一種Poly (A)聚合酶活性測定方法
【專利摘要】本發明公開了一種非放射性的Poly(A)聚合酶活性測定方法，所述方法包括：首先根據單鏈模板合成引物，然后進行PAP酶催化的加尾反應，反應完成后與單鏈模板退火，隨后在足量沒有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶存在下進行聚合反應生成雙鏈DNA，最后測定聚合反應完成后反應體系中雙鏈DNA的相對量，并利用該檢測結果推導出Poly(A)聚合酶活性程度，其中所用單鏈模板上引物3’方向上的堿基不是t。本發明的方法不采用放射性元素，沒有放射性污染，操作步驟簡單快速，靈敏度高。
【專利說明】一種PoIy(A)聚合酶活性測定方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生化【技術領域】，具體來說涉及一種Poly(A)聚合酶活性測定方法。
【背景技術】
[0002] Poly(A)聚合酶（Poly(A)polymerase，PAP)是一種特殊的RNA聚合酶。該酶可不 依賴模板特異性的催化三磷酸腺甘（ATP)，逐個聚合至單鏈RNA片段的3'-0H端上，其反應 方程式為：
【權利要求】
1. 一種Poly (A)聚合酶活性測定方法，其特征在于，所述方法包括：首先根據單鏈模 板合成引物，然后進行PAP酶催化的加尾反應，反應完成后與單鏈模板退火，隨后在足量沒 有3'-5'外切酶活性的DNA聚合酶存在下進行聚合反應生成雙鏈DNA，最后測定聚合反應完 成后反應體系中雙鏈DNA的相對量，并通過該檢測結果推導出Poly (A)聚合酶活性程度， 其中所用單鏈模板上引物3'方向上第一位的堿基不是t。
2. 如權利要求1所述的Poly (A)聚合酶活性測定方法，其特征在于，反應體系中雙鏈 DNA的相對量是利用僅與雙鏈DNA或僅與單鏈DNA結合的熒光染料，利用熒光法檢測得到 的，并且雙鏈DNA的相對量是以熒光強度表示的。
3. 如權利要求2所述的Poly (A)聚合酶活性測定方法，其特征在于，所采用的熒光染 料是雙鏈DNA特異性熒光染料。
4. 如權利要求3所述的Poly (A)聚合酶活性測定方法，其特征在于，所述熒光染料是 picogreen 染料。
5. 如權利要求1所述的Poly (A)聚合酶活性測定方法，其特征在于，所采用的單鏈模 板是單鏈環狀DNA模板。
6. 如權利要求5所述的Poly (A)聚合酶活性測定方法，其特征在于，所采用的單鏈模 板是Ml3噬菌體單鏈DNA。
7. 如權利要求6所述的Poly (A)聚合酶活性測定方法，其特征在于，所用的引物是 -aagccatccgcaaaaatgacctct-3,〇
8. 如權利要求1所述的Poly (A)聚合酶活性測定方法，其特征在于，所采用的DNA聚 合酶是Klenow DNA聚合酶exo-突變體。
【文檔編號】C12Q1/48GK104357543SQ201410502196
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年9月28日 優先權日:2014年9月28日
【發明者】徐曉昱 申請人:南京諾唯贊生物科技有限公司