一種3’-5’外切酶活性測定方法
【專利摘要】本發明公開了一種非放射性的3’-5’外切酶活性測定方法，所述方法包括：首先根據單鏈模板合成有3’錯配的引物，將引物與單鏈模板混合并退火，接著在該反應液中加入3’-5’外切酶活性進行3’堿基外切反應，然后加入足量沒有3’-5’外切酶活性的聚合酶延長引物直至獲得雙鏈DNA，隨后檢測反應體系中雙鏈DNA的相對量，由該檢測結果推導出外切酶活性程度。該方法與現有技術方法相比，無放射性污染，操作步驟簡單快速，可以實現高通量的自動化活性測定，可以用來篩選針對3’-5’外切酶的封閉活性。
【專利說明】-種3' -5'外切酶活性測定方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生化【技術領域】，具體來說涉及一種3' -5'外切酶活性測定方法。
【背景技術】
[0002] Pfu DNA聚合酶(簡稱Pfu )是一種來源于嗜熱菌強烈熾熱球菌（Pyrococcus furiosus)的高度熱穩定的DNA聚合酶。Pfu具有兩種活性：5' -3'聚合酶活性以及3' -5' 外切酶活性（或稱校對活性)。Pfu的3' -5'外切酶活性非常強，可以降解DNA合成鏈中堿 基錯配的核苷酸，大大增加了堿基配對的正確率，保證了 DNA合成的高度忠實性。因此，該 酶是目前耐熱DNA聚合酶中保真度最高的酶，適合使用在那些需要高精確度的PCR應用中， 包括克隆、基因表達和突變分析。
[0003] Pfu的高3' -5'外切酶活性雖然可以帶來高的保真度，但同時也會引起一些副作 用。3'-5'外切酶活性會降解引物，特別是溶液中沒有dNTP的情況下。所以，在配制PCR反 應體系時，最好在冰上操作，且Pfu必須是最后加入到反應體系中，并立即進行PCR反應。另 外，Pfu擴增產物為平端。如果需要進行TA克隆的話，需要首先將PCR產物純化，去掉Pfu， 再進行加 A尾反應；否則，Pfu的3' -5'外切酶活性會將加上的A切掉，導致TA克隆失敗。 因此，業內一直希望找到一種可逆的封閉Pfu 3'-5'外切酶活性的方法，旨在不改變Pfu高 保真度的前提下，減少甚至消除3'-5'外切酶活性帶來的副作用，以提高Pfu相關應用的便 利性。
[0004] 但是找到在找到相應的封閉活性方法之前，首先要解決的一個問題是如何建立 3' -5'外切酶活性的方法。標準的測活方法采用放射性同位素法，即首先合成一條3'末端 帶3H標記dATP的單鏈寡核苷酸。3' -5'外切酶活性可將[3H]-dATP切除。再經過TCA沉 淀、過濾，通過測定酸可溶性物質中放射性的含量，計算3' -5'外切酶活性。這種方法易產 生放射性污染，且步驟多、周期長，難以實現高通量、自動化，因此為篩選帶來了困難。
【發明內容】
[0005] 本發明建立了一種簡便、快速、非放射性的3 ' -5 '外切酶測活方法，利用該方法，可 以快速大量的篩選目標產物，為尋找針對該3' -5'外切酶活性的封閉試劑提供了一種可靠 簡便的途徑。
[0006] 具體來說，本發明采用的技術方案如下： 一種3' -5'外切酶活性測定方法，其特征在于，所述方法包括：首先根據單鏈模板合成 有3'錯配的引物，將引物與單鏈模板混合并退火，接著在該反應液中加入3' -5'外切酶活 性進行3'堿基外切反應，然后加入足量沒有3'-5'外切酶活性的聚合酶延長引物直至獲得 雙鏈DNA，隨后檢測反應體系中雙鏈DNA的相對量，并根據檢測結果推導出3' -5'外切酶活 性程度。
[0007] 其中，反應體系中雙鏈DNA的相對量可以通過檢測雙鏈DNA的量或者單鏈DNA的 量而得到。
[0008] 優選地，反應體系中單鏈DNA的存在量的檢測是利用僅與雙鏈DNA或僅與單鏈DNA 結合的熒光染料，更優選采用雙鏈DNA特異性熒光染料，在一個實施方案中，本發明方案中 采用的是當前在本領域中已經成熟使用的商購picogreen染料。在此，雙鏈DNA的相對量 是以突光強度表不的。
[0009] 本發明測定方法中所采用的單鏈模板可以選用任何適合的單鏈模板，優選采用環 狀單鏈DNA，這樣在聚合反應結束后，可以得到閉合的環狀雙鏈體，處理技術成熟，并且環狀 雙鏈體可以避免對后續測量的干擾。在一個優選實施方案中，所采用的單鏈模板是M13噬 菌體單鏈DNA，簡稱M13。M13是在生化技術中廣泛使用的一種單鏈DNA載體，因此可以此為 基礎建立一種標準的測量技術。
[0010] 所述測定方法中錯配引物中3'錯配的數目優選是1個。
[0011] 在一個優選實施方案中，所采用的引物序列是 5' -aagccatccgcaaaaatgacctct這_3'，其中加下劃線的堿基表示錯配堿基。
[0012] 所加入的沒有3' -5'外切酶活性的聚合酶可以采用任何適合的DNA聚合酶，在一 個優選實施方案中，所采用的沒有3' -5'外切酶活性的聚合酶是指Taq酶。
[0013] 在另一實施方案中，所要測定的3' -5'外切酶活性是指具有3' -5'外切酶活性的 Pfu 酶。
[0014] 本發明的優點： 1. 無放射性污染； 2. 操作步驟簡單快速，無需TCA沉淀、洗滌、干燥、洗脫步驟；可實現高通量、自動化的 活性測定； 3. 可以用來針對3' -5'外切酶活性進行阻斷活性篩選。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015] 圖1是本發明的測定方法的原理圖。
[0016] 圖2是外切酶活性與熒光強度之間的關系圖。
【具體實施方式】
[0017] 要篩選到針對3'-5'外切酶活性的封閉試劑，例如單克隆抗體，必須首先建立測定 3' -5'外切酶活性的方法。標準的測活方法采用放射性同位素法，即首先合成一條3'末端 帶3H標記dATP的單鏈寡核苷酸。3' -5'外切酶活性可將[3H]-dATP切除。再經過TCA沉 淀、whatman濾紙過濾，通過測定酸可溶性物質中放射性的含量，計算3' -5'外切酶活性。 這種方法易產生放射性污染，且步驟多、周期長，難以實現高通量、自動化。
[0018] 本發明建立了一種簡便、快速、非放射性的3' -5'外切酶測活方法，其原理如圖1 所示。
[0019] 首先制備一種末端不匹配的模板/引物，例如M13模板/錯配引物復合物。3'-5' 外切酶活性可將末端不匹配的堿基切除，從而將末端不匹配的模板/引物如M13模板/錯 配引物復合物轉化為末端匹配的模板/引物復合物如M13模板/引物復合物。無3' -5' 外切酶活性的DNA聚合酶可以M13模板/引物復合物為底物，進行聚合反應，生成M13雙鏈 DNA。M13雙鏈DNA可被雙鏈特異性的picogreen染料結合，產生熒光。而M13模板/錯配 引物復合物不能作為無3' -5'外切酶活性的DNA聚合酶的底物；picogreen染料不能結合 單鏈DNA，從而不能產生熒光。
[0020] 3'_5'外切酶的活性在一定范圍內與M13模板/引物復合物的量成正比；而在DNA 聚合酶活性一定的情況下，M13模板/引物復合物的量同熒光強度成正比。因此，本發明將 3' -5'外切酶的測活體系同DNA聚合酶測活體系偶聯起來。
[0021] 下面將結合具體實施例來詳細說明本發明。
[0022] 實施例1 I. M13模板/引物復合物的制備： M13 單鏈 DNA :M13mpl8 單鏈 DNA (NEB); 引物：M13 引物 5，-aagccatccgcaaaaatgacctct-3，； M13模板/引物復合物：將M13mpl8單鏈DNA同M13引物按摩爾比1:1混合，在退火緩 沖液（10 mM Tris-HCl pH 8.0，50 mM NaCl)中，70°C加熱5分鐘后，緩慢降至室溫，使模 板引物退火。
[0023] 2. M13模板/錯配引物復合物的制備： M13 單鏈 DNA :M13mpl8 單鏈 DNA (NEB); 引物：M13錯配引物5'_aagccatccgcaaaaatgacctct這-3'；（下劃線表示該堿基與模板 不匹配） M13模板/錯配引物復合物：將M13mpl8單鏈DNA同M13錯配引物按摩爾比1:1混合， 在退火緩沖液（10 mM Tris-HCl pH 8.0，50 mM NaCl)中，70°C加熱5分鐘后，緩慢降至室 溫，使模板引物退火。
[0024] 3. 3' -5'核酸外切酶反應：
【權利要求】
1. 一種3'-5'外切酶活性測定方法，其特征在于，所述方法包括：首先根據單鏈模板合 成有3'錯配的引物，將引物與單鏈模板混合并退火，接著加入3' -5'外切酶活性進行3'堿 基外切反應，然后加入足量沒有3' -5'外切酶活性的聚合酶延長引物直至獲得雙鏈DNA，隨 后檢測反應體系中雙鏈DNA的相對量，并根據檢測結果推導出3' -5'外切酶活性程度。
2. 如權利要求1所述的3'-5'外切酶活性測定方法，其特征在于，反應體系中雙鏈DNA 的相對量的測量是利用僅與雙鏈DNA或僅與單鏈DNA結合的熒光染料，通過熒光法檢測得 到的，并且雙鏈DNA的相對量是以熒光強度表示的。
3. 如權利要求2所述的3' -5'外切酶活性測定方法，其特征在于，所采用的熒光染料 是雙鏈DNA特異性熒光染料。
4. 如權利要求3所述的3' -5'外切酶活性測定方法，其特征在于，所述熒光染料是 picogreen 染料。
5. 如權利要求1所述的3' -5'外切酶活性測定方法，其特征在于，所采用的單鏈模板 是環狀單鏈DNA模板。
6. 如權利要求5所述的3' -5'外切酶活性測定方法，其特征在于，所用模板是M13噬 菌體單鏈DNA。
7. 如權利要求1所述的3' -5'外切酶活性測定方法，其特征在于，錯配的數目是1個。
8. 如權利要求6所述的3' -5'外切酶活性測定方法，其特征在于，所用引物序列是5' -aagccatccgcaaaaatgacctcta-3, 〇
【文檔編號】C12Q1/68GK104293930SQ201410502154
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月28日 優先權日:2014年9月28日
【發明者】徐曉昱, 王靜 申請人:南京諾唯贊生物科技有限公司