一種用于檢測豬瘟病毒的重組抗原的制備方法

一種用于檢測豬瘟病毒的重組抗原的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測豬瘟病毒的重組抗原的制備方法，一種用于檢測豬瘟病毒的重組抗原的制備方法，包括如下步驟：基因合成，構建重組表達載體，含有豬瘟病毒E2重組蛋白的表達，將重組表達質粒轉化至大腸桿菌中，進行誘導表達，誘導之后，收集菌體；含有豬瘟病毒E2重組蛋白的純化及復性。本發(fā)明提供的用于檢測豬瘟病毒的重組抗原的制備方法，對豬瘟病毒主要抗原表位所在的E2全片段進行重組表達,這樣就保留了全部E2的抗原決定簇位點,進而有效的避免了假陰性即漏檢現(xiàn)象；具有生產周期短,產量高,成本低的優(yōu)點。
【專利說明】-種用于檢測豬瘟病毒的重組抗原的制備方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術及診斷研究領域，特別涉及一種用于檢測豬瘟病毒的重組抗 原的制備方法。

【背景技術】
[0002] 豬癌是由豬癌病毒（classical swine fever virus, CSFV)引起的一種傳染性很 強、致死率極高的熱性傳染病。能夠引起熱性全身性敗血癥、母豬流產、胎兒畸形等多種臨 床表現(xiàn)，從而給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴重的危害，世界獸醫(yī)局將其列為A類16種法定傳染病之一。 時至今日，豬瘟仍然是我國養(yǎng)豬業(yè)的第一大傳染病。隨著診斷技術和防疫的進步，世界上 豬瘟的發(fā)生已經呈減少的趨勢，豬瘟疫苗的使用時間及使用效果也影響的豬瘟病毒的危害 性，因此檢驗疫苗的效果和決定疫苗使用的時間必將成為有效控制豬瘟病毒蔓延的有效措 施之一。
[0003] 體外診斷核心原料的開發(fā)則是開發(fā)相應診斷試劑的先決條件，只有開發(fā)出具有高 活性，高性能的抗原抗體，體外診斷試劑產品才能成為現(xiàn)實，因此，針對豬瘟病毒抗原開發(fā) 出能夠用以生產診斷試劑的原料迫在眉捷，從某種程度上說，原料的開發(fā)也必將成為降低 豬瘟病毒感染首要解決的問題。
[0004] 目前大多生產原料公司在豬瘟病毒抗體診斷產品有選取豬瘟病毒E2的部分片段 或者對選取的片段進行重組等，準確率不高，尤其以假陰現(xiàn)象較多。


【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明針對上述缺點，提供了一種可用于檢測豬瘟病毒的重組抗原的制備方法， 目的是針對豬瘟病毒E2整體進行重組表達，以期用此抗原作為檢測豬瘟病毒抗體的核心 原料，避免假陰性的漏檢現(xiàn)象。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取下述技術方案來實現(xiàn)：
[0007] 本發(fā)明提供一種用于檢測豬瘟病毒的重組抗原的制備方法，包括如下步驟：
[0008] 步驟a，基因合成，設計引物進行PCR反應，得到豬瘟病毒的E2基因序列如SEQ ID No :1所示；
[0009] 步驟b，構建重組表達載體，步驟a中的基因序列測序成功后，將該基因序列用限 制性內切酶進行雙酶切之后，插入到用相同兩個酶切處理的質粒表達載體中；
[0010] 步驟C，合有豬瘟病毒E2重組蛋白的表達，將步驟b中的重組表達質粒轉化至大腸 桿菌中，進行誘導表達，誘導之后，收集菌體；
[0011] 步驟d，合有豬瘟病毒E2重組蛋白的純化及復性，將步驟c收集的菌體破碎提取重 組蛋白，然后進行純化及復性，得到重組蛋白氨基酸序列如SEQ ID No :28所示。
[0012] 進一步，步驟a中，設計引物如下：
[0013] CSFV-Iu ：
[0014] ATGCAGCTAGCCTGCAAGGAAGATTACAGGTACGCAATATCATCAACCAATGAGATA
[0015] CSFV-Id ：
[0016] ATTCTTTCCAGGTGGTGGTGAGACCTCCGGCCCCGAGTAGCCCTATCTCATTGGTTGA
[0017] CSFV-2u ：
[0018] CCACCTGGAAAGAATACAACCACGATTTGCAACTGAATGACGGGACCGTTAAGGCCATT
[0019] CSFV-2d ：
[0020] TGACCACATTAAGTGCTGTGACTTTAAAGGAACCTGCCACGCAAATGGCCTTAACGGT
[0021] CSFV-3u ：
[0022] CACTTAATGTGGTCAGTAGGAGGTATTTGGCATCATTGCATAAGGAGGCTTCACTCACT
[0023] CSFV-3d ：
[0024] GAGGCTTCACTCACTTCCGTGACATTTGAGCTCCTGTTCGACGGGACCAACCCATCAAC
[0025] CSFV-4u ：
[0026] CAAATGGGCACAGCCCGAACCCGAAGTCATCTCCCATTTCCTCAGTTGATGGGTTGGTC
[0027] CSFV-4d ：
[0028] CAAGGTTGTGTTGTACTTTCCCTTGACAACAGGACTCGTATCAAATGGGCACAGCC
[0029] CSFV-5u ：
[0030] TACAACACAACCTTGTTGAACGGTAGTGCTTACTATCTTGTCTGTCCAATAGGGTGGAC
[0031] CSFV-5d ：
[0032] TTCTCAGAGTTGTTGGGCTCACTGCTGTGCACTCTATAACACCCGTCCACCCTATTGGA
[0033] CSFV-6u ：
[0034] CAACAACTCTGAGAACAGAAGTGGTAAAGACCTTCAGGAGGGACAAGCCCTTTCCGCAC
[0035] CSFV-6d ：
[0036] AATAAATCTTCATTTTCCACTGTTGTGGTCACACAATCCATTCTGTGCGGAAAGGGCTT
[0037] CSFV-7u ：
[0038] AATGAAGATTTATTCTACTGTAAGTTGGGGGGCAACTGGACATGTGTGAAAGGTGAACC
[0039] CSFV-7d ：
[0040] CACACCATCTGCATTGTTTTACTAGCCCCCCCGTGTAGACCACTGGTTCACCTTTCACA
[0041] CSFV-8u ：
[0042] AATGCAGATGGTGTGGCTTTGACTTCAATGAGCCTGACGGACTCCCACACTACCCCATA
[0043] CSFV-8d ：
[0044] TCCACTATTCTGTAACCTGTCTCATTTGCCAAAATGCACTTACCTATGGGGTAGTGTGG
[0045] CSFV-9u ：
[0046] TTACAGAATAGTGGATTCAACAGACTGTAACAGAGATGGTGTCGTAATCAGCACAGAGG
[0047] CSFV-9d ：
[0048] ATGCACCTTGACAGTTGTGTTACCGATCAAGCACTCATGACTCCCCTCTGTGCTGATTA
[0049] CSFV-IOu ：
[0050] ACTGTCAAGGTGCATGCATCAGATGAAAGACTGGGCCCCATGCCATGCAGACCTAAAG
[0051] CSFV-IOd ：
[0052] TGTACAGGAAGTTTTCCTTACAGGTCCTGCACTAGAGACGATCTCTTTAGGTCTGCATG
[0053] CSFV-Ilu ：
[0054] AAAACTTCCTGTACATTCAACTACGCAAAAACTTTGAAGAACAAGTACTATGAGCCCAG
[0055] CSFV-Ild ：
[0056] ACTGATACTCGCCCTTAAGCATATATTGCTGGAAGTAGCTGTCCCTGGGCTCATAGTAC
[0057] CSFV-12u ：
[0058] AAGGGCGAGTATCAGTACTGGTTTGACCTGGACGTGACTGACCGCCACTCAGATTACTT
[0059] CSFV-12d ：
[0060] TTCCTCCTAACAGTGCTACCACCACCAAGACAACAAATTCTGCGAAGTAATCTGAGTGG
[0061] CSFV-13u ：
[0062] CACTGTTAGGAGGAAGATATGTCCTGTGGCTAATAGTGACCTACATAGTTTTAACAGA
[0063] CSFV-13d ：ACCAGCGGCGAGTTGTTCTGTTAAAACTA,
[0064] 將引物
[0065] CSFV-lu, CSFV-ld, CSFV-2u, CSFV-2d, CSFV-3u, CSFV-3d, CSFV-4u, CSFV-4d 混合， 進行PCR反應，所得產物命名為CSFV-I ;
[0066] 將引物
[0067] CSFV-5u，CSFV-5d，CSFV-6u，CSFV-6d，CSFV-7u，CSFV-7d，CSFV-8u，CSFV-8d 混合， 進行PCR反應，所得產物命名為CSFV-2 ;
[0068] 將引物
[0069] CSFV-9u， CSFV-9d， CSFV-lOu， CSFV-lOd， CSFV-llu， CSFV-lld， CSFV-12U， CSFV-12d，CSFV-13u，CSFV-13d混合，進行PCR反應，所得產物命名為CSFV-3 ;然后將上述 三個產物CSFV-1，CSFV-2, CSFV-3混合作為模板進行PCR反應，得到豬瘟病毒的E2基因序 列如SEQ ID No :1所示。
[0070] 進一步，步驟c中將重組表達質粒轉化至大腸桿菌BL21中，利用合硫酸卡那霉素 的培養(yǎng)基進行篩選，挑取單克隆菌落后，用合有相同濃度的硫酸卡那霉素培養(yǎng)基37度培養(yǎng) 至所需濃度，用IPTG進行誘導表達，誘導之后，低溫離心收集菌體。
[0071] 進一步，所述硫酸卡那霉素的濃度為l〇〇ug/ml。
[0072] 進一步，誘導條件為37度，轉速250rpm，5h，誘導的IPTG濃度為0. ImM。
[0073] 進一步，步驟d中菌體采用超聲破碎，破碎條件為200w，超聲6s，間隔3s超聲一 次，共180次。
[0074] 進一步，步驟d中重組蛋白的純化方法為離子交換層析，凝膠過濾層析和親和層 析中的一種。
[0075] 優(yōu)選的，步驟d中重組蛋白的純化方法為親和層析。
[0076] 本發(fā)明還提供一種前述的重組蛋白在制備豬瘟病毒檢測試劑中的應用
[0077] 此外，本發(fā)明還提供一種檢測豬瘟病毒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包含 前述的重組蛋白。
[0078] 本發(fā)明的有益效果：與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明提供的用于檢測豬瘟病毒的重組抗 原的制備方法對豬瘟病毒主要抗原表位所在的E2全片段進行重組表達，這樣就保留了全 部E2的抗原決定簇位點，進而有效的避免了假陰性即漏檢現(xiàn)象。
[0079] 進一步，本發(fā)明的表達系統(tǒng)為大腸桿菌表達系統(tǒng)，它具有周期短，費用低，表達量 大等特點，使得本發(fā)明的制備方法具有生產周期短，產量高，成本低的優(yōu)點。
[0080] 進一步，本發(fā)明選擇比較溫和的培養(yǎng)和誘導條件，其表達時的誘導溫度在25度， 誘導轉速為250rpm，誘導的IPTG濃度為0. ImM，可以使得重組蛋白有了更加緩慢的表達，， 有充分的時間進行空間構象的形成，更好的保持重組蛋白的活性位點。
[0081] 進一步，本發(fā)明可以采用超聲的方式破碎細菌。在破碎菌體的時候，將破碎條件定 為200W，超聲6s，間隔3s超聲一次，共180次，條件溫和，避免了劇烈的破碎。
[0082] 進一步，本發(fā)明優(yōu)選親和層析，因為本發(fā)明重組蛋白中加入了 6XHis標簽，一步純 化能夠達到較高的純度。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0083] 圖1是本發(fā)明實施例中大腸桿菌中重組質粒的誘導表達示意圖。
[0084] 圖2是本發(fā)明實施例中重組蛋白的純化示意圖。

【具體實施方式】
[0085] 下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述。
[0086] 實施例1豬瘟病毒E2基因的合成
[0087] 設計引物如下：
[0088] CSFV-Iu ：
[0089] ATGCAGCTAGCCTGCAAGGAAGATTACAGGTACGCAATATCATCAACCAATGAGATA
[0090] CSFV-Id ：
[0091] ATTCTTTCCAGGTGGTGGTGAGACCTCCGGCCCCGAGTAGCCCTATCTCATTGGTTGA
[0092] CSFV-2U ：
[0093] CCACCTGGAAAGAATACAACCACGATTTGCAACTGAATGACGGGACCGTTAAGGCCATT
[0094] CSFV-2d ：
[0095] TGACCACATTAAGTGCTGTGACTTTAAAGGAACCTGCCACGCAAATGGCCTTAACGGT
[0096] CSFV-3U ：
[0097] CACTTAATGTGGTCAGTAGGAGGTATTTGGCATCATTGCATAAGGAGGCTTCACTCACT
[0098] CSFV-3d ：
[0099] GAGGCTTCACTCACTTCCGTGACATTTGAGCTCCTGTTCGACGGGACCAACCCATCAAC
[0100] CSFV-4u ：
[0101] CAAATGGGCACAGCCCGAACCCGAAGTCATCTCCCATTTCCTCAGTTGATGGGTTGGTC
[0102] CSFV-4d ：
[0103] CAAGGTTGTGTTGTACTTTCCCTTGACAACAGGACTCGTATCAAATGGGCACAGCC
[0104] CSFV-5u ：
[0105] TACAACACAACCTTGTTGAACGGTAGTGCTTACTATCTTGTCTGTCCAATAGGGTGGAC
[0106] CSFV-5d ：
[0107] TTCTCAGAGTTGTTGGGCTCACTGCTGTGCACTCTATAACACCCGTCCACCCTATTGGA
[0108] CSFV-6u ：
[0109] CAACAACTCTGAGAACAGAAGTGGTAAAGACCTTCAGGAGGGACAAGCCCTTTCCGCAC
[0110] CSFV-6d ：
[0111] AATAAATCTTCATTTTCCACTGTTGTGGTCACACAATCCATTCTGTGCGGAAAGGGCTT
[0112] CSFV-7u ：
[0113] AATGAAGATTTATTCTACTGTAAGTTGGGGGGCAACTGGACATGTGTGAAAGGTGAACC
[0114] CSFV-7d ：
[0115] CACACCATCTGCATTGTTTTACTAGCCCCCCCGTGTAGACCACTGGTTCACCTTTCACA
[0116] CSFV-8u ：
[0117] AATGCAGATGGTGTGGCTTTGACTTCAATGAGCCTGACGGACTCCCACACTACCCCATA
[0118] CSFV-8d ：
[0119] TCCACTATTCTGTAACCTGTCTCATTTGCCAAAATGCACTTACCTATGGGGTAGTGTGG
[0120] CSFV-9u ：
[0121] TTACAGAATAGTGGATTCAACAGACTGTAACAGAGATGGTGTCGTAATCAGCACAGAGG
[0122] CSFV-9d ：
[0123] ATGCACCTTGACAGTTGTGTTACCGATCAAGCACTCATGACTCCCCTCTGTGCTGATTA
[0124] CSFV-IOu ：
[0125] ACTGTCAAGGTGCATGCATCAGATGAAAGACTGGGCCCCATGCCATGCAGACCTAAAG
[0126] CSFV-IOd ：
[0127] TGTACAGGAAGTTTTCCTTACAGGTCCTGCACTAGAGACGATCTCTTTAGGTCTGCATG
[0128] CSFV-Ilu ：
[0129] AAAACTTCCTGTACATTCAACTACGCAAAAACTTTGAAGAACAAGTACTATGAGCCCAG
[0130] CSFV-Ild ：
[0131] ACTGATACTCGCCCTTAAGCATATATTGCTGGAAGTAGCTGTCCCTGGGCTCATAGTAC
[0132] CSFV-12u ：
[0133] AAGGGCGAGTATCAGTACTGGTTTGACCTGGACGTGACTGACCGCCACTCAGATTACTT
[0134] CSFV-12d ：
[0135] TTCCTCCTAACAGTGCTACCACCACCAAGACAACAAATTCTGCGAAGTAATCTGAGTGG
[0136] CSFV-13u ：
[0137] CACTGTTAGGAGGAAGATATGTCCTGTGGCTAATAGTGACCTACATAGTTTTAACAGA
[0138] CSFV-13d ：ACCAGCGGCGAGTTGTTCTGTTAAAACTA
[0139] 實驗方法如下
[0140] 將引物
[0141] CSFV-lu，CSFV-ld，CSFV-2u，CSFV-2d，CSFV-3u，CSFV-3d，CSFV-4u，CSFV-4d 混合， 進行PCR反應，所得產物命名為CSFV-I ;將引物
[0142] CSFV-5u，CSFV-5d，CSFV-6u，CSFV-6d，CSFV-7u，CSFV-7d，CSFV-8u，CSFV-8d 混合， 進行PCR反應，所得產物命名為CSFV-2 ;將引物
[0143] CSFV-9u， CSFV-9d， CSFV-lOu， CSFV-lOd， CSFV-llu， CSFV-lld， CSFV-12U， CSFV-12d，CS FV-13u，CSFV-13d混合，進行PCR反應，所得產物命名為CSFV-3 ;然后將上述 三個產物即CSFV-1，CSFV-2, CSFV-3混合作為模板進行PCR反應即得到豬瘟病毒的E2基因 序列。
[0144] 上述四個PCR(本發(fā)明的聚合酶為TOYOBO公司產品，貨號：02510D1)反應條件如 下：94度，2分鐘X 1個循環(huán)，（98度，15秒，55度，30秒，68度，15秒）X30個循環(huán)，72度，7 分鐘X 1個循環(huán)。
[0145] 實施例2構建重組表達載體，
[0146] 測序證明序列正確后，將實施例1中PCR產物用NdeI和XhoI限制性內切酶（本 發(fā)明所采用的各種分子生物學用酶均購自NEB公司）進行雙酶切之后，插入到用相同兩個 酶切處理的pET30a(Novagen產品，貨號69909-3)載體中。
[0147] 實施例3合有豬瘟病毒E2重組蛋白的表達
[0148] 將豬瘟病毒重組表達質粒轉化至大腸桿菌BL21中，涂布于合lOOug/ml硫酸卡那 霉素（上海生工生物工程服務有限公司，貨號：KB0286)的LB平板上，37度過夜培養(yǎng)，挑取 單克隆菌落，用合有相同濃度的硫酸卡那霉素的300mlLB培養(yǎng)基37度培養(yǎng)至0D600達0. 6 左右，用終濃度為〇. ImM的IPTG(生工，貨號：IB0168)進行誘導表達，誘導條件為：37度，轉 速250rpm，5h。誘導之后，將培養(yǎng)液4度5000rpm離心20min收集菌體。
[0149] 圖1是本發(fā)明實施例中大腸桿菌中重組質粒的誘導表達示意圖。其中右邊為 pET30a-CSFV-E2未誘導，左邊為pET30a-CSFV-E2誘導之后，如圖1所示，帶有重組表達載體 的菌株經過誘導之后產生大量目的蛋白，即重組CSFV-E2蛋白。
[0150] 實施例4合有豬瘟病毒E2重組蛋白的純化及復性
[0151] 將菌體用 50ml 包涵體抽提液（20mM Tris-HCl，0. 5MUrea pH 7· 5,0· 5M NaCl，2% Triton X-100)重懸，然后超聲破碎，條件為超聲3s，間隔6s，共180次，12000rpm，4度離心 收集包涵體沉淀。
[0152] 用上樣緩沖液 Binding Buffer (50mM Tris，8M Urea，0· 5M Nacl，20mM 咪唑 pH8.0)50ml破碎包涵體，上柱純化，用洗脫緩沖液Elution BufTer(50mM Tris，8M Urea, 0. 5MNacl，300mM咪唑pH8.0)洗脫目的蛋白。圖2是本發(fā)明實施例中重組蛋白的純化示意 圖，其中1為重組E2菌體破碎后上樣，2為穿透（未結合Ni柱組分），3為洗脫樣品（純化 后E2重組蛋白）。
[0153] 將純化后的重組蛋白用透析緩沖液（ImM氧化型谷胱甘肽GSSH，2mM還原型谷胱甘 肽 GSH，2mMEDTA，20mM Tris，pH8. 5)透析，每隔 48h 換一次透析液。
[0154] 取出透析后的蛋白液，經據乙醇-20000進行濃縮，于-20度保存?zhèn)溆谩?br> [0155] 本發(fā)明雖然已以較佳實施例公開如上，但其并不是用來限定本發(fā)明，任何本領域 技術人員在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內，都可以利用上述揭示的方法和技術內容對本發(fā) 明技術方案做出可能的變動和修改，因此，凡是未脫離本發(fā)明技術方案的內容，依據本發(fā)明 的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化及修飾均屬于本發(fā)明技術方案的 保護范圍。
[0156]

【權利要求】
1. 一種用于檢測豬瘟病毒的重組抗原的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： 步驟a，基因合成，設計引物進行PCR反應，得到豬瘟病毒的E2基因序列如SEQ ID No: 1所示； 步驟b，構建重組表達載體，步驟a中的基因序列測序成功后，將該基因序列用限制性 內切酶進行雙酶切之后，插入到用相同兩個酶切處理的質粒表達載體中； 步驟c，合有豬瘟病毒E2重組蛋白的表達，將步驟b中的重組表達質粒轉化至大腸桿菌 中，進行誘導表達，誘導之后，收集菌體； 步驟d，合有豬瘟病毒E2重組蛋白的純化及復性，將步驟c收集的菌體破碎提取重組蛋 白，然后進行純化及復性，得到重組蛋白氨基酸序列如SEQ ID No :28所示。
2. 根據權利要求1所述的用于檢測豬瘟病毒的重組抗原的制備方法，其特征在于， 步驟a中，設計引物如下： CSFV-Iu ：ATGCAGCTAGCCTGCAAGGAAGATTACAGGTACGCAATATCATCAACCAATGAGATA CSFV-1d：ATTCTTTCCAGGTGGTGGTGAGACCTCCGGCCCCGAGTAGCCCTATCTCATTGGTTGA CSFV-2u ：CCACCTGGAAAGAATACAACCACGATTTGCAACTGAATGACGGGACCGTTAAGGCCATT CSFV-2d ：TGACCACATTAAGTGCTGTGACTTTAAAGGAACCTGCCACGCAAATGGCCTTAACGGT CSFV-3u ：CACTTAATGTGGTCAGTAGGAGGTATTTGGCATCATTGCATAAGGAGGCTTCACTCACT CSFV-3d ：GAGGCTTCACTCACTTCCGTGACATTTGAGCTCCTGTTCGACGGGACCAACCCATCAAC CSFV-4u ：CAAATGGGCACAGCCCGAACCCGAAGTCATCTCCCATTTCCTCAGTTGATGGGTTGGTC CSFV-4d ：CAAGGTTGTGTTGTACTTTCCCTTGACAACAGGACTCGTATCAAATGGGCACAGCC CSFV-5u ：TACAACACAACCTTGTTGAACGGTAGTGCTTACTATCTTGTCTGTCCAATAGGGTGGAC CSFV-5d ：TTCTCAGAGTTGTTGGGCTCACTGCTGTGCACTCTATAACACCCGTCCACCCTATTGGA CSFV-6u ：CAACAACTCTGAGAACAGAAGTGGTAAAGACCTTCAGGAGGGACAAGCCCTTTCCGCAC CSFV-6d ：AATAAATCTTCATTTTCCACTGTTGTGGTCACACAATCCATTCTGTGCGGAAAGGGCTT CSFV-7u ：AATGAAGATTTATTCTACTGTAAGTTGGGGGGCAACTGGACATGTGTGAAAGGTGAACC CSFV-7d ：CACACCATCTGCATTGTTTTACTAGCCCCCCCGTGTAGACCACTGGTTCACCTTTCACA CSFV-8u ：AATGCAGATGGTGTGGCTTTGACTTCAATGAGCCTGACGGACTCCCACACTACCCCATA CSFV-8d ：TCCACTATTCTGTAACCTGTCTCATTTGCCAAAATGCACTTACCTATGGGGTAGTGTGG CSFV-9u ：TTACAGAATAGTGGATTCAACAGACTGTAACAGAGATGGTGTCGTAATCAGCACAGAGG CSFV-9d ：ATGCACCTTGACAGTTGTGTTACCGATCAAGCACTCATGACTCCCCTCTGTGCTGATTA CSFV-1 Ou ：ACTGTCAAGGTGCATGCATCAGATGAAAGACTGGGCCCCATGCCATGCAGACCTAAAG CSFV-10 d ： TGTACAGGAAGTTTTCCTTACAGGTCCTGCACTAGAGACGATCTCTTTAGGTCTGCATG CSFV-Ilu ：AAAACTTCCTGTACATTCAACTACGCAAAAACTTTGAAGAACAAGTACTATGAGCCCAG CSFV-11d ：ACTGATACTCGCCCTTAAGCATATATTGCTGGAAGTAGCTGTCCCTGGGCTCATAGTAC CSFV-12u ：AAGGGCGAGTATCAGTACTGGTTTGACCTGGACGTGACTGACCGCCACTCAGATTACTT CSFV-12d ：TTCCTCCTAACAGTGCTACCACCACCAAGACAACAAATTCTGCGAAGTAATCTGAGTGG CSFV-13u ：CACTGTTAGGAGGAAGATATGTCCTGTGGCTAATAGTGACCTACATAGTTTTAACAGA CSFV-13 d ：ACCAGCGGCGAGTTGTTCTGTTAAAACTA, 將引物 CSFV-lu, CSFV-I，d, CSFV-2u, CSFV-2d, CSFV-3u, CSFV-3d, CSFV-4u, CSFV-4d 混合，進行PCR反應，所得產物命名為CSFV-I ; 將引物CSFV-5u，CSFV-5d，CSFV-6u，CSFV-6d，CSFV-7u，CSFV-7d，CSFV-8u，CSFV-8d混 合，進行PCR反應，所得產物命名為CSFV-2 ; 將引物 CSFV-9u， CSFV-9d， CSFV-lOu， CSFV-lOd， CSFV-Ilu， CSFV-IId, CSFV-12u， CSFV-12d， CSFV-13u，CSFV-13d混合，進行PCR反應，所得產物命名為CSFV-3 ;然后將上述三個產物 CSFV-1，CSFV-2, CSFV-3混合作為模板進行PCR反應，得到豬瘟病毒的E2基因序列如 SEQ ID No :1 所示。
3. 根據權利要求1所述的用于檢測豬瘟病毒的重組抗原的制備方法，其特征在于，步 驟c中將重組表達質粒轉化至大腸桿菌BL21中，利用合硫酸卡那霉素的培養(yǎng)基進行篩選， 挑取單克隆菌落后，用合有相同濃度的硫酸卡那霉素培養(yǎng)基37度培養(yǎng)至所需濃度，用IPTG 進行誘導表達，誘導之后，低溫離心收集菌體。
4. 根據權利要求4所述的用于檢測豬瘟病毒的重組抗原的制備方法，其特征在于，所 述硫酸卡那霉素的濃度為l〇〇ug/ml。
5. 根據權利要求4所述的用于檢測豬瘟病毒的重組抗原的制備方法，其特征在于，誘 導條件為37度，轉速250rpm，5h，誘導的IPTG濃度為0. ImM。
6. 根據權利要求1所述的用于檢測豬瘟病毒的重組抗原的制備方法，其特征在于，步 驟d中菌體采用超聲破碎，破碎條件為200w，超聲6s，間隔3s超聲一次，共180次。
7. 根據權利要求1所述的用于檢測豬瘟病毒的重組抗原的制備方法，其特征在于，步 驟d中重組蛋白的純化方法為離子交換層析，凝膠過濾層析和親和層析中的一種。
8. 根據權利要求1所述的用于檢測豬瘟病毒的重組抗原的制備方法，其特征在于，步 驟d中重組蛋白的純化方法為親和層析。
9. 一種如權利要求1所述的重組蛋白在制備豬瘟病毒檢測試劑中的應用。
10. -種檢測豬瘟病毒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包含權利要求1所述的重 組蛋白。
【文檔編號】C12N15/70GK104313037SQ201410494375
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年9月24日 優(yōu)先權日:2014年9月24日
【發(fā)明者】吳曉杰 申請人:杭州諾威泰克生物技術有限公司