京科968三系配套雜交種制種方法
【專利摘要】本發明公開了一種京科968三系配套雜交種制種方法，本發明提供了一種雜交制種的方法，包括如下步驟：以不育系S京724為不育系，京724為保持系，京92為恢復系，進行三系配套制種，得到雜交種京科968。本發明的實驗證明，本發明利用育成的不育系S京724、保持系京724和恢復系京92進行京科968三系配套雜交種制種，配制的不育化雜交種京科968種子在產量、抗性及其他農藝性狀上與常規制種方法生產的京科968種子基本相同。CGMCC No.86572013.12.25
【專利說明】京科968三系配套雜交種制種方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，尤其涉及一種京科968三系配套雜交種制種方法。
【背景技術】
[0002] 強優勢雜交種的選育和推廣是提高玉米產量的重要途徑。利用常規的制種方法配 制雜交種需要對母本進行人工去雄，不僅耗費大量的勞動力，增加種子生產成本，且存在由 于去雄不及時、不徹底影響種子質量的潛在風險。利用雄性不育系制種是保證種子純度提 高玉米產量的一種有效方法。
[0003] 早在上世紀五六十年代，國內外就開始了對玉米不育化制種的研究。細胞質雄性 不育由于容易實現不育系、保持系和恢復系的配套，是玉米育種中利用的主要類型。細胞質 雄性不育系可劃分為T、S和C型。60年代初，T型不育系引入我國。由于對玉米小斑病"T 小種"專化性侵染，T型不育系的應用受到嚴重限制。70年代，我國育種工作者從國外引進 C型、S型不育系。C型不育系雖然不育性較穩定、徹底，但其恢復系通常需要重新轉育，周 期長且步驟繁瑣，導致該型不育系在實踐中難以普及應用。S型不育系是3種類型中最大的 一個組，已有研究證明昌7-2等黃改系材料是其天然強恢復系。但S型不育系的育性因基 因型背景的不同而有較大差異，在特定的遺傳背景下育性高度穩定。國內優良玉米雜交種 的父本多屬黃改種質，因此充分利用S型不育系可以節省恢復系的轉育工作，是實現快速 不育化制種研究和應用的有效途徑。
[0004] 實現玉米細胞質雄性不育化制種的關鍵是不育系、保持系和恢復系的選育。選育 不育系最常用的方法是回交轉育法，即用穩定的不育系作非輪回親本，選擇優良自交系作 輪回親本，進行多代回交，育成不育性穩定的優良不育自交系，而原輪回親本便是該不育系 的保持系。但僅僅利用傳統的回交轉育方法，一般需回交5-6代，轉育周期較長，延緩了不 育化制種技術在玉米雜交種上的應用。利用回交轉育方法進行恢復系的選育比不育系更為 復雜，在回交的同時要進行測交，以測交結果作為恢復系的選擇標準；或在回交轉育中利用 不育細胞質提供育性的指標性狀。由于選育過程相對繁瑣，在恢復系尚未育成或只有部分 恢復性的情況下，須將不育化的雜交種子與正常雜交種種子按適當比例摻合使用，這就給 種子生產在技術和管理上提出了更高的要求。因此，如何加快不育系的選育速度、簡化恢復 系的選育過程，是目前雄性不育化制種技術亟需解決的問題。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種雜交制種的方法。
[0006] 本發明提供的方法，包括如下步驟：以玉米不育系S京724為不育系，玉米自交系 京724為保持系，玉米自交系京92為恢復系，進行三系配套制種，得到雜交種京科968。
[0007] 上述方法中，所述玉米不育系S京724為按照包括如下步驟的方法選育：以玉米S 型細胞質雄性不育系MD32CGMCCNo. 8657為供體、玉米自交系京724為受體，進行回交轉 育，得到京724的雄性不育系S京724。
[0008] 上述方法中，所述回交次數為3次。
[0009] 上述方法中，所述回交轉育包括如下步驟：
[0010] 1)以玉米雄性不育系MD32CGMCCNo. 8657為供體、玉米自交系京724為受體，雜 交，得到雄性不育雜交子代F1;
[0011] 2)以雄性不育雜交子代F1為母本、與京724回交，得到雄性不育BC1代群體；
[0012] 3)以雄性不育BC1代單株為母本、與京724繼續回交，得到雄性不育BC2代群體；
[0013] 4)以雄性不育BC2代單株為母本、與京724繼續回交，得到京724的雄性不育系S 京 724。
[0014]上述方法中，在步驟2)和步驟3)之間，還包括如下分子鑒定步驟：從所述雄性不 育BC1代群體中選取與所述玉米京724遺傳相似度在92. 5-95%的雄性不育BC1代單株。
[0015] 上述方法中，為了減少工作量，在所述分子鑒定步驟前，還包括如下步驟：從所述 雄性不育BC1代群體中選取表型與所述玉米京724 -致的雄性不育BC1代單株。
[0016] 上述方法中，所述從所述雄性不育BC1代群體中選取與所述玉米京724遺傳相似 度在92. 5-95 %的雄性不育BC1代單株的方法包括如下步驟：用40對SSR核心引物分別對 雄性不育BC1代單株和玉米自交系京724進行PCR擴增，得到SSR譜帶，通過比較BC1代單 株和玉米自交系京724的SSR圖譜，計算遺傳相似度；
[0017] 所述遺傳相似度計算公式：[1-(差異等位基因數八2X比較總位點數））]X100%
[0018] 所述差異等位基因數為用SSR核心引物擴增得到的所述雄性不育BC1代單株SSR 譜帶帶型與所述玉米自交系京724的SSR譜帶帶型不一致的等位基因數目；所述比較總位 點數為40。
[0019] 上述40對SSR核心引物中各個引物的序列分別為序列表中序列1-80所示，具體 見實施例的表1。
[0020] 上述方法中，在步驟3)和步驟4)之間，還包括如下分子鑒定步驟：從所述雄性不 育BC2代群體中選取與所述玉米京724遺傳相似度在98. 75 % -100 %的雄性不育BC2代單 株。
[0021] 上述方法中，為了減少工作量，在所述分子鑒定步驟前，還包括如下步驟：從所述 雄性不育BC2代群體中選取表型與所述玉米京724 -致的雄性不育BC2代單株。
[0022] 上述表型與所述玉米京724 -致為表型與玉米京724完全相同或接近；表型具體 為株高、穗位高、株型、雄穗分枝數和/或果穗性狀等。
[0023] 所述從所述雄性不育BC2代群體中選取與所述玉米自交系京724遺傳相似度在 98. 75% -100%的雄性不育BC2代單株的方法包括如下步驟：用引物A分別對雄性不育BC2 代單株和玉米自交系京724進行PCR擴增，得到SSR譜帶，通過比較BC2代單株和玉米自交 系京724的SSR圖譜，計算遺傳相似度；
[0024] 所述引物A為BC2代單株對應的母本BC1代與京724相比擴增帶型不同的SSR引 物；
[0025] 所述遺傳相似度計算公式：[1_(差異等位基因數八2父比較總位點數））]X100%
[0026] 所述差異等位基因數為用引物A擴增得到的所述雄性不育BC2代單株SSR譜帶帶 型與所述玉米自交系京724的SSR譜帶帶型不一致的等位基因數目；
[0027] 所述比較總位點數為40。
[0028] 玉米S型細胞質雄性不育系MD32CGMCCNo. 8657在選育玉米雄性不育系中的應 用也是本發明保護的范圍。
[0029] 上述玉米不育系S京724在雜交制種中的應用也是本發明保護的范圍。
[0030] 本發明的實驗證明，本發明具體有如下優勢：
[0031] 1、由于昌7-2等黃改材料是S型細胞質雄性不育系的強恢復系，京科968父本京 92為黃改種質，因此選擇京92具有強恢復性的S型不育系作為母本京724不育系轉育的供 體，節省了選育父本恢復系的繁瑣工作；
[0032] 2、利用分子標記輔助選擇技術與回交轉育技術結合，加快不育系的轉育速度，僅 需回交三代即獲得了京724不育系S京724 ;
[0033] 3、選用的S型不育系MD32不育性穩定、花粉敗育徹底，在已報道的玉米雜交種雄 性不育化制種研究中未見使用；
[0034] 總之，本發明利用育成的不育系S京724、保持系京724和恢復系京92進行京科 968三系配套雜交種制種，配制的不育化雜交種京科968種子在產量、抗性及其他農藝性狀 上與常規制種方法生產的京科968種子基本相同，且節省了常規制種中母本人工去雄的時 間和成本，消除了由于去雄不及時、影響種子質量的潛在風險。
【具體實施方式】
[0035] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0036] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0037] 實施例1、雄性不育系S京724的選育
[0038] -、不育系供體MD32細胞質雄性不育類型的確定
[0039] 1、玉米不育系MD32
[0040] 玉米不育系MD32選育過程：利用構建的X系群體（以Xl132為基礎）進行"高大 嚴"選系，從中選擇優良S5高代系與外引雜交種構建新的選系基礎群體。在自交后代中發 現不育株，雄穗花藥不外露，選擇同穗行表型相近的姊妹株對其進行成對授粉。雜交后代全 部表現徹底不育，植株表型也趨向基本一致。遂將該材料命名為玉米雄性不育系MD32。
[0041] 玉米不育系MD32不育性徹底：花藥不外露；
[0042] 玉米不育系MD32不育性穩定：在多種遺傳背景下，不育性表現徹底；
[0043] 玉米不育系MD32綜合性狀優良：種子芽勢旺盛，出苗力強，幼苗葉鞘色紫色，葉片 寬大，葉色濃綠，株型半緊湊，果穗筒型，粒型半硬粒型，綜合抗性好。
[0044] 玉米不育系MD32于2013年12月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普 通微生物中心（簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物 研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCCNo. 8657,該植株分類命名為玉米（Zeamays)。
[0045] 2、不育系MD32細胞質雄性不育類型的確定
[0046] 提取玉米不育系MD32幼苗的DNA作為模板，用如下表1的引物進行PCR擴增，得 到擴增產物在Agarose凝膠上，90V電泳1小時30分鐘。根據擴增片段圖譜鑒別玉米MD32 胞質不育類型。
[0047] 結果，利用C、T型引物對MD32的DNA進行PCR擴增時，均未檢測到擴增產物；利 用S型引物對其進行檢測時，PCR產物片段大小為885bp。因此確定MD32為S型細胞質雄 性不育系。
[0048] 表1為鑒定胞質類型的引物
[0049]
[0050] 二、玉米雄性不育系S京724的選育
【權利要求】
1. 一種雜交制種的方法，包括如下步驟：以玉米不育系s京724為不育系，玉米自交系 京724為保持系，玉米自交系京92為恢復系，進行三系配套制種，得到雜交種京科968。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述玉米不育系S京724為按照包括如 下步驟的方法選育：以玉米S型細胞質雄性不育系MD32 CGMCC No. 8657為供體、玉米自交 系京724為受體，進行回交轉育，得到京724的雄性不育系S京724。
3. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于：所述回交次數為3次。
4. 根據權利要求2或3中所述的方法，其特征在于：所述回交轉育包括如下步驟： 1) 以玉米雄性不育系MD32 CGMCC No. 8657為供體、玉米自交系京724為受體，雜交，得 到雄性不育雜交子代匕； 2) 以雄性不育雜交子代匕為母本、與京724回交，得到雄性不育代群體； 3) 以雄性不育代單株為母本、與京724繼續回交，得到雄性不育BC2代群體； 4) 以雄性不育BC2代單株為母本、與京724繼續回交，得到京724的雄性不育系S京 724。
5. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于：在步驟2)和步驟3)之間，還包括如下分 子鑒定步驟：從所述雄性不育代群體中選取與所述玉米京724遺傳相似度在92. 5-95% 的雄性不育BCjf單株。
6. 根據權利要求5所述的方法，其特征在于：在所述分子鑒定步驟前，還包括如下步 驟：從所述雄性不育代群體中選取表型與所述玉米京724 -致的雄性不育代單株。
7. 根據權利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于：在步驟3)和步驟4)之間，還包 括如下分子鑒定步驟：從所述雄性不育BC2代群體中選取與所述玉米京724遺傳相似度在 98. 75% -100%的雄性不育BC2代單株。
8. 根據權利要求7所述的方法，其特征在于：在所述分子鑒定步驟前，還包括從所述雄 性不育BC2代群體中選取表型與所述玉米京724 -致的雄性不育BC2代單株。
9. 權利要求1-8所述方法中的所述玉米不育系S京724在雜交制種中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104351036SQ201410493909
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年9月24日 優先權日:2014年9月24日
【發明者】趙久然, 宋偉, 邢錦豐, 王元東, 段民孝, 劉春閣, 馮培煜, 張如養, 王鳳格, 毛振武, 李瑞媛, 王乃順, 王文廣, 張莎莎 申請人:北京市農林科學院