用于結(jié)核分枝桿菌耐藥突變基因檢測(cè)的核酸膜條和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種疾病病原體的基因檢測(cè)，尤其涉及一種用于結(jié)核分枝桿菌耐藥突變基因檢測(cè)的核酸膜條和試劑盒。所述試劑盒包括核酸膜條，所述核酸膜條，包括基底和固定于所述基底上的核酸探針，所述核酸探針包括如下堿基序列的探針：SEQ ID NO：1-26。本發(fā)明用于結(jié)核分枝桿菌耐藥突變基因檢測(cè)的試劑盒能全面、快速地進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌耐藥突變基因檢測(cè)，能在一次試驗(yàn)中，檢測(cè)5種主要抗結(jié)核藥物的耐受性，能夠快速及時(shí)明確結(jié)核分枝桿菌對(duì)主要抗結(jié)核藥物的耐藥信息，有利于臨床提前做出預(yù)防性治療和診斷，給病人減輕負(fù)擔(dān)。
【專利說(shuō)明】用于結(jié)核分枝桿菌耐藥突變基因檢測(cè)的核酸膜條和試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種疾病病原體的基因檢測(cè)，尤其涉及一種用于結(jié)核分枝桿菌耐藥突 變基因檢測(cè)的核酸膜條和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB)侵入人體后引起 的一種具有強(qiáng)傳染性的慢性消耗性疾病。自上世紀(jì)八十年代后期以來(lái)，受流動(dòng)人口增加，艾 滋病流行和耐藥性結(jié)核病的增多等因素的影響，結(jié)核病在全球重新蔓延，已成為全球重大 公共衛(wèi)生問(wèn)題和社會(huì)問(wèn)題。據(jù)世界衛(wèi)生組織2009年報(bào)告稱：2007年，全球結(jié)核流行病例約 為1370萬(wàn)例，其中新發(fā)病例共有927萬(wàn)起，高于2006年（924萬(wàn)例）、2000年（830萬(wàn)例） 和1990年￠60萬(wàn)例）的水平。2007年病例數(shù)排名前五位的國(guó)家是：印度（200萬(wàn)）、中國(guó) (130萬(wàn)）、印度尼西亞（53萬(wàn)）、尼日利亞（46萬(wàn)）和南非（46萬(wàn)）。
[0003] 我國(guó)是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，結(jié)核病病人數(shù)居世界第二位，僅次于印度。據(jù)我國(guó) 衛(wèi)生部門統(tǒng)計(jì)，目前全國(guó)共有結(jié)核病患者約450萬(wàn)人，其中新增結(jié)核病人130萬(wàn)，每年約13 萬(wàn)人死于結(jié)核病。
[0004] 結(jié)核分枝桿菌主要通過(guò)飛沫經(jīng)呼吸道傳染的，結(jié)核病人在咳嗽、打噴嚏或大聲談 話時(shí)，結(jié)核分枝桿菌就會(huì)隨痰沫噴出來(lái)，懸浮在空氣中，人們吸入后可引起感染。結(jié)核病的 治療必須長(zhǎng)期服用抗結(jié)核藥物，至少6個(gè)月。當(dāng)抗結(jié)核治療中斷或不規(guī)則治療時(shí)，結(jié)核菌 可以繼續(xù)生存下去，不斷繁殖，甚至形成一種更為危險(xiǎn)的耐藥性結(jié)核菌株，治療起來(lái)更加困 難。因此，對(duì)于結(jié)核病的防治要做到早期預(yù)防、及時(shí)發(fā)現(xiàn)和規(guī)范治療。
[0005] 利福平、異煙肼、乙胺丁醇、鏈霉素和氟喹諾酮是臨床上最常用的抗結(jié)核藥物，但 患者長(zhǎng)期服用或不規(guī)范治療會(huì)導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌發(fā)生基因變異，對(duì)藥物的敏感性降低，臨 床表現(xiàn)為結(jié)核耐藥。WHO調(diào)查報(bào)告顯示，2009年我國(guó)有結(jié)核病130萬(wàn)例，其中單耐藥率21%， 多耐藥為8. 64%，廣泛耐藥率為0. 68%，總耐藥率37. 79%。中國(guó)耐藥結(jié)核病的特點(diǎn)是耐藥 人數(shù)多，分布非常廣泛，耐多藥結(jié)核的分布以農(nóng)村為主、青壯年占的比例較高，無(wú)明顯性別 差異，且東、中、西部不同地區(qū)耐藥率并無(wú)顯著差異。
[0006] 研究表明當(dāng)rpoB基因核心區(qū)域一利福平耐藥決定區(qū)（RRDR)發(fā)生突變時(shí)，利福平 不能有效的與RNA聚合酶β亞基結(jié)合，使得細(xì)菌對(duì)利福平產(chǎn)生耐受性；而異煙肼耐藥的發(fā) 生主要由katG或inhA基因突變引起，乙胺丁醇耐藥主要由編碼糖基轉(zhuǎn)移酶（催化阿拉伯 糖聚合到阿拉伯-半乳聚糖）的embB基因突變引起，鏈霉素耐藥主要由編碼核糖體蛋白 S12(rpsL)基因突變引起，氟喹諾酮耐藥主要是由gyrA基因突變引起。因此，檢測(cè)相關(guān)耐藥 基因的突變情況可以獲得結(jié)核分枝桿菌對(duì)相應(yīng)藥物的耐受性。
[0007] 目前對(duì)于結(jié)核分枝桿菌的耐藥常規(guī)檢測(cè)方法是藥敏培養(yǎng)法，該方法是將結(jié)核分枝 桿菌菌株在含抗結(jié)核藥物的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)結(jié)核分枝桿菌在含藥培養(yǎng)基中是否生 長(zhǎng)來(lái)判斷結(jié)核分枝桿菌的耐藥性。該方法的主要缺點(diǎn)是檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，普通的藥敏培養(yǎng)試驗(yàn) 需要耗時(shí)6-8周才能報(bào)告最終結(jié)果，即使采用全自動(dòng)藥敏培養(yǎng)設(shè)備也需要3至4周才能報(bào) 結(jié)果，極易耽誤病人的最佳治療時(shí)間。其次是藥敏培養(yǎng)困難，對(duì)操作要求高，操作不當(dāng)使細(xì) 菌失活后容易產(chǎn)生假陰性，造成誤判。
[0008] 現(xiàn)有的檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥基因相關(guān)位點(diǎn)突變的產(chǎn)品中，只是檢測(cè)利福平、異 煙肼、乙胺丁醇、鏈霉素和氟喹諾酮五種抗結(jié)核藥物的一種或幾種的耐藥信息，檢測(cè)不全 面。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0009] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是：提供一種可一次檢測(cè)出結(jié)核分枝桿菌對(duì)物種抗結(jié) 核藥物的耐受性，且檢測(cè)時(shí)間短、結(jié)果準(zhǔn)確可信的用于結(jié)核分枝桿菌耐藥突變基因檢測(cè)的 核酸膜條和試劑盒。
[0010] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：提供一種用于結(jié)核分枝桿菌 耐藥突變基因檢測(cè)的核酸膜條，包括基底和固定于所述基底上的核酸探針，所述核酸探針 包括如下堿基序列的探針：SEQ ID NO :1-26。
[0011] 本發(fā)明的另一技術(shù)方案為提供一種用于結(jié)核分枝桿菌耐藥突變基因檢測(cè)的試劑 盒，所述試劑盒包括：上述用于結(jié)核分枝桿菌耐藥突變基因檢測(cè)的核酸膜條和PCR反應(yīng)液， 所述PCR反應(yīng)液包括PCR反應(yīng)液I和PCR反應(yīng)液II ;
[0012] 所述PCR反應(yīng)液I包括如下堿基序列的引物：SEQ ID NO :28-33 ;
[0013] 所述PCR反應(yīng)液II包括如下堿基序列的引物：SEQ ID NO :34-39。
[0014] 本發(fā)明有益效果：本發(fā)明用于結(jié)核分枝桿菌耐藥突變基因檢測(cè)的核酸膜條和試劑 盒能全面、快速地進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌耐藥突變基因檢測(cè)，能在一次試驗(yàn)中，檢測(cè)5種主要抗 結(jié)核藥物的耐受性，能夠快速及時(shí)明確結(jié)核分枝桿菌對(duì)主要抗結(jié)核藥物的耐藥信息，有利 于臨床提前做出預(yù)防性治療和診斷，給病人減輕負(fù)擔(dān)。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1為本發(fā)明試劑盒的核酸膜條檢測(cè)結(jié)果圖；
[0016] 圖2為本發(fā)明試劑盒的核酸膜條檢測(cè)結(jié)果圖；
[0017] 圖3為本發(fā)明試劑盒的核酸膜條檢測(cè)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 為詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、構(gòu)造特征、所實(shí)現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實(shí)施方式 并配合附圖詳予說(shuō)明。
[0019] 本發(fā)明最關(guān)鍵的構(gòu)思在于：一次試驗(yàn)即可快速及時(shí)的明確結(jié)核分枝桿菌對(duì)5種主 要抗結(jié)核藥物的耐藥信息，有利于臨床提前做出預(yù)防性治療和診斷，給病人減輕負(fù)擔(dān)。
[0020] 實(shí)施例1
[0021] 根據(jù)已知的結(jié)核分枝桿菌基因組研究成果進(jìn)行檢測(cè)探針、引物及擴(kuò)增反應(yīng)液的設(shè) 計(jì)和實(shí)施。
[0022] 本發(fā)明的產(chǎn)品采用了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)和反向點(diǎn)雜交（RDB)相結(jié)合的基因芯 片技術(shù)?；蛐酒赡猃埬ず凸潭ㄔ谄渖系奶结橁嚵袠?gòu)成，膜芯片的開發(fā)則具有制備相對(duì) 簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、成本低廉等明顯優(yōu)勢(shì)。
[0023] 本發(fā)明根據(jù)已知的結(jié)合分枝桿菌基因組研究成果進(jìn)行檢測(cè)探針、引物及擴(kuò)增反應(yīng) 液的設(shè)計(jì)，從選取特異的結(jié)合分枝桿菌耐藥突變基因序列，根據(jù)耐藥突變基因位點(diǎn)所處的 位置設(shè)計(jì)基因序列作為探針，同時(shí)采用多重PCR的方式擴(kuò)增多個(gè)耐藥基因的DNA片段。
[0024] 本發(fā)明同時(shí)檢測(cè)5種抗結(jié)核藥物對(duì)應(yīng)的6個(gè)耐藥基因，這6個(gè)耐藥基因在結(jié)核分 枝桿菌基因組內(nèi)的分布較分散，相互之間的分子距離較遠(yuǎn)，距離最近的兩個(gè)耐藥基因 rpoB 和rpsL之間也相距2萬(wàn)多個(gè)堿基，采用一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增6個(gè)目的基因是難以實(shí)現(xiàn)的，因 此，本發(fā)明為了規(guī)避以上的不利因素，采用分開設(shè)計(jì)引物和探針的方式，縮短目的基因的擴(kuò) 增片段，提高擴(kuò)增和雜交效率。由于結(jié)核分枝桿菌基因組較大，各耐藥基因分布又比較分 散，在PCR擴(kuò)增時(shí)，受結(jié)核分枝桿菌基因組較大影響，目的基因在基因組中暴露在外的概率 較小，因此，引物與目的基因序列結(jié)合時(shí)受到空間位阻效應(yīng)影響較大，結(jié)合較困難。因此，本 發(fā)明中引物設(shè)計(jì)難度較大，需要經(jīng)過(guò)多次摸索和試驗(yàn)，才能獲得擴(kuò)增效率高的引物序列。
[0025] 另外，本發(fā)明采用的是兩管三重PCR擴(kuò)增體系，即在一個(gè)PCR擴(kuò)增體系中同時(shí)含有 三對(duì)耐藥基因的引物，三重PCR擴(kuò)增體系的難度較大，三對(duì)引物之間容易出現(xiàn)互相抑制的 情況，導(dǎo)致某兩對(duì)引物不能共存于一個(gè)反應(yīng)體系，需要重新調(diào)整和設(shè)計(jì)引物對(duì)；三對(duì)引物在 擴(kuò)增過(guò)程中互相競(jìng)爭(zhēng)原材料，容易導(dǎo)致引物之間的擴(kuò)增不均一；多對(duì)引物在一個(gè)反應(yīng)體系 中，容易形成引物二聚體從而降低引物的有效濃度，影響擴(kuò)增效率。本發(fā)明經(jīng)過(guò)多次的摸索 和比較，優(yōu)選出能夠共存的最佳引物對(duì)，通過(guò)調(diào)整引物的用量形成最佳的引物對(duì)配比，實(shí)現(xiàn) 了三重PCR擴(kuò)增體系也能均一高效的擴(kuò)增。
[0026] 1、本發(fā)明結(jié)核分枝桿菌耐藥突變位點(diǎn)檢測(cè)的擴(kuò)增引物和核酸探針序列如表1所 /Jn 〇 「00271 表 1
【權(quán)利要求】
1. 一種用于結(jié)核分枝桿菌耐藥突變基因檢測(cè)的核酸膜條，包括基底和固定于所述基底 上的核酸探針，其特征在于，所述核酸探針包括如下堿基序列的探針：SEQ ID NO :1-26。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于結(jié)核分枝桿菌耐藥突變基因檢測(cè)的核酸膜條，其特征在 于，所述基底為尼龍膜。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于結(jié)核分枝桿菌耐藥突變基因檢測(cè)的核酸膜條，其特征在 于，所述核酸探針還包括內(nèi)參照核酸探針，其堿基序列如：SEQ ID NO :27。
4. 一種用于結(jié)核分枝桿菌耐藥突變基因檢測(cè)的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括： 如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的用于結(jié)核分枝桿菌耐藥突變基因檢測(cè)的核酸膜條和PCR反應(yīng) 液，所述PCR反應(yīng)液包括PCR反應(yīng)液I和PCR反應(yīng)液II ; 所述PCR反應(yīng)液I包括如下堿基序列的引物：SEQ ID NO :28-33 ; 所述PCR反應(yīng)液II包括如下堿基序列的引物：SEQ ID NO :34-39。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于結(jié)核分枝桿菌耐藥突變基因檢測(cè)的試劑盒，其特征在 于，所述引物5'端標(biāo)記生物素，所述探針3'端標(biāo)記氨基。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK104263834SQ201410503311
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月26日
【發(fā)明者】鄒耀東, 田潔 申請(qǐng)人:亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司