文蛤生物活性肽及其提取方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種文蛤生物活性肽及其提取方法和應用，所述文蛤生物活性肽N-末端序列為TRGIDEIQNT GGGGTRR，等電點為8.79，分子量為18KDa。本發明提供的文蛤生物活性肽對免疫系統的巨噬細胞吞噬活性與脾淋巴細胞增殖能力同時具有促進作用，具有增強免疫的藥理作用，可用于制備用于增強免疫的藥物或保健食品，具有開發免疫增強新藥的潛能。
【專利說明】文蛤生物活性肽及其提取方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生化與生物醫藥領域，具體涉及一種文蛤生物活性肽及其提取方法和 應用。
【背景技術】
[0002] 免疫是機體對病原微生物侵襲的防衛功能及維持內環境穩定的功能。許多疾病的 發生、發展與機體的免疫功能低下或免疫缺陷有著密切的關系。因此，免疫藥物的開發成為 醫藥工作者研究的重點。
[0003] 海洋天然生物活性物質是現代生物學研究的熱點，而海洋生物活性肽是海洋活性 物質研究的重要組成部分。海洋生物可提取多種生理功能的活性肽，因原料價廉，操作簡單 易行，安全性1?而廣受：關注。
[0004] 然而，目前同時對免疫系統的巨噬細胞吞噬活性與脾淋巴細胞增殖能力具有增強 作用的海洋生物多肽并不多見，而且增強效果并不顯著。
【發明內容】
[0005] 有鑒于此，本發明的目的在于提出一種文蛤生物活性肽及其提取方法和應用，以 克服現有海洋生物多肽對免疫系統的巨噬細胞吞噬活性與脾淋巴細胞增殖能力的增強作 用不顯著的缺陷。
[0006] 基于上述目的，本發明提供一種文蛤生物活性肽，所述文蛤生物活性肽N-末端序 列為TRGIDEIQNT GGGGTRR，等電點為8. 79,分子量為18KDa。
[0007] 本發明還提供上述文蛤生物活性肽的提取方法，包括以下步驟：
[0008] 1)取文蛤的肌肉組織和粘液，將其加入到質量濃度為0. 5?2%的乙酸溶液中，經 破碎后得到勻漿液；其中，所述文蛤的肌肉組織和粘液與乙酸溶液的質量比為1:0. 5?2 ;
[0009] 2)向所述勻漿液中加入木瓜蛋白酶、中性蛋白酶與胰蛋白酶，所述木瓜蛋白酶、中 性蛋白酶與胰蛋白酶的質量比為1?5:7:1?3,酶解溫度為40?45°C，加酶量為文蛤的 肌肉組織和粘液濕重的0. 1?1 %，調節勻漿液pH值至7. 5?8. 0,酶解1?3h后升溫滅 酶；將滅酶后的勻漿液離心，取上清液，即為酶解液；
[0010] 3)用有機膜對所述酶解液進行分離，收集分子量在1?50KDa之間的多肽酶解液， 冷凍干燥后得到粗肽樣品；
[0011] 4)將所述粗肽樣品用乙酸溶液溶解，離心，取上清液，用微孔濾膜過濾該上清液， 然后將濾液抽進葡聚糖凝膠柱，洗脫，收集20min?30min時間段的多肽組分溶液，接著冷 凍干燥所述多肽組分溶液，得到文蛤粗多肽；
[0012] 5)所述文蛤粗多肽通過高效液相色譜精制純化，再經冷凍干燥，即得所述文蛤生 物活性肽。
[0013] 可選地，所述文蛤生物活性肽的純度彡98%。
[0014] 較佳地，所述木瓜蛋白酶、中性蛋白酶與胰蛋白酶的質量比為2?4:7:1. 2?2. 5。
[0015] 較佳地，所述加酶量為文蛤的肌肉組織和粘液濕重的0. 3?0. 8%。
[0016] 本發明還提供所述文蛤生物活性肽在制備增強免疫藥物或保健食品中的應用，所 述藥物或保健食品的制劑形式為液體制劑或固體制劑。
[0017] 較佳地，所述增強免疫藥物或保健食品包含所述文蛤生物活性肽、藥用級乳糖與 半胱氨酸。
[0018] 優選地，所述文蛤生物活性肽、藥用級乳糖與半胱氨酸的質量比為5?15:6? 12:1。
[0019] 從上面所述可以看出，本發明通過上述提取方法從文蛤肉與粘液中分離得到一種 文蛤生物活性肽，通過體外免疫實驗發現該文蛤生物活性肽對小鼠單核巨噬細胞RAW264. 7 吞噬中性紅能力有明顯增強作用，并明顯促進了該巨噬細胞的NO釋放量，同時對小鼠脾淋 巴細胞增殖也具有明顯促進作用。因此，本發明提供的文蛤生物活性肽對免疫系統的巨噬 細胞吞噬活性與脾淋巴細胞增殖能力同時具有促進作用，具有增強免疫的藥理作用，可用 于制備用于增強免疫的藥物或保健食品，具有開發免疫增強新藥的潛能。
【具體實施方式】
[0020] 為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚明白，以下結合具體實施例，對本發 明進一步詳細說明。
[0021] 實施例1文蛤生物活性肽的提取方法
[0022] (1)預處理：取鮮活文蛤，去殼，取肌肉組織和粘液共約25. 0kg，加入到質量濃度 為1. 1%的乙酸溶液中，肌肉組織和粘液與乙酸溶液的質量比為1:1，用高速組織破碎機勻 漿，得到勻漿液。
[0023] (2)酶解：向步驟（1)中得到的勻漿液中加入木瓜蛋白酶、中性蛋白酶與胰蛋白 酶，木瓜蛋白酶、中性蛋白酶與胰蛋白酶的質量比為3:7:2,酶解溫度為42?45°C，加酶量 為文蛤肌肉組織和粘液濕重的0. 5%，調節勻漿液pH值至7. 5?7. 9,酶解1?2h后升 溫至85°C，滅酶IOmin ;將滅酶后的勻漿液離心，得上清液，即為所需酶解液，低溫（可以 是-20°C)保存備用。需要說明的是，加酶量是指三種酶的加酶量之和。所述文蛤肌肉組織 和粘液的濕重是指未加入到乙酸溶液中時的濕重。
[0024] (3)膜分離：分別用50KDa、lKDa的有機膜對步驟⑵中得到的酶解液進行分離， 收集分子量在1?50KDa之間的多肽酶解液，-80°C冷凍干燥，即得粗肽樣品。
[0025] (4)凝膠柱層析：將步驟⑶中得到的粗肽樣品用lmol/L乙酸溶液溶解，然后以 2000r/10min的轉速離心，得上清液，然后用0. 45 μ m的聚醚砜微孔濾膜過濾該上清液，然 后通過蠕動泵將過濾后的上清液（即濾液）抽進葡聚糖凝膠G-25(SephadeXG-25)柱子 的上端，下端出口連接紫外檢測儀（檢測波長280nm)，洗脫，收集20min?30min時間段 的多肽組分溶液，再用真空冷凍干燥機_80°C將該多肽組分溶液凍干，即得文蛤粗多肽，約 L 5kg〇
[0026] Sephadex G-25凝膠色譜條件如下所示：
[0027]
【權利要求】
1. 一種文蛤生物活性肽，其特征在于，所述文蛤生物活性肽N-末端序列為TRGIDEIQNT GGGGTRR，等電點為8. 79,分子量為18KDa。
2. -種根據權利要求1所述的文蛤生物活性肽的提取方法，其特征在于，包括以下步 驟： 1) 取文蛤的肌肉組織和粘液，將其加入到質量濃度為〇. 5?2%的乙酸溶液中，經破碎 后得到勻漿液；其中，所述文蛤的肌肉組織和粘液與乙酸溶液的質量比為1:0. 5?2 ; 2) 向所述勻漿液中加入木瓜蛋白酶、中性蛋白酶與胰蛋白酶，所述木瓜蛋白酶、中性蛋 白酶與胰蛋白酶的質量比為1?5:7:1?3,酶解溫度為40?45°C，加酶量為文蛤的肌肉 組織和粘液濕重的〇. 1?1 %，調節勻漿液pH值至7. 5?8. 0,酶解1?3h后升溫滅酶；將 滅酶后的勻漿液離心，取上清液，即為酶解液； 3) 用有機膜對所述酶解液進行分離，收集分子量在1?50KDa之間的多肽酶解液，冷凍 干燥后得到粗肽樣品； 4) 將所述粗肽樣品用乙酸溶液溶解，離心，取上清液；然后用微孔濾膜過濾該上清液， 然后將濾液抽進葡聚糖凝膠柱，洗脫，收集20min?30min時間段的多肽組分溶液，接著冷 凍干燥所述多肽組分溶液，得到文蛤粗多肽； 5) 所述文蛤粗多肽通過高效液相色譜精制純化，再經冷凍干燥，即得所述文蛤生物活 性肽。
3. 根據權利要求2所述的文蛤生物活性肽的提取方法，其特征在于，所述文蛤生物活 性肽的純度彡98%。
4. 根據權利要求2所述的文蛤生物活性肽的提取方法，其特征在于，所述木瓜蛋白酶、 中性蛋白酶與胰蛋白酶的質量比為2?4:7:1. 2?2. 5。
5. 根據權利要求2所述的文蛤生物活性肽的提取方法，其特征在于，所述加酶量為文 蛤的肌肉組織和粘液濕重的0. 3?0. 8%。
6. 根據權利要求1所述的文蛤生物活性肽在制備增強免疫藥物或保健食品中的應用， 其特征在于，所述藥物或保健食品的制劑形式為液體制劑或固體制劑。
7. 根據權利要求1所述的文蛤生物活性肽在制備增強免疫藥物或保健食品中的應用， 其特征在于，所述增強免疫藥物或保健食品包含所述文蛤生物活性肽、藥用級乳糖與半胱 氨酸。
8. 根據權利要求1所述的文蛤生物活性肽在制備增強免疫藥物或保健食品中的應用， 其特征在于，所述文蛤生物活性肽、藥用級乳糖與半胱氨酸的質量比為5?15:6?12:1。
【文檔編號】A23L1/305GK104311630SQ201410497223
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年9月25日 優先權日:2014年9月25日
【發明者】杜正彩, 鄧家剛, 郝二偉, 吳玉強 申請人:廣西中醫藥大學