一種魚類肌肉組織總rna的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種魚類肌肉組織總RNA的提取方法,將魚類肌肉組織經(jīng)液氮速凍，Trizol裂解液處理后低溫高速離心，經(jīng)硫酸銨、氯仿-正丁醇萃取后，再經(jīng)異丙醇-醋酸鈉和氯化鋰沉淀，DNA酶處理后，經(jīng)洗滌獲得魚類肌肉組織總RNA。本發(fā)明所述提取方法，可避免魚肌肉組織中的內(nèi)源性RNA酶、多糖(主要是肌糖原)和蛋白等對RNA提取的影響，獲得一種低降解、多糖蛋白去除徹底的RNA分離純化方法，提取的RNA純度穩(wěn)定、完整性好、重復(fù)性高、無污染，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。
【專利說明】—種魚類肌肉組織總RNA的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及魚類總RNA的提取，具體地說，涉及一種魚類肌肉組織總RNA的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]總RNA分離純化技術(shù)是分子生物學(xué)研究技術(shù)的基礎(chǔ)，從組織中提取純度穩(wěn)定、完整性好、重復(fù)性高、無污染的總RNA的分離純化方法，是決定后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果質(zhì)量的關(guān)鍵，一些特定的部位使用通用的RNA分離純化方法，往往不能滿足要求，需要相應(yīng)的處理與提取制備方法。
[0003]魚類肌肉組織按其構(gòu)造、功能可分為骨骼肌、平滑肌、心肌，不同肌肉成分含量上略有差異，但大體上相近，含有大量的多糖(主要是肌糖原)和蛋白(肌原纖維，包括肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白)，采用傳統(tǒng)的RNA分離純化方法，在抽提的過程中容易產(chǎn)生多糖和蛋白污染,而且魚肌肉組織內(nèi)源性RNA酶含量高，單位細(xì)胞RNA含量相對較少，采樣和操作過程中樣本不易研磨、裂解不充分，極易造成RNA降解而使提取失敗。上述這些問題，使魚類肌肉組織總RNA難以穩(wěn)定的分離和純化。
[0004]目前，有針對性的分離純化魚肌肉組織總RNA的方法較少，用傳統(tǒng)方法操作過程中，魚肌肉組織研磨和裂解不充分，提取的總RNA得率低、穩(wěn)定性差、容易污染，無法滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種適用于魚類肌肉組織總RNA的提取方法。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0007]一種魚類肌肉組織總RNA的提取方法，具體為:將魚類肌肉組織經(jīng)液氮速凍，Trizol裂解液處理后低溫高速離心，經(jīng)硫酸銨、氯仿-正丁醇萃取后，再經(jīng)異丙醇-醋酸鈉和氯化鋰沉淀，DNA酶處理后，經(jīng)洗滌而獲得魚類肌肉組織總RNA。
[0008]進(jìn)一步地，所述Trizol裂解液使用前加入β -巰基乙醇和/或8-羥基喹啉，使其在所述Trizol裂解液中的體積濃度分別為1.0-2.5%和0.10-0.15%。由于Trizol裂解液本身含有0.10%的8-羥基喹啉，因此也可不再加入8-羥基喹啉。但為了更好的抑制內(nèi)源RNA酶活性，減少RNA的降解，還可有效的排除核蛋白、色素等物質(zhì)的干擾，在Trizol裂解液使用前加入0.05% 8-羥基喹啉，使其在Trizol裂解液中的體積濃度達(dá)到0.15%。
[0009]進(jìn)一步地，所述氯仿-正丁醇混合液使用量為l/4Trizol體積。
[0010]進(jìn)一步地，所述氯仿-正丁醇混合液中氯仿與正丁醇的體積比為24:1。
[0011]進(jìn)一步地,在使用異丙醇-醋酸鈉沉淀RNA前，加入RNase-free的脂質(zhì)體。脂質(zhì)體的常規(guī)用量為5-10 μ g,可結(jié)合RNA并共同析出，脂質(zhì)體濃度大于4 μ g/μ 1會(huì)影響PCR反應(yīng)，RNA最終溶液體積為20-30 μ 1，脂質(zhì)體的濃度為0.17-0.25 μ g/μ 1，不會(huì)影響技術(shù)方案的效果和后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0012]作為優(yōu)選，所述硫酸銨的使用濃度為4mol/L。
[0013]作為優(yōu)選，所述氯化鋰的使用濃度為3.5mol/L。
[0014]進(jìn)一步地，經(jīng)異丙醇-醋酸鈉沉淀時(shí)，異丙醇與醋酸鈉的體積比為4:1。
[0015]進(jìn)一步地，所述提取方法具體包括以下步驟:
[0016]1)取魚肌肉組織，無菌RNase-free水清洗后放入液氮中速凍，超低溫凍存；
[0017]2)將凍存樣本轉(zhuǎn)入含有Trizol裂解液的RNase-free EP管中，勻漿后置于冰中，超聲破碎，17000-19000g4°C離心，取上清；
[0018]3)加入硫酸銨溶液，振蕩搖勻，5000_7000g4°C離心，取上清；
[0019]4)加入氯仿和正丁醇混合液，振蕩搖勻至均勻的乳白狀絮狀，室溫靜置5min，12000g4°C離心，取上清；
[0020]5)加入RNase-free的脂質(zhì)體，用針頭抽吸2-3次；
[0021]6)加入與步驟5)混合液等體積的異丙醇-醋酸鈉混合液，振蕩搖勻，_20°C放置，12000g4°C離心，棄上清液，管底部會(huì)出現(xiàn)少量沉淀；
[0022]7)用預(yù)冷的乙醇懸浮沉淀，12000g4°C離心，棄去乙醇，晾干，加入RNase-free水充分溶解；
[0023]8)加入氯化鋰溶液，-20°C放置60-80min，12000g4°C離心，RNA沉淀于管底，棄上清；
[0024]9)用預(yù)冷的乙醇懸浮沉淀，12000g4°C離心，棄去乙醇，晾干，加入RNase-free水充分溶解；
[0025]10)力卩入 RNase-free DNase 緩沖液、RNase-free DNA 酶、RNA 酶抑制劑和RNase-free 水，37°C處理 40_50min，得到 DNA 酶處理液；
[0026]11)加入乙二胺四乙酸加熱處理，隨后依次加入RNase-free水、醋酸鈉和預(yù)冷的無水乙醇，混勻后_80°C放置15-25min，12000g4°C離心，棄上清；
[0027]12)用預(yù)冷的乙醇洗滌沉淀，12000g4°C離心，棄上清，室溫封閉靜置5_10min，晾干，加入RNase-free水或0.5%的SDS溶液充分溶解，_80°C保存。
[0028]更進(jìn)一步地，所述提取方法具體包括以下步驟:
[0029]1)用手術(shù)工具取80_90mg魚肌肉組織，無菌RNase-free (無RNA酶)水清洗后迅速放入液氮中速凍，_80°C超低溫凍存；
[0030]2)將凍存樣本迅速轉(zhuǎn)入含有1ml Trizol裂解液的RNase-free EP管中，使用RNase-free電動(dòng)勻漿器勻漿，將EP管放置于冰中，超聲破碎8_10s，間隔15_20s，超聲破碎8-10s，17000-19000g4°C離心 lOmin，取上清；
[0031]3)加入500μ 14mol/L硫酸銨溶液，振蕩搖勻，5000-7000g4°C離心3-5min，吸上清液至離心管B中；所述硫酸銨溶液的pH = 5.5 ;
[0032]4)加入氯仿和正丁醇混合液350_400μ 1，振蕩搖勻至均勻的乳白狀絮狀，室溫靜置5min，12000g4°C離心lOmin，取上清；所述氯仿和正丁醇混合液中氯仿與正丁醇的體積比為24:1 ；
[0033]5)加入5 μ g RNase-free的脂質(zhì)體，用針頭抽吸上清2_3次；優(yōu)選4.5號(hào)針頭，搭配1ml注射器使用；
[0034]6)加入與步驟5)混合液等體積的異丙醇-醋酸鈉混合液，振蕩搖勻-20°C放置60min, 12000g4°C離心15min,棄上清液,管底部會(huì)出現(xiàn)少量沉淀；所述異丙醇_醋酸鈉混合液中異丙醇與醋酸鈉的體積比為4:1，醋酸鈉濃度2mol/L，所述醋酸鈉溶液的pH = 5.2 ;
[0035]7)用75%已預(yù)冷的乙醇800-1000 μ 1均勻懸浮漂洗沉淀，12000g4°C離心5min，棄去乙醇，室溫封閉靜置5-10min,晾干，加入RNase-free水50 μ 1充分溶解；
[0036]8)加入 50 μ 17mol/L 的氯化鋰，_20°C放置 60_80min，12000g4°C離心 15min，RNA沉淀于管底，棄上清；
[0037]9)用75%已預(yù)冷的乙醇800-1000 μ 1均勻懸浮漂洗沉淀，12000g4°C離心5min，棄去乙醇，室溫封閉靜置5-10min,晾干，加入RNase-free水20 μ 1充分溶解；
[0038]10)加入 5 μ 1 的 RNase-free DNase 緩沖液(10 X DNase I Buffer,寶生物公司)、2μ 1 的 RNase-free DNA 酶(5U/ μ 1 RNase-free Recombinant DNase I，寶生物公司)、2.5 μ 1 的 RNA 酶抑制劑(20U/μ 1 RNase Inhibitor, Life technologies 公司)和 20.5 μ 1RNase-free 水，37°C處理 40_50min，得到 DNA 酶處理液；
[0039]11)加入2.5 μ 1濃度為0.5mol/L乙二胺四乙酸，混勻78_82°C加熱處理3min，隨后依次加入RNase-free水47.5 μ 1、10 μ 1濃度為3.5mol/L醋酸鈉和250 μ 1已預(yù)冷的無水乙醇，混勻后_80°C放置15-25min，12000g4°C離心lOmin，棄上清；
[0040]12)用75%已預(yù)冷的乙醇洗滌沉淀，12000g4°C離心5min，棄上清，室溫封閉靜置5-10min,晾干，加入RNase-free水或0.5%的SDS溶液20-30 μ 1充分溶解，_80°C保存。
[0041]其中，所述Trizol裂解液(TRIzol的主要成分是苯酚，還包含異硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸鈉、醋酸鈉等，Life technologies公司)使用前加入2.5%體積分?jǐn)?shù)的β -巰基乙醇和0.05%體積分?jǐn)?shù)的8-羥基喹啉。
[0042]本發(fā)明的有益效果在于:
[0043]本發(fā)明提供一種魚類肌肉組織總RNA的提取方法，可避免魚肌肉組織中的內(nèi)源性RNA酶、多糖(主要是肌糖原)和蛋白等對RNA提取的影響，獲得一種低降解、多糖蛋白去除徹底的RNA分離純化方法，提取的RNA純度穩(wěn)定、完整性好、重復(fù)性高、無污染，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。
[0044]本發(fā)明通過在Trizol中加入2.5%的β -巰基乙醇和0.05%的8_羥基喹啉，可在裂解過程中有效抑制內(nèi)源RNA酶活性，減少RNA的降解，還可有效的排除核蛋白、色素等物質(zhì)的干擾。Trizol中加入β-巰基乙醇和8-羥基喹啉，用來抑制RNA酶活性，本申請根據(jù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在處理富含RNA酶的組織時(shí)，Trizol加入2.5%的β -巰基乙醇和0.05%的8-羥基喹啉協(xié)同作用效果最好，可有效的抑制內(nèi)源性RNA酶，并有效排除核蛋白和色素等的干擾。
[0045]本發(fā)明將冷凍樣本在Trizol中勻漿后，使用超聲破碎進(jìn)行處理，能夠更好的裂解細(xì)胞，使RNA充分游離到液相中。液氮研磨法破碎樣本，由于液氮極易揮發(fā)，研磨過程中要不斷的向研缽中加入液氮，耗費(fèi)時(shí)間長，操作不方便，有安全隱患，而對凍存樣本進(jìn)行電動(dòng)勻漿，勻漿后再使用超聲破碎，細(xì)胞破碎速度快，勻漿徹底，操作簡單安全，縮短了處理時(shí)間，有效減少RNA的降解。
[0046]本發(fā)明在Trizol裂解液處理后，將離心力增加至17000_19000g，可有效沉降破碎細(xì)胞壁、雜質(zhì)等。
[0047]本發(fā)明在Trizol處理液中加入4mol/L硫酸銨,可使蛋白脫水沉淀,有效去除提取過程中的蛋白污染。針對組織中蛋白含量較高，加入硫酸銨沉淀蛋白一次，硫酸銨沉淀蛋白的效率一般大于85%，降低蛋白對后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響，再進(jìn)行氯仿正丁醇抽提，可以充分去除蛋白。
[0048]本發(fā)明使用氯仿與正丁醇混合液(24:1)，可提高蛋白、DNA和RNA的分離效果，保證RNA的純度和完整性。常規(guī)提取過程中，抽提時(shí)使用氯仿或氯仿異戊醇混合物，使用量約為l/5Trizol體積，改用氯仿與正丁醇混合物，比例為24:1，使用量增加至1/4體積可以有效提高處理效率，利于水相、蛋白相和有機(jī)相的分離，且異戊醇的毒性較大，改用正丁醇可降低毒性，保護(hù)操作人員。
[0049]本發(fā)明在沉淀RNA之前，加入RNase-free的脂質(zhì)體，可有效析出RNA，提高RNA得率。
[0050]本發(fā)明將常規(guī)方法中的異丙醇沉淀步驟改為使用異丙醇-醋酸鈉混合液(異丙醇:醋酸鈉=4:1)沉淀，處理?xiàng)l件為-20°C放置60min，，沉淀RNA。在加入異丙醇同時(shí)加入醋酸鈉，沉淀RNA的同時(shí)溶解多糖類物質(zhì)，使它們有效分離。醋酸鈉等高鹽溶液可在提取過程中加入，用于去除多糖和析出RNA，一般加入的體積為10%，濃度一般為3mol/L(終濃度0.3mol/L)，處理?xiàng)l件一般為-20°C放置3小時(shí)，本申請根據(jù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在加入異丙醇階段，醋酸鈉加入量增加至20%且濃度降低至2mol/L(終濃度0.4mol/L)，處理?xiàng)l件為_20°C放置60min，可提高沉淀并溶解多糖類物質(zhì)的效率，而DNA酶處理階段醋酸鈉濃度也增加至3.5mol/L，可有效析出RNA。
[0051]本發(fā)明在醋酸鈉沉淀后再使用氯化鋰進(jìn)行處理，氯化鋰處理的最佳使用條件為3.5mol/L, _20°C放置70_80min，可有效的去除多糖類物質(zhì)。醋酸鈉和氯化鋰處理配合使用，對樣品中的多糖去除徹底，氯化鋰沉淀的條件一般為_4°C、-20°C、-80°C進(jìn)行處理，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)-20°C放置90min效率最高，條件更加容易控制，使用濃度3.5mol/L，去除多糖效果最好。
[0052]本發(fā)明將一般乙醇處理過程中7000_8000g的離心力增加至12000g，能夠更好地沉淀RNA，較大的離心力使RNA粘附于管底，去除上清的時(shí)候利于操作。
[0053]本發(fā)明引入DNA酶處理步驟，在DNA處理前，已經(jīng)通過氯仿正丁醇和注射器抽提，可去掉部分DNA片段，但并不徹底，加入DNA酶處理步驟，將消化時(shí)間延長至40-50min，可提高DNA酶處理效率，更徹底的去除基因組DNA污染。DNA酶的失活使用78_82°C熱處理3min，使DNA酶失活更加徹底，利于后續(xù)的分離與純化，相對于氯仿抽提法，縮短了處理時(shí)間，有效減少RNA在純化中的降解。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0054]圖1為本發(fā)明所述方法提取的魚類肌肉組織總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0055]圖2為本發(fā)明所述方法提取的魚類肌肉組織總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，對β -actin基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0056]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0057]實(shí)施例1
[0058]本實(shí)施例所述魚類肌肉組織總RNA的提取方法具體步驟如下:
[0059]1.用手術(shù)工具取80mg魚肌肉組織，無菌RNase-free (無RNA酶)水清洗后迅速放入液氮中速凍，超低溫(_80°C )凍存。
[0060]2.將凍存樣本迅速轉(zhuǎn)入含有l(wèi)ml Trizol裂解液的RNase-free EP管中，使用RNase-free電動(dòng)勻漿器勻漿，將EP管放置于冰中，超聲破碎8s，間隔15s，超聲破碎8s，17000g4°C離心lOmin，吸上清至離心管A中。
[0061]注:TriZ0l裂解液(TRIzol的主要成分是苯酚，還包含異硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸鈉、醋酸鈉等，Life technologies公司)，Trizol裂解液使用前加入25 μ 1 β -巰基乙醇和0.5 μ 1的8-羥基喹啉。
[0062]3.向離心管Α中加入500μ 14mol/L硫酸銨(PH5.5)，振蕩搖勻，5000g4°C離心3min,吸上清液至離心管B中。
[0063]4.向離心管B中加入氯仿和正丁醇混合液(氯仿:正丁醇=24:1) 350 μ 1 (混合液體積的1/4)，振蕩搖勻至均勻的乳白狀絮狀，室溫靜置5min，12000g4°C離心lOmin，吸取上清液至離心管C中。
[0064]5.向上清中加入5yg RNase-free的脂質(zhì)體，用4.5號(hào)針頭(搭配lml注射器)抽吸上清2-3次。
[0065]6.向離心管C中加入上清等體積的異丙醇醋酸鈉混合液(異丙醇:醋酸鈉=4:1,醋酸鈉濃度2mol/L)，振蕩搖勻-20°C放置60min，12000g4°C離心15min，棄上清液，管底部會(huì)出現(xiàn)少量沉淀。
[0066]7.用75%已預(yù)冷的乙醇800μ 1均勻懸浮漂洗沉淀，12000g4°C離心5min，棄去乙醇，室溫封閉靜置5min,晾干,加入RNase-free水50 μ 1充分溶解。
[0067]8.向離心管 C 中加入 50 μ 17mol/L 的 LiCL，_20°C放置 60_80min，12000g4°C離心15min, RNA沉淀于管底，棄上清。
[0068]9.用75%已預(yù)冷的乙醇800 μ 1均勻懸浮漂洗沉淀，12000g4°C離心5min，棄去乙醇，室溫封閉靜置5min,晾干，加入RNase-free水20 μ 1充分溶解。
[0069]10.向 RNA 溶液中加入 5 μ 1 的 RNase-free DNase 緩沖液(10 X DNase I Buffer,寶生物公司)、2μ 1 的 RNase-free DNA 酶(5U/ μ 1 RNase-free Recombinant DNase I,寶生物公司)、2.5 μ 1 的 RNA 酶抑制劑(20U/ μ 1 RNase Inhibitor, Life technologies 公司)和20.5 μ 1 RNase-free水，37°C處理40min，得到DNA酶處理液。
[0070]11.向DNA酶處理液中加入2.5μ 1濃度為0.5mol/L乙二胺四乙酸，混勻78°C加熱處理3min,隨后依次加入RNase-free水47.5 μ 1、10 μ 1濃度為3.5mol/L醋酸鈉和250 μ 1已預(yù)冷的無水乙醇，混勻后_80°C放置15min，12000g4°C離心lOmin，棄上清。
[0071]12.用75%已預(yù)冷的乙醇洗滌沉淀，12000g4°C離心5min，棄上清，室溫封閉靜置5min，晾干，加入RNase-free水或0.5%的SDS溶液20 μ 1充分溶解，_80°C保存。
[0072]實(shí)施例2
[0073]1.用手術(shù)工具取90mg魚肌肉組織，無菌RNase-free (無RNA酶)水清洗后迅速放入液氮中速凍，超低溫(_80°C )凍存。
[0074]2.將凍存樣本迅速轉(zhuǎn)入含有l(wèi)ml Trizol裂解液的RNase-free EP管中，使用RNase-free電動(dòng)勻漿器勻漿，將EP管放置于冰中，超聲破碎10s，間隔20s，超聲破碎10s，19000g4°C離心lOmin，吸上清至離心管A中。
[0075]注:TriZol裂解液(TRIzol的主要成分是苯酚，還包含異硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸鈉、醋酸鈉等，Life technologies公司)，Trizol裂解液使用前加入25 μ 1 β -巰基乙醇和0.5 μ 1的8-羥基喹啉。
[0076]3.向離心管Α中加入500μ 14mol/L硫酸銨(PH5.5)，振蕩搖勻，7000g4°C離心5min,吸上清液至離心管B中。
[0077]4.向離心管B中加入氯仿和正丁醇混合液(氯仿:正丁醇=24:1)400 μ 1 (混合液體積的1/4)，振蕩搖勻至均勻的乳白狀絮狀，室溫靜置5min，12000g4°C離心lOmin，吸取上清液至離心管C中。
[0078]5.向上清中加入5yg RNase-free的脂質(zhì)體，用4.5號(hào)針頭(搭配lml注射器)抽吸上清3次。
[0079]6.向離心管C中加入上清等體積的異丙醇醋酸鈉混合液(異丙醇:醋酸鈉=4:1,醋酸鈉濃度2mol/L)，振蕩搖勻-20°C放置60min，12000g4°C離心15min，棄上清液，管底部會(huì)出現(xiàn)少量沉淀。
[0080]7.用75%已預(yù)冷的乙醇1000 μ 1均勻懸浮漂洗沉淀，12000g4°C離心5min，棄去乙醇，室溫封閉靜置lOmin,晾干，加入RNase-free水50 μ 1充分溶解。
[0081]8.向離心管 C 中加入 50μ 17mol/L 的 LiCL，-20 °C 放置 80min，12000g4 °C 離心15min, RNA沉淀于管底，棄上清。
[0082]9.用75%已預(yù)冷的乙醇100(^1均勻懸浮漂洗沉淀，1200(^41:離心51^11，棄去乙醇，室溫封閉靜置lOmin,晾干，加入RNase-free水20 μ 1充分溶解。
[0083]10.向 RNA 溶液中加入 5 μ 1 的 RNase-free DNase 緩沖液(10 X DNase I Buffer,寶生物公司)、2μ 1 的 RNase-free DNA 酶(5U/ μ 1 RNase-free Recombinant DNase I,寶生物公司)、2.5 μ 1 的 RNA 酶抑制劑(20U/ μ 1 RNase Inhibitor, Life technologies 公司)和20.5 μ 1 RNase-free水，37°C處理50min，得到DNA酶處理液。
[0084]11.向DNA酶處理液中加入2.5μ 1濃度為0.5mol/L乙二胺四乙酸，混勻82°C加熱處理3min,隨后依次加入RNase-free水47.5 μ 1、10 μ 1濃度為3.5mol/L醋酸鈉和250 μ 1已預(yù)冷的無水乙醇，混勻后_80°C放置25min，12000g4°C離心lOmin，棄上清。
[0085]12.用75%已預(yù)冷的乙醇洗滌沉淀，12000g4°C離心5min，棄上清，室溫封閉靜置lOmin，晾干，加入RNase-free水或0.5%的SDS溶液30 μ 1充分溶解，_80°C保存。
[0086]本發(fā)明提取并純化獲得的魚類肌肉組織總RNA的瓊脂糖凝膠電泳如圖1所示，28s條帶亮度是18s亮度的二倍，同時(shí)測得的魚類肌肉總RNA濃度為200-250ng/l.! 1，吸光度0D260/0D280的比值穩(wěn)定在1.8-2.0之間，說明獲得的總RNA純度高、完整性佳、無DNA和蛋白污染。
[0087]本發(fā)明提取后的魚類肌肉組織總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，對β -actin基因進(jìn)行了 PCR擴(kuò)增，瓊脂糖電泳凝膠檢測結(jié)果如圖2:電泳條帶完整、清晰、特異性好，說明此總RNA能滿足后續(xù)的RT-PCR、Real Time RT-PCR、Northern blot、體外翻譯和分子克隆等多種下游實(shí)驗(yàn)。
[0088]本發(fā)明提取并純化獲得的魚類肌肉組織總RNA的瓊脂糖凝膠電泳如圖1所示，28s條帶亮度是18s亮度的二倍，同時(shí)測得的魚類肌肉總RNA濃度為200-250ng/l.! 1，吸光度0D260/0D280的比值穩(wěn)定在1.8-2.0之間，說明獲得的總RNA純度高、完整性佳、無DNA和蛋白污染。
[0089]本發(fā)明提取后的魚類肌肉組織總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，對β -actin基因進(jìn)行了 PCR擴(kuò)增，瓊脂糖電泳凝膠檢測結(jié)果如圖2:電泳條帶完整、清晰、特異性好，說明此總RNA能滿足后續(xù)的RT-PCR、Real Time RT-PCR、Northern blot、體外翻譯和分子克隆等多種下游實(shí)驗(yàn)。
[0090]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種魚類肌肉組織總RNA的提取方法，其特征在于，將魚類肌肉組織經(jīng)液氮速凍，Trizol裂解液處理后低溫高速離心，經(jīng)硫酸銨、氯仿-正丁醇萃取后，再經(jīng)異丙醇-醋酸鈉和氯化鋰沉淀，DNA酶處理后，經(jīng)洗滌而獲得魚類肌肉組織總RNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述Trizol裂解液使用前加入β -巰基乙醇和8-羥基喹啉，使其在所述Trizol裂解液中的體積濃度分別為1.0-2.5%和0.10-0.15%。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述氯仿-正丁醇混合液使用量為l/4Trizol 體積。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的提取方法，其特征在于，所述氯仿-正丁醇混合液中氯仿與正丁醇的體積比為24:1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的提取方法，其特征在于，在使用異丙醇-醋酸鈉沉淀RNA前,加入RNase-free的脂質(zhì)體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述硫酸銨的使用濃度為4mol/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述氯化鋰的使用濃度為3.5mol/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的提取方法，其特征在于，經(jīng)異丙醇-醋酸鈉沉淀時(shí)，異丙醇與醋酸鈉的體積比為4:1。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的提取方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)取魚肌肉組織，無菌RNase-free水清洗后放入液氮中速凍，超低溫凍存； 2)將凍存樣本轉(zhuǎn)入含有Trizol裂解液的RNase-freeEP管中，勻漿后置于冰中，超聲破碎，離心，取上清； 3)加入硫酸銨溶液，振蕩搖勻，離心，取上清； 4)加入氯仿和正丁醇混合液，振蕩搖勻至均勻的乳白狀絮狀，室溫靜置，離心，取上清； 5)加入RNase-free的脂質(zhì)體，用針頭抽吸2-3次； 6)加入與步驟5)混合液等體積的異丙醇-醋酸鈉混合液，振蕩搖勻，離心，棄上清液； 7)用預(yù)冷的乙醇懸浮沉淀,離心,棄去乙醇，晾干,加入RNase-free水充分溶解； 8)加入氯化鋰溶液，放置60-80min，離心，RNA沉淀于管底，棄上清； 9)用預(yù)冷的乙醇懸浮沉淀,離心,棄去乙醇，晾干,加入RNase-free水充分溶解； 10)加入RNase-free DNase 緩沖液、RNase-free DNA 酶、RNA 酶抑制劑和 RNase-free水，處理40-50min，得到DNA酶處理液； 11)加入乙二胺四乙酸加熱處理，隨后依次加入RNase-free水、醋酸鈉和預(yù)冷的無水乙醇，混勻后放置15-25min，離心，棄上清； 12)用預(yù)冷的乙醇洗滌沉淀，離心，棄上清，室溫封閉靜置5-10min，晾干，加入RNase-free水或0.5%的SDS溶液充分溶解，_80°C保存。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的提取方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)用手術(shù)工具取80-90mg魚肌肉組織,無菌RNase-free水清洗后迅速放入液氮中速凍，-80°C超低溫凍存； 2)將凍存樣本迅速轉(zhuǎn)入含有ImlTrizol裂解液的RNase-free EP管中，使用RNase-free電動(dòng)勻漿器勻漿，將EP管放置于冰中，超聲破碎8_10s，間隔15_20s，超聲破碎8-10s，17000-19000g4°C離心 lOmin，取上清； 3)加入500μ 14mol/L硫酸銨溶液，振蕩搖勻，5000-7000g4°C離心3_5min，吸上清液至離心管B中；所述硫酸銨溶液的pH = 5.5 ; 4)加入氯仿和正丁醇混合液350-400μ1，振蕩搖勻至均勻的乳白狀絮狀，室溫靜置5min, 12000g4°C離心lOmin，取上清；所述氯仿和正丁醇混合液中氯仿與正丁醇的體積比為 24:1 ; 5)加入5μ g RNase-free的脂質(zhì)體，用針頭抽吸上清2_3次； 6)加入與步驟5)混合液等體積的異丙醇-醋酸鈉混合液，振蕩搖勻_20°C放置60min，12000g4°C離心15min，棄上清液，管底部會(huì)出現(xiàn)少量沉淀；所述異丙醇-醋酸鈉混合液中異丙醇與醋酸鈉的體積比為4:1，醋酸鈉濃度2mol/L，所述醋酸鈉溶液的pH = 5.2 ; 7)用75%已預(yù)冷的乙醇800-1000μ I均勻懸浮漂洗沉淀，12000g4°C離心5min，棄去乙醇，室溫封閉靜置5-10min,晾干,加入RNase-free水50 μ I充分溶解； 8)加入50 μ 17mol/L 的氯化鋰，_20°C放置 60_80min，12000g4°C離心 15min，RNA 沉淀于管底，棄上清； 9)用75%已預(yù)冷的乙醇800-1000μ I均勻懸浮漂洗沉淀，12000g4°C離心5min，棄去乙醇，室溫封閉靜置5-10min,晾干,加入RNase-free水20 μ I充分溶解；
10)加入5 μ I 的 RNase-free DNase 緩沖液、2 μ I 的 RNase-free DNA 酶、2.5 μ I 的 RNA酶抑制劑和20.5 μ I RNase-free水，37°C處理40_50min，得到DNA酶處理液； 11)加入2.5μ I濃度為0.5mol/L乙二胺四乙酸，混勻78_82°C加熱處理3min，隨后依次加入RNase-free水47.5 μ 1、10 μ I濃度為3.5mol/L醋酸鈉和250 μ I已預(yù)冷的無水乙醇，混勻后_80°C放置15-25min，12000g4°C離心lOmin，棄上清； 12)用75%已預(yù)冷的乙醇洗滌沉淀，12000g4°C離心5min，棄上清，室溫封閉靜置5-10min,晾干，加入RNase-free水或0.5%的SDS溶液20-30 μ I充分溶解，_80°C保存。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK104313013SQ201410505253
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月26日
【發(fā)明者】楊曉飛, 徐紹剛, 李文通, 袁丁, 楊貴強(qiáng), 馬峻峰 申請人:北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所