Hela cell后，在細胞水平上進一步檢測了該基因的表達情況及對相關的細胞永生化指標進行了檢測(細胞永生化指標有:實時定量PCR檢測基因的表達以及Minicircle中GFP的表達，熒光持續時間觀察，MTT法細胞生長曲線繪制，細胞衰老標志β-半乳糖苷酶活性檢測，免疫化學實驗檢測細胞中TERT的表達，端粒酶活性的檢測)，具體介紹如下。
[0057]①重組微環表達載體Minicircle-MRP S18轉染Hela細胞
用含10%滅活胎牛血清的DMEM培養液，在5% CO2、37°C條件下培養人子宮癌細胞Hela細胞，采用Tubofect試劑轉染法轉染；同時設置了 Minicircle轉染的Hela細胞作為對照。
[0058]②實時熒光定量PCR檢測MRP S18基因、GFP在Hela細胞中的表達
為檢驗MRP S18基因、GFP在Hela細胞中的表達情況，發明人分別從轉染Minicircle-MRP S18的Hela細胞、轉染Minicircle的Hela細胞、未轉染的正常的Hela細胞中提取了總RNA并進行RT-PCR合成cDNA，通過Real time Q-PCR進行基因mRNA表達水平的檢測。mRNA相對表達量結果用GraphPad Prism 5統計軟件分析處理。
[0059]如圖8所示，針對MRP S18基因表達結果表明，轉染Minicircle-MRP S18的Hela細胞與轉染Minicircle的Hela細胞相比，MRP S18基因表達水平顯著升高。
[0060]如圖9所示，針對GFP的表達結果表明，轉染Minicircle-MRP S18的Hela細胞與轉染Minicircle的Hela細胞相比，GFP的表達水平無顯著差異。
[0061]具體步驟如下:
分別將轉染真核重組微環表達載體Minicircle-MRP S18的Hela細胞、Minicircle的Hela細胞及正常Hela細胞培養48h后提總RNA，反轉錄成cDNA，將各樣品的cDNA原液用DEPC-H2O進行50倍稀釋，將稀釋后的cDNA作為反應模板，單個樣品的每個基因均作3孔重復以減少試驗誤差，分別以MRP S18、Minicircle質粒片段中的GFP Q-PCR為引物，以人β-actin為內參，進行Real Time PCR0引物由大連寶生物工程有限公司合成。
[0062]MRP S18 Q-PCR 引物序列:
上游為 GGGACCTTGACTTCAGTACCACTC，
下游為 GCTCTCTCTCTGGTGGCTGTTT ；
GFP Q-PCR引物序列:
上游為 CGCATGACCAACAAGATGAAG，
下游為 GGTAGGTGCCGAAGTGGGATA ； β -actin Q-PCR 引物序列:
上游為 GGGTCAGA AGGATTCCTATG,
下游為 GGTCTCAAACATGATCTGGG。
[0063]熒光定量PCR檢測相關基因:以稀釋后各樣品的cDNA作為反應模板，每個樣品的單個基因做3孔重復用來減少試驗中的誤差，每一個樣品均有管家基因β -actin作為對照。反應體系如下:
SYBR Green mix，5 μ L ;
上游引物(20 pmol/μ?,Ο.1yL5 下游引物(20 pmol/μ?,Ο.1yL5 cDNA,1.25uL ；
DEPC 水，3.55 μ L0
[0064]最佳反應程序為:95°C2min,95°C 15s、60°C 20s，40 個循環，72°C 20s。
[0065]熒光信號的采集設置在PCR反應的延伸階段，閾值及基線由軟件自動生成。擴增程序設置后，再插入熔解曲線的反應程序，具體程序為:95°C 15s,60°C 15s，95°C 15s。
[0066]③Minicircle-MRP S18真核重組微環表達載體轉染Hela細胞后熒光持續時間的觀察轉染前8h將處于對數生長期的Hela細胞以IX 15/孔的密度接種于12孔板，待細胞生長達40%_60%融合度時，按Tubofect轉染試劑盒說明書進行轉染，設置不轉質粒的Hela細胞作為陰性對照組，24 h后觀察各自的熒光情況，持續觀察直至熒光消失。
[0067]用熒光顯微鏡拍照結果如圖10所示。
[0068]從圖中可以看到,轉入Minicircle-MRP S18重組微環表達載體的細胞出現了綠色熒光(圖A)，表明微環表達載體成功轉染入細胞中，持續觀察到第22d時，熒光消失(圖D)，表明表達效果較為持久。
[0069]④MTT法細胞生長曲線的繪制
實驗分為3組:轉染Minicircle的空白對照組，轉染Minicircle-MRP S18基因組，未轉染質粒的正常的Hela細胞。轉染6個小時后每孔加入MTT液(5mg/mL) 10uL，于培養箱中培養4h后，棄上清，每孔加入150uL 二甲基亞楓(saikeb1，CAS:67685)。震蕩使結晶充分溶解，在多功能酶標儀上測定吸收度A492nmt5連續檢測5天后，分析吸收度A492nm值，以時間為橫坐標，以OD值為縱坐標作生長曲線圖，如圖11所示。結果表明豬MRPS18基因對Hela細胞的生長有抑制，但生長趨勢正常。
[0070]⑤β -半乳糖苷酶報告基因檢測
β -半乳糖苷酶是一種常用的衰老標志物的報告基因，可以進行原位染色，在光學顯微鏡下就能夠觀察到細胞或組織中的β-半乳糖苷酶的表達。
[0071]以β-半乳糖苷酶原位染色試劑盒(碧云天生物技術研究所，編號:C0602)對了β -半乳糖苷酶報告基因的表達情況進行了檢測鑒定。實驗分為4組:轉染Minicircle的空白對照組，轉染Minicircle-MRP S18試驗組，正常的Hela的未刺激的陰性對照組和正常的Hela刺激細胞衰老后的陽性對照組。
[0072]β -半乳糖苷酶原位染色試劑盒以X-Gal為底物，β -半乳糖苷酶能夠催化其生成深藍色產物，這樣在普通顯微鏡下就能觀察到變成藍色的衰老的細胞。可根據細胞染色情況觀察，細胞染色成藍色說明細胞衰老，染色越深說明衰老越明顯。結果如圖12所示，結果顯示MRP S18對細胞的衰老有抑制作用。
[0073]⑥免疫化學實驗檢測細胞中TERT的表達情況
將Iyg Minicircle-MRP S18重組質粒轉染入Hela細胞中作為試驗組，同時設置未轉染即正常的Hela細胞的陰性對照組,轉染質粒Minicircle的空白對照組做免疫化學實驗觀察TERT的表達情況。
[0074]48h后做免疫組化，觀察細胞中的TERT的表達，染色越深代表細胞中的TERT表達量越高。結果顯示，MRPS18能促進細胞中TERT的表達。如圖13。
[0075]具體步驟如下:
固定:吸出培養基，PBS (博士德，0.1M)洗2次，冷丙酮(煙臺市雙雙化工有限公司，批號265141)固定 1min0
[0076]吸出丙酮，加PBS清洗5min。玻片取出晾干。
[0077]滴加1:300 (PBS)稀釋的兔抗人TERT抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，置濕盒中，37°C，lh。
[0078]取出玻片，PBS震洗3次，每次5min，吹干。
[0079]滴加1:1OO(PBS)稀釋的山羊抗兔抗體(日本中杉金橋公司)，置于濕盒中，37°C，Ih0
[0080]取出玻片，PBS震洗3次，每次5min，吹干。
[0081]DAB (中杉金橋，ZL1-9017/9018/9019)顯色 lOmin，室溫。
[0082]自來水沖洗(終止DAB染色)。
[0083]中性樹脂(中國上海標本模型廠)封片、拍照。
[0084]⑦端粒酶活性的檢測
將Iyg Minicircle-MRP S18重組質粒轉染入Hela細胞中作為試驗組，同時設置未轉染即正常Hela細胞陽性對照組，轉染質粒Minicircle的空白對照組，培養48h后進行細胞端粒酶活性的檢測，結果如圖14。端粒酶試劑盒(南京凱基生物，CAT N0.KGA413)在凝膠電泳上顯示間隔6bp階梯狀分離的陽性結果，端粒酶活性的大小可由條帶得深淺及多少來說明。結果表明MRP S18能增強端粒酶的活性。具體操作如下。
[0085]轉染體系:
質粒，IPg ；
DMEM(無血清)(Gibco 公司，lot N0.1233130), ΙΟΟμ? ；
轉染試劑，2PL ；
將質粒和DMEM混勻后靜置5min，加入轉染試劑混勻，靜置15min，滴加到12孔板中，邊加邊緩慢搖動，12h換液。
【權利要求】
1.一種用于細胞永生化的真核重組微環表達載體Minicircle-MRP S18,其特征在于，該重組微環表達載體由微環質粒Minicircle與豬的MRP S18基因重組構建，其堿基序列如序列表所示。
2.權利要求1所述真核重組微環表達載體Minicircle-MRPS18的制備方法,其特征在于，包括如下步驟: (1)PCR克隆豬的MRP S18基因; (2)將步驟(I)中克隆的MRPS18基因與pMD19-T質粒連接，構建pMD19-T-MRPS18重組質粒； (3)將重組質粒pMD19-T-MRPS18與Minicircle質粒分別進行雙酶切，雙酶切產物進行連接，鑒定，獲得重組微環表達載體Minicircle-MRP S18。
3.權利要求1所述真核重組微環表達載體Minicircle-MRPS18在制備永生化細胞方面的應用。
4.如權利要求3所述真核重組微環表達載體Minicircle-MRPS18在制備永生化細胞方面的應用，其特征在于，將真核重組微環表達載體Minicircle-MRP S18通過Tubofect試劑轉染法轉染Hela細胞。
【文檔編號】C12N15/66GK104293832SQ201410525855
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月9日 優先權日:2014年10月9日
【發明者】王月影, 張君, 楊國宇, 李和平, 鐘凱, 朱河水, 郭豫杰, 魯維飛, 韓立強, 張超, 焦顯芹 申請人:河南農業大學