酶的制作方法
【專利摘要】本發明涉及酶和方法。尤其描述了用編碼細菌肌醇六磷酸酶和其變體的核酸轉化或轉染的宿主細胞。
NCIMB 41248
20040922
【專利說明】酶
[0001] 本申請是申請日為2005年10月17日，題為"酶"的中國專利申請201210119320. X(其母案為中國專利申請200580035619. 5號）的分案申請。
[0002] 本發明涉及肌醇六磷酸酶（phytase)，其核苷酸序列，肌醇六磷酸酶的生產方法和 其用途。 發明領域
[0003] 本發明涉及用于飼料添加劑的酶領域。更具體地，本發明涉及可用于增強食物和 動物飼料中磷酸酯消化的肌醇六磷酸酶。
[0004] 技術背景和現有技術
[0005] 肌醇六磷酸（phytate)為谷物和豆類中磷的主要存儲形式。然而，單胃動物如豬、 家禽和魚不能代謝或吸收肌醇六磷酸（或植酸（phytic acid))，并且因此將其排泄，導致 家畜高產區的磷污染。而且，肌醇六磷酸也通過螯合金屬制劑如鈣、銅和鋅而在單胃動物中 作為抗營養劑。
[0006] 為了提供給這些動物生長和健康足夠的磷酸酯，向其飲食中添加無機磷酸酯。這 種添加是昂貴的，并且進一步增加污染問題。
[0007] 通過肌醇六磷酸酶的作用，肌醇六磷酸通常由其水解，而產生低級肌醇磷酸酯和 無機磷酸酯。肌醇六磷酸酶可用作動物飼料的添加劑，在其中改善動物對有機磷的利用 率，并且減少環境的磷酸鹽（醋）（phosphate)污染（Wodzinski RJ，Ullah AH.Adv Appl Microbiol. 42, 263-302(1996))〇
[0008] 許多真菌（Wyss M?等? Appl. Environ. Microbiol. 65 (2)，367-373 (1999) Berka R.M?等.Appl. Environ. Microbiol. 64 (11)，4423-4427 (1998) ;Lassen S?等.Appl. Environ.Microbiol. 67 (10)，4701_4707 (2001))和細菌（Greiner R?等.Arch. Biochem. Biophys.303 (1)，107-113 (1993) ;Kerovuo 等.Appl.Environ.Microbiol.64 (6)， 2079-2085(1998) ;Kim H.W?等.Biotechnol.Lett.25,1231-1234(2003) ;Greiner R?等.Arch. Biochem. Biophys. 341 (2)，201-206 (1997) ;Yoon S.J?等.Enzyme and microbial technol.18,449-454(1996) ;Zinin N.V?等.FEMS Microbiol. Lett. 236， 283-290 (2004)))來源的肌醇六磷酸酶已在文獻中描述。
[0009] 然而迄今為止，這些肌醇六磷酸酶沒有一種呈現有效用作動物飼料補充物所需 的特性。尤其，真菌肌醇六磷酸酶傾向于是蛋白水解不穩定的（Igbasan F. A.等.Arch. Anim. Nutr. 53,353-373(2000))，并且因此易受降解，而大多數細菌肌醇六磷酸酶僅對肌 醇六磷酸具有窄的底物特異性，并且很難降解中間程度磷酸化的肌醇磷酸酯（Greiner R?等?，Arch. Biochem. Biophys. 303(1)，107-113(1993) ;Kerovuo J 等? Biochem. J. 352， 623-628(2000))〇
[0010] 因此存在對改進的肌醇六磷酸酶的需求。 發明概要
[0011] 在寬泛的方面，本發明涉及源自細菌的肌醇六磷酸酶以及其修飾的形式。本發明 尤其涉及源自細菌布丘氏菌屬（Buttiauxella sp.)的肌醇六磷酸酶，以及其變體/修飾形 式，所述變體/修飾形式針對與野生型（親本）酶相比的改進特性進行選擇和/或改造。
[0012] 本發明因為提供新的肌醇六磷酸酶而是有益的，所述新的肌醇六磷酸酶具有使其 作為飼料酶特別有用和有效的特性。本發明尤其涉及如本文所述的分離的和/或純化的新 肌醇六磷酸酶多肽，或其功能片段，或變體，或其修飾形式，或其修飾形式。本發明還提供編 碼所述肌醇六磷酸酶的核酸序列。
[0013] 為了有效用作食物或動物飼料的酶添加劑，該肌醇六磷酸酶必須組合許多不同的 特性。為了能降解動物胃的酸性環境中的植酸，其必須在低pH有活性，優選在大范圍的pH 值中有活性。此外，其必須具有高的特異性活性和優選高的熱穩定性，以使得蛋白質經得住 在飼料如飼料團粒的制備中常用的高溫。
[0014]同樣重要的是酶具有廣泛的底物特異性，所述底物特異性允許其不僅水解肌醇六 磷酸，而且水解肌醇六磷酸降解的中間產物，如肌醇五磷酸、肌醇四磷酸和肌醇三磷酸。對 豬中肌醇六磷酸降解的研宄表明這些肌醇寡磷酸酯另外在小和大腸中基本上維持不溶，并 且因此難以被該動物和腸道微生物群落產生的堿性磷酸酶接近（Schlemmer U.等.Arch. Anim.Nutr. 55,255-280(2001))。已鑒定了不同酶在底物特異性譜上的變化。例如，由來自 枯草芽孢桿菌（B. subtilis)的肌醇六磷酸酶產生的肌醇三磷酸基本上耐受該酶的進一步 水解[Kerovuo J?等.Biochem J. 352,623-628 (2000)]。
[0015] 在本發明的另一個方面，提供了質粒或載體系統，或轉化的或轉基因生物體，其包 括如本文所述的新肌醇六磷酸酶或其修飾形式。
[0016] 本發明的另一個方面涉及轉基因生物體，其被修飾以表達如本文所述的新肌醇六 磷酸酶或其修飾形式，并且因此能產生肌醇六磷酸酶。本發明進一步提供用于肌醇六磷酸 酶生物技術生產的手段和方法，以及其作為飼料添加劑的用途。
[0017] 本發明的各方面存在于權利要求和下列注釋中。
[0018] 為便于參考，本發明的這些和更多方面將在合適的章節標題下論述。然而，每一章 節下的教導并不一定限于每一特定的章節。
[0019] 如參照本發明所用的，術語"生產"（"produce"），產生"（"producing"），生 產的"（"produced"）、"可生產的"（"produceable"）、"產物"（"production"）與相應 的術語"制備"（"pr印are"）、"制備"（"pr印aring"）、"制備的"（"pr印ared"）、"制 備"（"preparation"）、"生成的"（"generated"）、"生成"（"generation"）和"可制備 的"（"preparable"）同義。
[0020] 如參照本發明所用的，術語"表達"（"expression"），表達"（"expresses"）、 "表達的"（"expressed"）、"可表達的"（"expressable"）與相應的術語"轉 錄"（"transcription"）、"轉錄"（"transcribes"）、"轉錄的"（"transcribed"）和"可 轉錄的"（"transcribable"）同義。
[0021] 如參照本發明所用的，術語"轉化"（"transformation"）和"轉 染"（"transfection"）指將核酸序列導入宿主、宿主細胞、組織或器官的方法。
[0022] 涉及可用于本發明的核苷酸序列的其他方面包括：包括本發明序列的構建體；包 括用于本發明的序列的載體；包括用于本發明的序列的質粒；包括用于本發明的序列的轉 化細胞；包括用于本發明的序列的轉化組織；包括用于本發明的序列的轉化器官；包括用 于本發明的序列的轉化宿主；包括用于本發明的序列的轉化生物體。本發明還包括利用其 表達用于本發明的核苷酸序列的方法，如在宿主細胞中表達；包括轉移其的方法。本發明進 一步包括分離該核苷酸序列，如從宿主細胞分離的方法。
[0023] 涉及可用于本發明的氨基酸序列的其他方面包括：編碼用于本發明的氨基酸序列 的構建體；編碼用于本發明的氨基酸序列的載體；編碼用于本發明的氨基酸序列的質粒； 表達用于本發明的氨基酸序列的轉化細胞；表達用于本發明的氨基酸序列的轉化組織；表 達用于本發明的氨基酸序列的轉化器官；表達用于本發明的氨基酸序列的轉化宿主；表 達用于本發明的氨基酸序列的轉化生物體。本發明還包括利用其純化用于本發明的氨基酸 序列的方法，如在宿主細胞中表達；包括轉移所述序列，且隨后純化所述序列的方法。
[0024] 附圖簡述
[0025] 圖1顯示了通過DEAE-瓊脂糖層析從布丘氏菌屬（Buttiauxella)Pl_29純化的重 組肌醇六磷酸酶的SDS PAGE分析。該圖呈現了包含布丘氏菌屬肌醇六磷酸酶樣品的泳道 的數字照相圖像的掃描圖。
[0026] 圖2顯示了來自布丘氏菌屬P1-29的肌醇六磷酸酶的pH譜。
[0027] 圖3顯示了來自布丘氏菌屬P1-29的純化的重組肌醇六磷酸酶對不同磷酸化程度 的肌醇磷酸酯組分和模式底物的底物特異性。縮寫：IP6-肌醇六磷酸，IP5, IP4和IP3- 分別指同分異構肌醇五磷酸、肌醇四磷酸和肌醇三磷酸的混合物。Fru P2-果糖1，6_二磷 酸，Fru P1 -果糖6-磷酸。
[0028] SEQ ID NO :1列出獲得用于細菌菌株鑒定的序列。
[0029] SEQ ID NO :2列出包括來自布丘氏菌屬P1-29的肌醇六磷酸酶基因的多核苷酸序 列。
[0030] SEQ ID NO :3列出來自布丘氏菌屬P1-29的肌醇六磷酸酶基因的氨基酸序列。
[0031] 發明詳述
[0032] 本發明的特征為包括對應于布丘氏菌屬肌醇六磷酸酶或其修飾形式、同源物、變 體、功能等同物或有效片段的氨基酸序列的酶。
[0033] 術語"肌醇六磷酸酶"指能催化磷酸酯，包括肌醇六磷酸水解并且釋放無機磷酸酯 的蛋白質或多肽。除肌醇六磷酸外，某些肌醇六磷酸酶能水解至少一些中間程度磷酸化的 肌醇磷酸酯。
[0034] 術語"對應于布丘氏菌屬的肌醇六磷酸酶"指不必從布丘氏菌屬來源獲得的酶。反 而該酶優選必須具有布丘氏菌屬肌醇六磷酸酶的相同的功能特征或序列。例如，布丘氏菌 屬肌醇六磷酸酶可能為源自布丘氏菌屬的變體，但其并不天然存在于布丘氏菌屬物種中。
[0035]布丘氏菌屬包括，Buttiauxella agrestis、Buttiauxella brennerae、 Buttiauxella ferragutiae> Buttiauxella gaviniae> Buttiauxella izardi;U Buttiauxella noackiae、Buttiauxella warmboldiae。布丘氏菌屬物種的菌株可從 DSMZ (German National Resource Centre for Biological Material)得到。肌醇六磷酸 酶優選通過本文所述的方法從布丘氏菌屬鑒定，例如與SEQ ID No 2雜交^優選的用于分 離本發明的多肽和/或多核苷酸的布丘氏菌屬菌株列于實施例中。
[0036] 本發明的術語"野生型肌醇六磷酸酶"或"野生型"描述了具有在自然界中找到的 氨基酸序列的肌醇六磷酸酶。
[0037] 本發明的術語"肌醇六磷酸酶酶變體"、"肌醇六磷酸酶變體"或"變體"描述了具有 源自親本肌醇六磷酸酶氨基酸序列的氨基酸序列、但由于一個或多個氨基酸取代、插入和/ 或缺失而不同的肌醇六磷酸酶，所述氨基酸取代、插入和/或缺失總稱為"突變"。設想對于 進一輪制備肌醇六磷酸酶變體的方法，如分子進化，肌醇六磷酸酶變體可能也是親本肌醇 六磷酸酶。
[0038] 根據本發明，術語"一個或多個同源多肽"，在此也描述為"同源物"，描述了多肽， 優選肌醇六磷酸酶（即"同源肌醇六磷酸酶"或"同源酶"），其與第一多肽/肌醇六磷酸 酶/酶的氨基酸序列相比具有超過75 %序列同一性，優選具有至少80 %、85 %、90 %、95 %、 96%、97%、98%或99%序列同源性。
[0039] 術語"其功能等同物"指該酶必須具有與布丘氏菌屬肌醇六磷酸酶的幾乎相同的 功能特征。術語"修飾形式"或"變體"指該酶已從其原來的形式被修飾，但保留與布丘氏菌 屬肌醇六磷酸酶的相同的酶促功能特征。尤其，術語"變體"或"修飾形式"包括具有源自親 本/野生型肌醇六磷酸酶氨基酸序列的氨基酸序列、并且具有一個或多個氨基酸取代、插 入和/或缺失的肌醇六磷酸酶，所述氨基酸取代、插入和/或缺失總稱為突變。修飾形式或 變體與親本酶相比可能呈現改變的酶特征。優選，修飾形式或變體具有一種或多種下列增 強的表型：提尚的熱穩定性和/或；提尚的蛋白水解（例如胃蛋白酶）穩定性和/或；提尚 的比活和/或；更廣的底物特異性和/或；更廣pH范圍的活性。術語"功能"或"有效"片 段指保留幾乎相同的酶促功能或作用的布丘氏菌屬肌醇六磷酸酶的片段或部分。
[0040] 優選本發明這方面的肌醇六磷酸酶具有與布丘氏菌屬肌醇六磷酸酶相同的序列 或至少75%同一的（同源的）序列。
[0041] 適當地，該酶包括如SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列、或具有其至少75%同一性 (同源性）的序列、或其功能片段。在一優選的實施方案中，本發明提供如SEQ ID NO :3所 示氨基酸序列或具有與其至少75%同一性（同源性）的序列或其有效片段的分離和/或 純化的多肽。當涉及SEQ ID No 3和包括SEQ ID No 3的多肽時，設想這也指表達期間共 加工的或翻譯后加工的的多肽，所述加工例如通過信號肽裂解。翻譯后裂解也可能發生在 C-末端。因此在一優選的實施方案中，其有效片段（也稱為其功能片段）為由天然宿主或 相配的合適表達宿主產生的成熟多肽。
[0042] 在另一實施方案中，肌醇六磷酸酶的特征在于其源自以登錄號NCMB41248保藏 的布丘氏菌屬菌株P1-29。
[0043] 在一優選的實施方案中，本發明涉及根據本發明第一個方面的任何實施方案的肌 醇六磷酸酶，其包括在下列位點（根據SEQ ID No. 3的編號而編號）的一個或多個突變：
[0044] 59、70、122、125、167、193、197、204、209、211、221、223、225、240、242、244、268、 281、289、294、303、336、351。
[0045] 這些位點的特征在于該酶在這些位點的誘變導致所需酶特征的改良。
[0046] 下列取代可以是優選的變體：
【權利要求】
1. 一種多肽，其包含對應于布丘氏菌屬肌醇六磷酸酶或其修飾形式、同源多肽、變體、 功能等同物或有效片段的氨基酸序列。
2. 權利要求1的多肽，其包含如SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列或與其具有至少 75%同一性（同源性），優選具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一 性（同源性）的序列或其功能片段。
3. 權利要求1或2的多肽，其中所述多肽為分離的和/或純化的。
4. 權利要求1-3的多肽，其中所述多肽顯示肌醇六磷酸酶活性。
5. 權利要求1-4的多肽，其特征在于它可獲自、優選源自以登錄號NCMB 41248保藏的 布丘氏菌屬菌株Pl-29。
6. 權利要求4或5的多肽或其功能等同物，其特征在于所述肌醇六磷酸酶具有至少 100,更優選至少200,最優選至少300U/mg的比活，其中所述比活通過將所述肌醇六磷酸酶 在溶液中在37°C的溫度溫育而測定，所述溶液包含溶于200mM醋酸鈉緩沖液、pH4. 5中的 2mM肌醇六磷酸、0. 8mMCaCl2。
7. 權利要求4-6的多肽或其功能等同物，其特征在于所述肌醇六磷酸酶在約pH 3-6， 優選約pH 4-5,最優選約pH 4. 5具有活性最大值，其中所述活性通過將所述肌醇六磷酸酶 在溶液中在37°C的溫度溫育而測定，所述溶液包含溶于200mM醋酸鈉緩沖液中的2mM肌醇 六磷酸、0. 8mM CaCl2。
8. 權利要求1至7中任一項的多肽，其在至少一個下列位點（根據SEQ ID No. 3中的 編號方法進行編號）包含突變：59、70、122、125、167、193、197、204、209、211、221、223、225、 240、242、244、268、281、289、294、303、336 或 351。
9. 權利要求8的多肽，其中所述肌醇六磷酸酶包括一個或多個下列突變： K59A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W 或 Y ; 或町(^、(：、0、￡、卩、6、11、1、1(、1、]\1、隊？、〇、1?、5、￥、1或￥; 或八122(：、0、￡、卩、6、11、1、1(、1、]\1、隊？、〇、1?、5、1\￥、1或￥; 或0125六、(：、￡、卩、6、11、1、1(、1、]\1、隊？、〇、1?、5、1\￥、1或￥; 或！167六、(：、0、￡、卩、6、11、1、1(、1、]\1、隊？、〇、1?、5、￥、1或￥; 或11193六、(：、0、￡、卩、6、1、1(、1、]\1、隊？、〇、1?、5、1\￥、1或￥; 或卩197六、(：、0、￡、6、11、1、1(、1、]\1、隊？、〇、1?、5、1\￥、1或￥; 或丁204六、(：、0、￡、卩、6、11、1、1(、1、]\1、隊？、〇、1?、5、￥、1或￥; 或丁209六、(：、0、￡、卩、6、11、1、1(、1、]\1、隊？、〇、1?、5、￥、1或￥; 或八211(：、0、￡、卩、6、11、1、1(、1、]\1、隊？、〇、1?、5、1\￥、1或￥; 或522認、(：、0、￡、卩、11、1、1(、1、]\1、隊？、〇、1?、5、1\￥、1或￥; 或 D223A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W 或 Y ; 或6225六、(：、0、￡、卩、6、11、1、1(、1、]\1、隊？、〇、1?、1\￥、1或￥; 或1(24(^、(：、0、￡、卩、6、11、1、1、]\1、隊？、〇、1?、5、1\￥、1或￥; 或八242(：、0、￡、卩、6、11、1、1(、1、]\1、隊？、〇、1?、5、1\￥、1或￥; 或0244六、(：、￡、卩、6、11、1、1(、1、]\1、隊？、〇、1?、5、1\￥、1或￥; 或八268(：、0、￡、卩、6、11、1、1(、1、]\1、隊？、〇、1?、5、1\￥、1或￥; 或528認、(：、0、￡、卩、6、11、1、1(、]\1、隊？、〇、1?、5、1\￥、1或￥; 或〇289六、(：、0、￡、卩、6、11、1、1(、1、]\1、隊？、1?、5、1\￥、1或￥; 或八294(：、0、￡、卩、6、11、1、1(、1、]\1、隊？、〇、1?、5、1\￥、1或￥; 或吧03六、(：、0、￡、卩、6、11、1、1(、1、]\1、？、〇、1?、5、1\￥、1或￥; 或 1336六、(：、0、￡、卩、6、11、1(、1、]\1、隊？、〇、1?、5、1\￥、1或￥; 或吧5認、(：、0、￡、卩、6、11、1、1(、1、]\1、？、〇、1?、5、1\￥、1或￥。
10. 權利要求8或9的多肽/肌醇六磷酸酶，其包括選自下組的至少一個突變：K59E; T167V ;K240T ;T167I ;K240E ;D244C ;Q289Y ;T209K 或 F197S。
11. 權利要求8至10的多肽/肌醇六磷酸酶，其包括選自下組的突變組合： D125E/H193R ;或 A294E/N303K ;或 T167I/K240T ;或 D223E/K240E/N351D ;或 T167I/K240T/A294E/N303K ;或 T167I/K240E/A242S/A294E/N303K ;或 A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A294E/N303K ;或 A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A242S/S281L/Q289Y/A294E/N303K ;或 A122T/D125E/H193R/F197S/T209K/A211P/S221N/G225A/K240E/A294E/N303K ;或 D125E/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K ； 或 A122T/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K/ I336F 或 N70Y/D125E/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/ N303K〇
12. 權利要求8至11的多肽/肌醇六磷酸酶，其中所述分離的多肽或肌醇六磷酸酶為 改良的肌醇六磷酸酶變體，其與親本肌醇六磷酸酶相比具有選自以下的一個或多個改良的 特性： i. 更高的熱穩定性和/或 ii. 比活和/或 iii. 蛋白水解穩定性。
13. 選自以下的分離的核酸分子： i) 編碼權利要求1至12任一項的肌醇六磷酸酶的分離的核酸分子； ii) 核酸，其在中等嚴謹度條件下，優選高或很高的嚴謹度條件下與編碼SEQ ID No. 3 的多肽或其同源物的核酸雜交； iii) 分離的核酸分子，其包括SEQ ID NO: 2所示的序列或其同源物； iv) 核酸，其在中等嚴謹度條件下，優選高或很高的嚴謹度條件下與SEQ ID No. 2或其 互補序列雜交。
14. 權利要求13的分離的核酸分子，其編碼多肽，所述多肽包括如SEQ ID N0:3所示的 氨基酸序列或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性（同源性）的 序列或其有效片段。
15. 權利要求13或14的分離的核酸分子，其包括核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQ ID NO. 2相同或互補或包含SEQ ID NO. 2的任何密碼子的任何合適的密碼子取代或包括與 SEQ ID肌2具有至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同源性的序列。
16. 權利要求13至15的分離的核酸分子，其中所述核酸分子編碼權利要求8至12的 多肽。
17. 質粒或載體系統，其包括權利要求13至16的核苷酸。
18. 權利要求17的質粒或載體系統，其中所述質粒或載體系統為微生物中用于表達權 利要求1至12的任一種酶的表達載體，和/或包括權利要求13至16的多核苷酸。
19. 用權利要求17或18任一項的質粒或載體系統轉化或轉染的宿主細胞。
20. 權利要求19的宿主細胞，其包含肌醇六磷酸酶，所述肌醇六磷酸酶包含如SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列或其功能片段，或與其至少75%同源的同源多肽序列。
21. 權利要求19或20的宿主細胞，其中所述宿主細胞源自于微生物，所述微生物包括 細菌，如枯草芽孢桿菌、大腸桿菌，和真菌，其包括酵母，如多形漢森氏酵母、粟酒裂殖酵母、 釀酒酵母，以及絲狀真菌，如木霉屬和曲霉屬，如米曲霉。
22. 權利要求21的宿主細胞，其中所述微生物為原核細菌細胞，優選大腸桿菌。
23. 細菌細胞菌株布丘氏菌屬P1-29,以登錄號NCMB 41248保藏。
24. 產生多肽的方法，其包括在宿主細胞中表達權利要求1至12的氨基酸序列和/或 表達權利要求13至16的多核苷酸，并且從宿主細胞培養基分離所述肌醇六磷酸酶。
25. 生產食品或動物飼料的方法，其包含向所述食品或動物飼料上噴灑液體形式的權 利要求1-12任一項的多肽的步驟。
26. 生產食品或動物飼料的方法，其包含將作為干燥產品的權利要求1-12任一項的多 肽與所述食品或動物飼料混合的步驟。
27. 權利要求1至12任一項的肌醇六磷酸酶在食物或動物飼料中的用途。
28. 食物或動物飼料組合物，其包括i)權利要求1至12任一項的肌醇六磷酸酶，和/ 或ii)通過權利要求25或26的方法產生的動物飼料。
29. 制備肌醇六磷酸酶變體的方法，所述方法包括下列連續的步驟： a) 選擇至少一種親本肌醇六磷酸酶，其中所述至少一種親本肌醇六磷酸酶選自i)權 利要求1-12的多肽和/或ii)至少一種肌醇六磷酸酶變體； b) 通過在所述親本肌醇六磷酸酶中引入所述親本肌醇六磷酸酶的至少一種變化，以獲 得至少一種肌醇六磷酸酶變體，所述變化是氨基酸殘基的插入、缺失或取代或其組合； c) 篩選所述至少一種肌醇六磷酸酶變體以鑒定改良的肌醇六磷酸酶變體，所述肌醇六 磷酸酶變體與親本肌醇六磷酸酶相比具有選自以下的一種或多種改良的特性： i. 更高的熱穩定性和/或 ii. 比活和/或 iii. 蛋白水解穩定性和/或 d) 制備所述改良的肌醇六磷酸酶變體，優選以產生分離和/或純化的肌醇六磷酸酶變 體。
30. 權利要求29的方法，其中在步驟b)期間產生肌醇六磷酸酶變體的群體，以及在步 驟c)中篩選至少一部分所述肌醇六磷酸酶變體的群體。
31. 權利要求29或30的方法，其中步驟a)包括將編碼親本肌醇六磷酸酶的權利要求 11至13的核苷酸序列進行誘變，并且步驟b)包括在宿主細胞中表達步驟（a)中獲得的突 變的核苷酸序列，且步驟c)包括針對宿主細胞或其一種或多種提取物篩選具有所述一個 或多個改良特性的改良的肌醇六磷酸酶變體。
32. 權利要求29至31的方法，其在步驟c)和任選的d)后，進一步包括隨后的至少一 輪重復步驟a)至c)和可選擇的d)的步驟，其中優選在所述隨后的一輪或多輪中，從根據 權利要求29至31的方法制備的所述至少一種肌醇六磷酸酶變體和/或改良的肌醇六磷酸 酶變體中選擇步驟a)的至少一種親本肌醇六磷酸酶。
33. 權利要求29至32的方法，其中步驟c)包括篩選表達改良的肌醇六磷酸酶變體的 宿主細胞，該肌醇六磷酸酶變體與i)所述親本肌醇六磷酸酶和/或ii)包括SEQ ID No 3 的多肽相比，具有至少2. 5的熱穩定性差異。
34. 權利要求29至33的方法，其中步驟c)包括篩選表達改良的肌醇六磷酸酶變體的 宿主細胞，該肌醇六磷酸酶變體與i)所述親本肌醇六磷酸酶和/或ii)包括SEQ ID No 3 的多肽相比，具有至少30的胃蛋白酶穩定性。
35. 權利要求29至34的方法，其中步驟c)包括篩選表達改良的肌醇六磷酸酶變體的 宿主細胞，該肌醇六磷酸酶變體與i)所述親本肌醇六磷酸酶和/或ii)包括SEQ ID No 3 的多肽相比，具有當與由SEQ ID No 3編碼的肌醇六磷酸酶相比時至少110的比活比率。
36. 根據權利要求29至35的方法制備的改良的肌醇六磷酸酶變體。
37. 多核酸構建體，優選DNA構建體，其包括編碼權利要求16或權利要求36任一項的 改良的肌醇六磷酸酶變體的多核酸序列。
38. 重組表達載體，其包括權利要求37的多核酸構建體。
39. 宿主細胞，其用權利要求37的DNA多核酸和/或權利要求38的載體轉化。
40. 產生改良的肌醇六磷酸酶變體的方法，其包括在允許表達所述改良的肌醇六磷酸 酶變體的條件下培養權利要求39的宿主細胞。
41. 飼料或食物組合物，其包括至少一種權利要求8至12或36任一項的改良的肌醇 六磷酸酶變體，或權利要求38的宿主細胞，其中所述食物或飼料組合物優選根據權利要求 25或26的方法制備。
【文檔編號】C12N1/15GK104450642SQ201410513308
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2005年10月17日 優先權日:2004年10月18日
【發明者】安德烈·米亞斯尼科夫, 維杰伊·庫瑪, 奧利弗·肯施, 克勞斯·佩倫加爾, 伯吉塔·勒思納, 烏爾里克·凱特林, 安德烈·科爾特曼 申請人:杜邦營養生物科學有限公司