一種水稻的miRNA及其前體基因和它們在對鎘敏感轉基因水稻的育種上應用的制作方法

一種水稻的miRNA及其前體基因和它們在對鎘敏感轉基因水稻的育種上應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及水稻基因生物領域，尤其涉及一種水稻的miRNA及其前體基因和它們在對鎘敏感轉基因水稻的育種上應用。一種水稻的miRNA，其堿基序列如SEQ ID NO.1所示。本發明通過將水稻miR268轉化到水稻愈傷組織，將獲得的T2代種子播種在含鎘培養基中，發現過表達miR268的水稻植株對鎘敏感。本發明進而通過包含所述水稻miRNA的前體基因連接到載體上，通過農桿菌介導轉化到水稻愈傷組織，篩選培養，獲得純合的水稻轉基因株系。通過轉基因手段發現該miRNA具有顯著增加水稻對鎘敏感性的作用。
【專利說明】—種水稻的miRNA及其前體基因和它們在對fll敏感轉基因水稻的育種上應用

【技術領域】
[0001]本發明涉及水稻基因生物領域，尤其涉及一種水稻的miRNA及其前體基因和它們在對鎘敏感轉基因水稻的育種上應用。

【背景技術】
[0002]近年來，隨著我國工業化和城市化進程的不斷發展，重金屬造成的土壤污染形勢日趨嚴峻，對我國的生態環境、食品安全、百姓身體健康和農業的可持續發展構成了嚴重威脅。據報道，全國每年因重金屬污染糧食達1200萬噸，造成直接經濟損失超過200億元。今年政協“一號提案”明確指出我國農業發展模式粗放，污染日趨嚴重，全國耕地重金屬污染面積在16%以上，大城市、工礦區周邊情況更為嚴重。如廣東省清潔土壤只有11%，輕度污染占總耕地數量的77%，重度污染土壤占總量的12%;太湖流域，約三分之一的耕地受到污染；湖北省受三廢污染的耕地面積達到40萬公頃，占全省耕地面積的10% ;湖南冷水江河水污染嚴重，37%水稻田重金屬超標幾倍；浙江省受三廢污染的耕地面積達33.33萬公頃，占全省耕地總面積的20%以上，臺州市路橋、溫嶺、玉環三地被列入全國重金屬重點防治區域。可見，我國土壤的重金屬污染問題已相當嚴重，發展綠色農業刻不容緩。
[0003]水稻是世界上最重要的農作物，全球一半以上的人口以稻米為主食，我國是世界上第一種稻大國，目前我國稻米中重金屬超標現象已引起了國家各部委的高度重視。重金屬一旦進入土壤——水稻系統就很難排除。過量的重金屬在水稻的根、莖、葉以及籽粒中積累，不僅影響水稻的品質、產量和農田生態系統，并可通過食物鏈進入人體，引發多種疾病，最終危害人體健康。食用遭到鎘污染的食品，可能會造成鎘在人體內積累，造成腎損傷，也會導致骨軟化癥等。日本著稱的“痛痛病”，即1950年發生在日本富山縣的中毒事件就是鎘污染所致。因此，探明水稻對重金屬吸收、轉運規律及重金屬耐性的生理和分子機理，在輕度重金屬污染的土壤中進行農作物的安全生產，并利用植物進行大規模污染土壤的修復，這對保障糧食安全、生態安全和人民健康，促進農業生產的可持續發展意義重大。然而這一設想的實施依賴于作物對重金屬吸收、轉運規律的認識及對重金屬耐性的分子生理機制的揭示。植物重金屬毒害是多方面的，其對重金屬的抗性機制也十分復雜，包括植物限制重金屬離子吸收，重金屬與體外分泌物結合，重金屬的外排，根系富集，細胞壁束縛，跨質膜、液泡膜轉運，抗氧化響應等。其中，有機酸、氨基酸、含氮化合物，植物螯合肽(Phytoche I at in,PC)和金屬硫蛋白(MT)等在植物對重金屬的解毒作用中發揮了重要功能。一些與植物重金屬耐性相關的基因也得到了鑒定與功能的描述，它們基本為直接參與代謝與生理變化的效應基因，通過控制代謝小分子或蛋白的表達參與抗逆過程。一般認為植物的重金屬脅迫應答機理可能是由多基因控制的，植物的重金屬毒害及其耐受性是多種生理過程的綜合反應，但迄今為止其中何為關鍵因子并不清楚。
[0004]微RNA(microRNA，或miRNA)是一種新型的調控基因表達的小分子RNA，主要在轉錄后水平負調控靶基因的表達。植物中miRNA通過調控其靶基因的表達，廣泛參與植物的生長發育、細胞代謝、器官形態建成、激素分泌、信號轉導、脅迫應答等過程。近年來的研究表明，miRNA在植物重金屬脅迫響應過程中扮演著重要角色。在豆科的模式植物蒺藜苜蓿中，部分miRNA的表達可受重金屬鎘、汞、鋁的誘導與調節(Zhao, S.Z.，Si, Q.H.，Zhi, Μ.Y.B1informatic identificat1n and express1n analysis of new microRNAs fromMedicago truncatula.B1chem.B1phys.Res.Commun, 2008, 374:538 - 542.)。在甘藍型油菜中，miR156、miR171、miR393 以及 miR396a 的表達受到鎘的抑制(Xie, F.L., Huang, S.Q., Guo, K., Xiang, A.L., Zhu, Y.Y., Nie, L., Yang, Z.M.Computat1nal identificat1n ofnovel microRNAs and targets in Brassica napus.FEBS Lett, 2007, 581:1464 - 1474.)。Huang等(2009)構建鎘脅迫下水稻幼苗的small RNA文庫,克隆了 19個新的miRNA,并發現其中多數miRNA在鎘脅迫下表達發生變化。水稻幼苗根中miR604在鎘處理下表達下調，其靶基因脂轉移蛋白表達上升。而脂轉移蛋白參與植物多種抗逆性反應并介導植物激素信號轉導等過程(Huang, S.Q., Peng, J., Qiu, C.X., Yang, Z.M.Heavy metal-regulatednew microRNAs from rice.J.1norg.B1chem, 2009，103:282e287.)。Kong 等(2010)在擬南芥中克隆得到8個與缺鐵脅迫相關的miRNA,它們在缺鐵條件下均表達上調，并且其中5個MIRNA基因上游的啟動子區經預測存在缺鐵誘導表達調控元件(IDE1/IDE2)(Kong, ff., Yang, Z.M.1dentificat1n of iron—deficiency responsive microRNA genesand cis-elements in Arabidopsis.Plant Phys1l.B1chem, 2010，48:153el59.)oSunkar等(2006)研究發現miR398在擬南芥抵抗強光、重金屬Cu、Fe等氧化脅迫中發揮作用:在氧化脅迫條件下，miR398的表達量被誘導降低，miR398調控的Cu/Zn超氧化物歧化酶(CSDs)mRNA的表達量升高，Cu/Zn超氧化物歧化酶可快速地將超氧化物轉變成過氧化物和分子氧，組成了抵抗高毒性超氧化物的第一道防線，導致擬南芥對重金屬脅迫的耐受性也大大增力口(Sunkar, R., Kapoor, A., Zhu, J.K.Posttranscript1nal induct1n of two Cu/Zn superoxide dismutase genes in Arabidopsis is mediated by downregulat1n ofmiR398and important for oxidative stress tolerance.Plant Cell, 2006,18:2051 -2065.)。


【發明內容】

[0005]本發明的第一個目的是提供一種水稻的miRNA，本發明的第二個目的是提供上述的水稻的miRNA的前體基因，本發明的第三個目的是提供上述的水稻的miRNA和前體基因的應用，本發明的第四個目的是提供一種具有對鎘敏感轉基因水稻的育種方法。
[0006]為了實現上述的第一個目的，本發明采用了以下的技術方案:
[0007]一種水稻的miRNA，其堿基序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]為了實現上述的第二個目的，本發明采用了以下的技術方案:
[0009]上述的水稻的miRNA的前體基因，前體基因的堿基序列如SEQ ID N0.2所示。
[0010]為了實現上述的第三個目的，本發明采用了以下的技術方案:
[0011]本發明還公開了上述的水稻的miRNA或前體基因在水稻鎘脅迫應答調控機制中的應用。
[0012]本發明還公開了上述的前體基因的PMD19-T載體。
[0013]本發明還公開了上述的前體基因的質粒。
[0014]本發明還公開了上述的前體基因的農桿菌感受態細胞EHA105。
[0015]為了實現上述的第四個目的，本發明采用了以下的技術方案:
[0016]一種具有對鎘敏感轉基因水稻的育種方法，該方法包括以下的步驟:將包含上述的前體基因連接到載體上，通過農桿菌介導轉化到水稻愈傷組織，篩選培養，獲得純合的水稻轉基因株系。
[0017]本發明提供了一種miRNA在水稻鎘脅迫應答調控機制中的應用。
[0018](或者:miR268在水稻鋪脅迫應答調控機制中的應用)。
[0019]所述水稻miRNA的堿基序列如SEQ ID N0.1所示。
[0020]優選的，所述植物為水稻。
[0021]將包含所述水稻miRNA的前體基因連接到載體上，通過農桿菌介導轉化到水稻愈傷組織，篩選培養，獲得純合的水稻轉基因株系。
[0022]由于miRNA本身序列很短，只有20幾個bp，而前體序列相對較長，連接到載體上，有利于轉化實現，優選的，所述前體基因的堿基序列如SEQ ID N0.2所示。
[0023]本發明通過將水稻miR268轉化到水稻愈傷組織，將獲得的T2代種子播種在含鎘培養基中，發現過表達miR268的水稻植株對鎘敏感。
[0024]我們課題組利用高通量、高特異性和高靈敏度的miRNA芯片及生物信息學等方法，在水稻幼苗根中篩選得到一種新的miRNA——miR268 (這個是根據芯片探針信息自己命名的，數據庫中還沒有這一條miRNA)在鎘脅迫下表達受到顯著上調。并利用RT-PCR進一步驗證了這一結果，證實了 miR268在鎘脅迫下的差異表達。經miRU軟件預測，miR268的靶基因為天然抗性相關巨噬細胞蛋白(Nramp)。熒光定量PCR檢測miR268及其靶基因Nramp在鎘脅迫下的表達，發現miR268與Nramp的表達具有此消彼長的關系，從而實驗驗證了 Nramp是miR268的祀基因。Nramp成員在各種生物中普遍存在，負責猛、鋅、銅、鐵、鎘等二價金屬離子的運輸。水稻中Nramp家族有5個成員，它們是植物重金屬響應網絡中的重要成員。有研究報道顯示Nramp5主要負責猛和鎘吸收及運輸,減少鎘含量的同時，猛含量也大幅下降(Sasaki, A., Yamaji, N., Yokosho, K., Ma, J.F.Nramp5is amajor transporter responsible for manganese and cadmium uptake in rice.PlantCell,2012，24:2155-2167.)
[0025]本發明進而通過包含所述水稻miRNA的前體基因連接到載體上，通過農桿菌介導轉化到水稻愈傷組織，篩選培養，獲得純合的水稻轉基因株系。通過轉基因手段發現該miRNA具有顯著增加水稻對鎘敏感性的作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為7天齡水稻幼苗60uM Cd脅迫6h根的miRNA芯片圖譜，(Cy3對照；Cy5處理樣品)；
[0027]圖2為7天齡水稻幼苗60 μ M Cd脅迫下6h根中miR268的RT PCR圖(Control對照；Cd處理樣品)；
[0028]圖3為miR268過表達載體構建的過程凝膠圖譜。a.miR268前體PCR擴增凝膠圖譜；b.pMD19-T-miR268質粒酶切鑒定圖；c.pl301_miR268重組質粒菌液PCR擴增凝膠圖譜；d.pl301-miR268重組質粒酶切鑒定圖；
[0029]圖4為miR268過表達水稻種子在60uM Cd處理下萌發7d后表型，(WT對照；35S:MIR268轉基因水稻)；

【具體實施方式】
[0030]實施例1基因的犾得
[0031]以野生型水稻(中花11)七天苗齡幼苗為材料，取60uM CdCl2處理6h和對照組(未處理)的根0.1g,用液氮研磨并加入Iml Trizol (Invitrogen生產)繼續研磨至勻衆，轉入1.5ml離心管中，12000 Xg離心1min,收集上清至新離心管中。室溫放置5min,加入0.2ml氯仿用力震蕩15s，使溶液充分混勻。室溫放置5min，12000Xg離心15min，收集上清。加兩倍上清體積的異丙醇，-20°C過夜沉淀。12000Xg離心1min,去上清,加ImL預冷的75%乙醇(DEPC-H2O配制)洗沉淀。12000 Xg離心lOmin，倒盡液體，室溫干燥5min，沉淀重溶于50 μ L DEPC (焦碳酸二乙酯)水。取2 μ g Total RNA進行電泳檢測，并稀釋樣品測 0D260/280，OD 260/230 及濃度。利用 2-5 μ g 總 RNA 樣品，通過 YM-100 (Millipore)微離心過濾柱得到片段小于300nt的小RNA。Poly(A)聚合酶在分離到的小RNA 3 ;端加上poly (A)尾巴,再將一個寡聚核苷酸標記與這個poly (A)尾巴連接，(ligat1n)用于后續的熒光標記。用兩個不同的標記物Cy3和Cy5來標記處理組和對照組的兩個RNA樣品。
[0032]利用Lindow等(2007)預測的2100條miRNA序列以及水稻miRNA數據庫(miRBaseRelease 11.0, http://microrna.sanger.ac.uk)中的 miRNA 序列，原位合成 miRNA 芯片，檢測生長第七天的水稻在重金屬鎘脅迫6h根組織中miRNA的表達情況。經60 μ M鎘處理6h后的7天齡水稻幼苗的根，采用Trizol法提取總RNA，提純miRNA后，熒光標記，與miRNA芯片雜交，經芯片掃描，數據采集分析，尋找表達水平上調或者下調較顯著的miRNA。芯片結果顯示(圖1)，在Lindow等(2007)生物信息學預測的miRNA中，miR268在Cd處理6h后表達量比對照(未處理)提高2倍以上。
[0033]根據TIGR數據庫，發現水稻miR268位于4號染色體，來源于基因間區域。成熟序列如SEQ ID N0.1所示，前體序列如SEQ ID N0.2所示。
[0034]成熟序列CCAGTCAGGGGCTCGTTGCTGG
[0035]前體序列
[0036]TGGTTTCCAGCCGGGGGCTCCTGATTAGCACCGACTCTAGCTTCGGCTGACTGGTTTCCAGTCAGGGGCTCGTTGCTGGGTTCTA(85bp)
[0037]根據miRU祀基因預測軟件發現miR268祀向天然抗性相關巨卩遼細胞蛋白(Nramp)。并且采用熒光定量PCR檢測miR268和Nramp在鎘脅迫下的表達，發現miR268與Nramp的表達具有此消彼長的關系，從而實驗驗證了 Nramp是miR268的祀基因(圖2)。
[0038]具體操作如下:
[0039]以野生型水稻(中花11)七天苗齡幼苗為材料，取60uM CdCl2處理6h和對照組(未處理)的根采用Trizol法提取RNA,并用RNase-free DNase I (TaKara)消化以去除 DNA 污染。用反轉錄試劑盒 PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara)逆轉錄成 cDNA。反應體系為 20μ 1，分別為 2μ g RNA, I μ I Oligo dT Primer (50 μ Μ),
Iμ I dNTP Mixture(1mM)和 RNase free H2O 至 10 μ 1，65°C 5min，冰上急冷，然后依次加A 4 μ I 5XPrimeScript Buffer,0.5 μ I RNase Inhibitor (40U/μ I),I μ I PrimeScriptRTase (200U/μ I)和 4.5 μ I RNase free dH20,輕微混合均勻，42 °C 60min,70°C 15min,最后-20 °C保存。然后以第一鏈cDNA為摸板擴增miR268和Nramp，PCR反應程序:預變性，95°C Imin ;PCR反應，第一步:94°C變性1s ;第二步:55°C退火延伸15s ;第三步:72°C15s。同時在退火過程中檢測熒光信號變化，共進行45個循環。采用2_66^相對定量法計算基因的相對表達量。以β-actin作為內參，β-actin的正向引物序列:5，-GCCGTCCTCTCTCTGTATGC-3 ’，反向引物序列:5 ’ -GGGGACAGTGTGGCTGAC-3，。使用的 PCR擴增引物如下:
[0040]miR268-F，5’-GATTAGCACCGACTCTA-3’ ；
[0041]miR268-R，5’-GAAGCCATCTGACATAG-3’ ；
[0042]Nramp (0s03gl 1010) - F，5’ -CTTCATCTTTTTATTCCTG-3’ ；
[0043]Nramp(0s03gll010) - R，5’ -TTGTTTGTGTCAATCTTCC-3’。
[0044]實施例2基因克隆與轉化
[0045]以野生型水稻中花11七天苗齡幼苗DNA為模板，利用PCR方法擴增到miR268前體基因的序列。具體操作如下:首先，提取野生型水稻中花11七天齡幼苗DNA。取約0.2g水稻葉片用液氮研磨成粉末，轉移粉末到加有500 μ I提取液(10mM Tris-HCl,pH 8.0 ；20mMEDTA ；500mM NaCl)的離心管中，輕輕混勻。向管中加入ΙΟΟμΙ 10% SDS溶液，混勻，65°C保溫20min。然后加氯仿/異戊醇/乙醇(20:1:4)混合液600 μ I,室溫靜止lOmin。4°C,12000rpm離心lOmin，轉移上清至另一離心管中。加入Iml預冷的無水乙醇充分混勻，_20°C沉淀DNA 20min。4°C, 12000rpm離心lOmin,棄上清,加70 %乙醇500 μ I進行洗漆。4°C,12000rpm離心lOmin，棄上清。輕微離心，用移液器將殘留液體吸干。吹干DNA沉淀后，溶于 100μ I 含 RNase 酶(10μ g/ml)TE 中，37°C 水浴 30min，_20°C 保存。根據 miR268 前體序列，在database中查閱其所在基因組位點的兩端的序列，分別在前體發夾結構兩端約50bp處設計引物，所設引物如下:
[0046]miR268-F, 5，-CGGGGTACCTAACAGGAGAGCTGGACC-3 ’
[0047]miR268-R,5’-AACTGCAGCATCCGAGTGACAATCAG-3’
[0048]接著以DNA為摸板，利用所設引物擴增miR268前體基因。PCR反應體系為50μ 1，依次加入 DNA 模板 I μ 1U0XPCR buffer 5μ IUOmM dNTPs 4μ1、10μΜ 正向弓I物(miR268-F) 0.8 μ 1、10 μ M 反向引物(miR268_R) 0.8 μ 1、TaKaRa Taq (5U/ μ I)聚合酶
0.5μ 1，最后加ddH20補至50μ I。PCR反應條件:預變性94°C 5min，變性94°C 30s，退火59°C 30s，延伸72°C 30s，30個循環，最后延伸72°C 10min，4°C保存。PCR產物凝膠圖譜如圖3.a所示。
[0049]擴增后將miR268前體基因DNA產物，利用天根生化科技(北京)有限公司生產的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收,操作如下:將DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下放入1.5ml的Eppendorf管中，稱取重量。加入6倍體積溶膠液PN，50°C水浴放置30min。將溶膠液加入吸附柱CA2中，室溫放置2min，12000rpm離心60s，倒掉收集管中的廢液。加入600 μ I漂洗液PW，12000rpm離心60s，倒掉收集管中的廢液。12000rpm離心2min，室溫放置數分鐘徹底晾干。將吸附柱CA2放到一個干凈離心管中，加入40 μ I洗脫緩沖液EB，12000rpm離心2min收集DNA溶液。
[0050]將回收的miR268前體基因DNA與pMD19-T載體(TakaRa)進行連接反應，連接體系10 μ 1，分別加入 0.5 μ I PMD19-T 載體、4.5μ I 純化的 miR268 前體的 DNA、5y I Solut1n
I。16°C下連接3h后將連接產物轉化到大腸桿菌DH5a感受態細胞中。通過Amp篩選，挑取陽性克隆，經PCR反應驗證及測序鑒定正確后，選取正確的菌液提取質粒pMD19-miR268。利用天根公司生產的普通質粒小提試劑盒提取質粒操作如下:
[0051]取3ml菌液加入離心管中，12000rpm離心lmin，盡量吸出上清液。向留有菌體沉淀的離心管中加入250 μ I的溶液Pl (含RNaseA)，徹底懸浮細菌沉淀。加入250 μ I溶液Ρ2，溫和的上下翻轉6-8次使菌體充分裂解。加入350 μ I溶液Ρ3，立即溫和的上下翻轉6_8次，充分混勻，12000rpm離心lOmin。收集上清液,轉移到吸附柱CP3中，12000rpm離心60s,倒掉廢液。加入600 μ I已加入無水乙醇的漂洗液PW，12000rpm離心60s，倒掉廢液并漂洗兩次。將吸附柱CP3放入收集管，12000rpm離心2min，置于室溫徹底晾干。加入55 μ I洗脫緩沖液ΕΒ，室溫放置2min，12000rpm離心lmin，將質粒溶液收集到離心管中。
[0052]將提取的質粒pMD19-miR268和DNA雙元質粒載體pCAMBIA1301同時都用TakaRa公司生產的KpnI和PstI進行雙酶切。酶切體系50μ 1，包括5μ I 1XM buffer, 28 μ IpMD19-miR268 質粒(或 pCAMBIA1301 質粒)、1μ I KpnIU μ I PstI 和 15μ1 ddH20，37°C水浴過夜。pMD19-miR268質粒酶切結果如圖3.b所示。將DNA雙元質粒載體pCAMBIA1301和克隆質粒pMD19-miR268酶切后，割膠回收DNA片段。接著用T4連接酶連接，連接體系1(^1，包括1“1 pCAMBIA1301 載體、7.5μ I miR268DNA、I μ I 10 X Τ4 連接酶 buffer 和
0.5μ I Τ4連接酶，16°C連接過夜。然后將連接產物轉化到大腸桿菌DH5 α感受態細胞中，進行菌液PCR，并提取質粒進行酶切鑒定，結果如圖3.c和圖3.d所示。將正確的植物表達載體pl301-miR268導入農桿菌感受態細胞EHA105，操作如下:取200 μ I農桿菌感受態細胞，加入I μ g pl301-miR268質粒，混勻，冰浴5min，液氮中速凍5min，37°C水浴5min，然后加入Iml YM培養基28°C恢復培養4h。1000g離心30s，棄上清，吸200 μ I菌液涂布于含有50mg/L卡那霉素和40 μ g/1利福平的YM平板，28°C培養，約48h后長出農桿菌單菌落。搖菌，提取農桿菌質粒DNA重新轉入大腸桿菌DH5 α中，再提取質粒進行酶切鑒定。
[0053]經鑒定正確的陽性質粒pl301_miR268，通過農桿菌介導法轉化到水稻愈傷。操作如下:首先活化農桿菌，在含50mg/L卡那霉素和40mg/L利福平的YM培養基上劃線，28°C暗培養。收集農桿菌菌體，將其懸浮于含有200 μ M已酰丁香酮(As)的AAM液體懸浮培養基中。調整菌體濃度至0D600為0.8?1.0，倒入含繼代培養I周的水稻愈傷組織的無菌三角瓶，侵染lOmin，并不時晃動。然后將愈傷組織置于無菌的濾紙上浙干30min后，置于鋪有一層無菌濾紙的固體共培養培養基上，25°C暗培養3天。將共培養后的愈傷組織用無菌水清洗5-6次,再用含500mg/L頭孢拉定的無菌水清洗I?2遍,置于無菌濾紙上浙干I小時。將晾干的愈傷轉入含500mg/L頭孢拉定和50mg/L潮霉素的選擇培養基上進行第一輪選擇，280C，暗培養14天。然后將長有抗性愈傷的初始愈傷轉到新的含500mg/L頭孢拉定和50mg/L潮霉素的培養基上進行第二輪選擇，28°C，光照培養，直到顆粒性的抗性愈傷組織長出。選擇生長旺盛的抗性愈傷組織轉移到含有潮霉素的分化培養基上，于25°C，12h光照/12h黑暗條件下培養。待再生小苗長成約Icm高時，將其移到生根培養基上壯苗，25°C，12h光照/12h黑暗條件下培養。最后將轉基因苗挑出，加入適量蒸餾水煉苗3天至一周左右，洗去瓊脂，培養箱水培I周，移栽到溫室的土缽中生長。挑選生長正常的植株，進行潮霉素PCR篩選和⑶S染色，獲得陽性TO代植株，共21個株系。收獲Tl代種子繁種并鑒定至T2代，獲得純合的轉基因株系。
[0054]實施例3miRNA鎘脅迫應答的調控功能鑒定
[0055]取T2代轉基因株系種子和中花11野生型的種子，I %稀HNO3破休眠處理16h。倒去稀HNO3,10% NaClO(有效氯約I?1.2% )消毒20min后用蒸餾水沖洗。將種子浸泡在水中，37°C暗處催芽約兩天，再在鋪有濕潤濾紙的培養皿中培養一天至露白。挑選生長一致的露白的轉基因株系和野生型的種子(胚芽2mm)，同時轉移入0uM、60uM CdCl2UOOuM CdCl2的瓊脂培養基上(每個培養皿中左邊是野生型水稻種子，右邊是轉基因水稻種子)。置于光照培養箱中培養7天后(白天/黑夜:28°C /22°C，13h/llh)，觀察轉基因株系與野生型水稻種子的萌發情況。如圖4所示，在鎘不處理條件下，轉基因株系與野生型水稻種子的萌發情況基本一致。而60 μ M和100 μ M CdCl2處理7天顯著抑制水稻種子的萌發，葉和根的長度降低，根的數目也顯著減少。并且，在60uM CdCl2和10uM CdCl2處理下，miR268過表達的轉基因幼苗相比野生型幼苗，生物量、葉長度、根的數目及和長度都顯著降低，說明miR268超量表達增加了對鎘的敏感性。
【權利要求】
1.一種水稻的miRNA，其堿基序列如SEQ ID N0.1所示。
2.權利要求1所述的水稻的miRNA的前體基因，前體基因的堿基序列如SEQID N0.2所示。
3.權利要求1所述的水稻的miRNA或權利要求2所述的前體基因在水稻鎘脅迫應答調控機制中的應用。
4.含有權利要求2所述的前體基因的PMD19-T載體。
5.含有權利要求2所述的前體基因的質粒。
6.含有權利要求2所述的前體基因的農桿菌感受態細胞EHA105。
7.一種具有對鎘敏感轉基因水稻的育種方法，其特征在于該方法包括以下的步驟:將包含權利要求2所述的前體基因連接到載體上，通過農桿菌介導轉化到水稻愈傷組織，篩選培養，獲得純合的水稻轉基因株系。
8.根據權利要求7所述的一種具有對鎘敏感轉基因水稻的育種方法，其特征在于該方法包括以下的步驟: 1)提取野生型水稻中花11七天齡幼苗DNA: 取約0.2g水稻葉片用液氮研磨成粉末，轉移粉末到加有500 μ I提取液的離心管中，提取液包括 10mM Tris-HCl，pH 8.0 ；20mM EDTA ；500mM NaCl，輕輕混勻；向管中加入 100 μ I10%505溶液，混勻，651:保溫201^11 ;然后加氯仿/異戊醇/乙醇(20:1:4)混合液600 μ 1，氯仿/異戍醇/乙醇體積比為20:1:4，室溫靜止1min ；4°C, 12000rpm離心1min,轉移上清至另一離心管中。加入Iml預冷的無水乙醇充分混勻，_20°C沉淀DNA 20min ；4°C, 12000rpm離心1min,棄上清,加70%乙醇500 μ I進行洗漆；4°C, 12000rpm離心1min,棄上清；輕微離心，用移液器將殘留液體吸干；吹干DNA沉淀后，溶于100 μ I含RNase酶TE中，RNase酶的濃度為10 μ g/ml,37°C水浴30min, _20°C保存；根據miR268前體序列，在database中查閱其所在基因組位點的兩端的序列，分別在前體發夾結構兩端約50bp處設計引物，所設引物如下:
miR268-F，5’ -CGGGGTACCTAACAGGAGAGCTGGACC-3 ’
miR268-R,5’-AACTGCAGCATCCGAGTGACAATCAG-3’ ； 2)接著以DNA為摸板，利用所設引物擴增miR268前體基因: PCR反應體系為50 μ 1，依次加入DNA模板1μ 1U0XPCR buffer 5 μ IUOmMdNTPs4 μ 1、10μΜ 正向引物 miR268-F 0.8 μ 1、10 μ M 反向引物 miR268_R 0.8 μ 1、5υ/μ I 的TaKaRa Taq聚合酶0.5 μ 1，最后加ddH20補至50 μ I ；PCR反應條件:預變性94°C 5min,變性94°C 30s，退火59°C 30s,延伸72°C 30s, 30個循環，最后延伸72°C 1min, 4°C保存； 3)擴增后將miR268前體基因DNA產物，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收，操作如下: 將DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下放入1.5ml的Eppendorf管中，稱取重量；加入6倍體積溶膠液PN，50°C水浴放置30min ;將溶膠液加入吸附柱CA2中，室溫放置2min，12000rpm離心60s，倒掉收集管中的廢液；加入600 μ I漂洗液PW，12000rpm離心60s，倒掉收集管中的廢液；12000rpm離心2min，室溫放置數分鐘徹底晾干；將吸附柱CA2放到一個干凈離心管中，加入40 μ I洗脫緩沖液EB，12000rpm離心2min收集DNA溶液； 4)將回收的miR268前體基因DNA與pMD19_T載體TakaRa進行連接反應: 連接體系10 μ 1，分別加入0.5 μ I PMD19-T載體、4.5 μ I純化的miR268前體的DNA、5μ I Solut1n I ;16°C下連接3h后將連接產物轉化到大腸桿菌DH5a感受態細胞中；通過Amp篩選，挑取陽性克隆，經PCR反應驗證及測序鑒定正確后，選取正確的菌液提取質粒pMD19-miR268 ； 5)將提取的質粒pMD19-miR268和DNA雙元質粒載體pCAMBIA1301同時都用TakaRa公司生產的KpnI和PstI進行雙酶切: 酶切體系 50μ 1，包括 5μ I 1XM buffer, 28 μ I pMD19_miR268 質粒或 pCAMBIA1301質粒、I μ I KpnIU μ I PstI和15 μ I ddH20, 37 °C水浴過夜；將DNA雙元質粒載體PCAMBIA1301和克隆質粒pMD19_miR268酶切后，割膠回收DNA片段。接著用T4連接酶連接，連接體系 10 μ 1，包括1μ I pCAMBIA1301 載體、7.5μ I miR268DNA、I μ I 10ΧΤ4 連接酶buffer和0.5 μ I Τ4連接酶，16°C連接過夜；然后將連接產物轉化到大腸桿菌DH5 α感受態細胞中，進行菌液PCR，并提取質粒進行酶切鑒定，將正確的植物表達載體pl301-miR268導入農桿菌感受態細胞EHA105 ； 6)經鑒定正確的陽性質粒pl301-miR268，通過農桿菌介導法轉化到水稻愈傷，操作如下: 首先活化農桿菌，在含50mg/L卡那霉素和40mg/L利福平的YM培養基上劃線，28°C暗培養；收集農桿菌菌體，將其懸浮于含有200 μ M已酰丁香酮的AAM液體懸浮培養基中；調整菌體濃度至0D600為0.8?1.0，倒入含繼代培養I周的水稻愈傷組織的無菌三角瓶，侵染lOmin，并不時晃動；然后將愈傷組織置于無菌的濾紙上浙干30min后，置于鋪有一層無菌濾紙的固體共培養培養基上，25°C暗培養3天；將共培養后的愈傷組織用無菌水清洗5-6次，再用含500mg/L頭孢拉定的無菌水清洗I?2遍，置于無菌濾紙上浙干I小時；將晾干的愈傷轉入含500mg/L頭孢拉定和50mg/L潮霉素的選擇培養基上進行第一輪選擇，28°C，暗培養14天；然后將長有抗性愈傷的初始愈傷轉到新的含500mg/L頭孢拉定和50mg/L潮霉素的培養基上進行第二輪選擇，28°C，光照培養，直到顆粒性的抗性愈傷組織長出；選擇生長旺盛的抗性愈傷組織轉移到含有潮霉素的分化培養基上，于25°C，12h光照/12h黑暗條件下培養；待再生小苗長成約Icm高時，將其移到生根培養基上壯苗，25°C，12h光照/12h黑暗條件下培養；最后將轉基因苗挑出，加入適量蒸餾水煉苗3天至一周，洗去瓊脂，培養箱水培I周，移栽到溫室的土缽中生長；挑選生長正常的植株，進行潮霉素PCR篩選和⑶S染色，獲得陽性TO代植株，共21個株系；收獲Tl代種子繁種并鑒定至T2代，獲得純合的轉基因株系。
9.根據權利要求8所述的一種具有對鎘敏感轉基因水稻的育種方法，其特征在于利用普通質粒小提試劑盒提取質粒操作如下:取3ml菌液加入離心管中，12000rpm離心Imin,盡量吸出上清液；向留有菌體沉淀的離心管中加入250 μ I的含RNaseA溶液Pl，徹底懸浮細菌沉淀；加入250 μ I溶液Ρ2，溫和的上下翻轉6-8次使菌體充分裂解；加入350μ I溶液Ρ3，立即溫和的上下翻轉6-8次，充分混勻，12000rpm離心1min ;收集上清液，轉移到吸附柱CP3中，12000rpm離心60s，倒掉廢液;加入600 μ I已加入無水乙醇的漂洗液PW，12000rpm離心60s,倒掉廢液并漂洗兩次；將吸附柱CP3放入收集管，12000rpm離心2min,置于室溫徹底晾干；加入55 μ I洗脫緩沖液ΕΒ，室溫放置2min，12000rpm離心lmin，將質粒溶液收集到離心管中。
10.根據權利要求8所述的一種具有對鎘敏感轉基因水稻的育種方法，其特征在于pl301-miR268導入農桿菌感受態細胞EHA105的操作方法如下:取200 μ I農桿菌感受態細胞，加入I μ g pl301-miR268質粒，混勻，冰浴5min，液氮中速凍5min，37°C水浴5min，然后加入Iml YM培養基28°C恢復培養4h ; 1000g離心30s，棄上清，吸200 μ I菌液涂布于含有50mg/L卡那霉素和40μ g/Ι利福平的YM平板，28°C培養，約48h后長出農桿菌單菌落；搖菌，提取農桿菌質粒DNA重新轉入大腸桿菌DH5 α中，再提取質粒進行酶切鑒定。
【文檔編號】C12N15/84GK104263730SQ201410519370
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月30日 優先權日:2014年9月30日
【發明者】丁艷菲, 朱誠, 王飛娟, 江瓊, 孫駿威 申請人:中國計量學院