用于快速檢測β-內酰胺酶耐藥基因的多重PCR引物組的制作方法

用于快速檢測β-內酰胺酶耐藥基因的多重PCR引物組的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種用于快速檢測β-內酰胺酶耐藥基因的多重PCR引物組，采用所述引物組能夠實現一次性同時擴增β-內酰胺酶耐藥基因blaTEM、blaSHV、blaOXA、blaCTX-M-1和blaCTX-M-9，再通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。本發明的多重PCR引物組可用于同時檢測臨床細菌標本中常見的5種β-內酰胺酶耐藥基因，克服了傳統藥敏實驗操作繁瑣，費時耗力等不足，充分揮發了多重PCR方法在β-內酰胺酶耐藥基因檢測中的應用，提高了實驗檢測效率和準確性。
【專利說明】用于快速檢測β -內酰胺酶耐藥基因的多重PCR引物組

【技術領域】
[0001] 本發明涉及快速檢測內酰胺酶耐藥基因的多重PCR引物，特別涉及用于快速 檢測 β -內酰胺酶耐藥基因 blaTEM、blaSHV、blaOXA、blaCTX-M-l 和 blaCTX-M-9 的多重 PCR 引物組，本發明屬于醫學分子生物學領域。

【背景技術】
[0002] β_內酰胺類抗生素是指化學結構中具有β_內酰胺環的一大類抗生素，包括 青霉素、頭孢菌素、頭霉素、單環β_內酰胺類、β_內酰胺酶阻滯劑以及碳青霉烯類抗生 素。各種內酰胺類抗生素的作用機制均相似，都能抑制胞壁粘肽合成酶，從而阻礙細 胞壁粘肽合成，使細菌胞壁缺損，菌體膨脹裂解。內酰胺類抗生素是目前臨床抗感染 治療最普遍應用的一類抗生素，隨著這類抗生素的廣泛使用和致病菌的變遷，產生了細 菌對這類抗生素的耐藥性問題，而且耐藥發生率相當高。細菌產生超廣譜內酰胺酶 (extended-spectrumP-Lactamase, ESBLs)是 80%細菌耐藥的原因之 一。β-內酰胺酶是 指能催化水解6-氨基青霉烷酸出-APA)和7-氨基頭孢烷酸（7-ACA)及其N-酰基衍生物分 子中β -內酰胺環酰胺鍵的滅活酶，自20世紀80年代初，ESBLs持續地在腸桿菌科感染特 別是那些由大腸桿菌和肺炎克雷伯菌引起的復雜治療中發現，它們也可由非發酵的革蘭氏 陰性菌產生，如鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌。在中國幾個中心的過去研究報告稱，ESBL在 肺炎克雷伯菌中的流行率為20% -40%。細菌產生β -內酰胺酶是細菌對β -內酰胺類抗 生素耐藥的主要機制。β-內酰胺酶是細菌產生的可水解β-內酰胺類抗生素的酶，Ambler 等根據β-內酰胺酶分子結構中氨基酸序列差異，將β-內酰胺酶分成A、B、C和D四種類 型。1995年Bush等提出了 β-內酰胺酶的功能分類方案，依據酶的底物和酶被抑制不同， 將其分為4群，其中2和3群又分為許多亞群，這其中超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs)可以水 解除頭霉素類（頭孢西丁和頭孢替坦）以外的多數青霉素、第三與第四代頭孢菌素和氨曲 南等抗生素，屬于Ambler分類的A類，按Bush分類屬2be群。目前,ESBLs可分為TEM族、 SHV族、CTX-M族、OXA族及一些不屬于上述任何一個家族的類型，其中以TEM族和SHV族種 類最多。產ESBLs的細菌呈世界性分布，但不同地區流行的ESBLs基因型不同。如：美國主要 流行TEM、SHV型ESBLs ;阿根廷以CTX-M型ESBLs為主；西班牙主要流行CTX-M-10,其次是 SHV-2和TEM-4 ;希臘以SHV-5為主，其次為CTX-M型的ESBLs ;日本流行Toho-I和SHV-12 ; 我國主要流行TEM、SHV、OXA和CTX-M型ESBLs，在過去30年中，ESBL亞型和變種在社區和 醫院的種量的上升不僅使我們擔心，急需我們建立一種能在單次實驗中檢測多種ESBL的 基因型的方法，這種方法對臨床和流行病學上檢測ESBLs是非常有用的，本發明在以上研 究的基礎上，建立了快速檢測β -內酰胺酶耐藥基因 blaTEM、blaSHV、blaOXA、blaCTX-M-1 和 blaCTX-M-9。
[0003] 傳統的細菌耐藥性檢測方法主要有常規藥敏實驗、抗性蛋白檢測方法和耐藥性分 子檢測方法等。這些方法的特點是方便、易操作、成本低，而且靈活性強。測定的細菌和藥物 可靈活選擇。其缺點是操作繁瑣、經驗依賴性強、報告結果慢。目前常用的快速檢測細菌耐 藥基因的方法，包括聚合酶鏈反應-單鏈構象多態性分析（PCR-SSCP)、質粒指紋圖譜分析、 PCR限制性片段長度多態性分析（PCR-RFLP)和多重PCR。其中多重PCR的應用最為廣泛， 因為耐藥基因多種多樣，同一株細菌可攜帶多種耐藥基因，表現為多重耐藥性，需要對多種 耐藥基因同時檢測，多重PCR正好滿足了這種需求，并且多重PCR具有快速、靈敏、特異性好 等特點。近年來，多重PCR也來越廣泛地應用在細菌耐藥性的檢測上。濮小英（濮小英，潘 勁草，汪皓秋，黃志成，顧亞明。用多重PCR方法進行志賀菌超廣譜β-內酰胺酶基因分型。 中華預防醫學雜志，2009,43(3) :201-205。）等人公開了一種志賀菌超廣譜β-內酰胺酶 (ESBLs)基因型分類的多重PCR方法，用于檢測CTX-M、TEM、SHV、0XA-1等4個基因型，但其 多重PCR結果與8次單個PCR結果一致率為94. 12%，還有提升的空間。劉文恩（劉文恩， Peter M Hawkey, Craig J Munday。多重-PCR檢測CTX-M超廣譜β-內酰胺酶基因。實用 預防醫學，2006, 13(4) :838-840。）等人公開了一種在腸桿菌中檢測CTX-M組基因的多重 PCR方法，但檢測的基因只有一類。本發明設計了 5對特異性引物，把這些引物混合在一起 加入多重PCR反應體系進行多重PCR擴增檢測，以達到快速檢測β -內酰胺酶耐藥基因的 目的。


【發明內容】

[0004] 本發明的目的之一是提供一組用于檢測β-內酰胺耐藥基因的多重PCR引物組。
[0005] 本發明的目的之二是提供一種利用所述多重PCR引物組檢測β -內酰胺耐藥基因 的方法。
[0006] 為達到上述目的，本發明采用了以下技術方案：
[0007] 本發明的一組用于快速檢測內酰胺酶耐藥基因的多重PCR引物組，其特征 在于，所述引物組由五對引物組成，分別用于檢測β -內酰胺酶耐藥基因 blaTEM、blaSHV、 blaOXA、blaCTX-M-1和blaCTX-M-9,其中，用于β -內酰胺酶耐藥基因 blaTEM檢測的引物 序列為SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示，用于β-內酰胺酶耐藥基因 WaSHV檢測的引物 序列為SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示，用于β -內酰胺酶耐藥基因 WaOXA檢測的引 物序列為SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6所示，用于β -內酰胺酶耐藥基因 blaCTX-Μ-Ι檢測 的引物序列為SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示，用于β-內酰胺酶耐藥基因 blaCTX-M-9 檢測的引物序列為SEQ ID NO :9和SEQ ID NO :10所示。
[0008] 所述多重PCR引物組檢測用于檢測β-內酰胺酶耐藥基因 blaTEM、blaSHV、 blaOXA、blaCTX-M-l 和 blaCTX-M-9 時，包括以下步驟：
[0009] (I)DNA 模板提取：
[0010] 采用DNA提取試劑盒和核酸提取儀提取和純化臨床分離的腸桿菌科菌株的總 DNA ；
[0011] ⑵采用多重PCR擴增檢測β-內酰胺酶耐藥基因 blaTEM、blaSHV、blaOXA、 blaCTX-M-1 和 blaCTX-M-9,反應體系如下：
[0012] 反應體系，總體系20 μ L :
[0013]

【權利要求】
1. 用于快速檢測β-內酰胺酶耐藥基因的多重PCR引物組，其特征在于，所述引物組由 五對引物組成，分別用于檢測β -內酰胺酶耐藥基因 blaTEM、blaSHV、blaOXA、blaCTX-M-1 和blaCTX-M-9,其中，用于β -內酰胺酶耐藥基因 blaTEM檢測的引物序列為SEQ ID NO :1 和SEQ ID NO :2所示，用于β -內酰胺酶耐藥基因 blaSHV檢測的引物序列為SEQ ID NO :3 和SEQ ID NO :4所示，用于β -內酰胺酶耐藥基因 blaOXA檢測的引物序列為SEQ ID NO :5 和SEQ ID NO :6所示，用于β -內酰胺酶耐藥基因 blaCTX-M-1檢測的引物序列為SEQ ID N0:7和SEQIDN0:8所示，用于β-內酰胺酶耐藥基因 blaCTX-M-9檢測的引物序列為SEQ ID NO :9 和 SEQ ID NO :10 所示。
2. 如權利要求1所述的多重PCR引物組，其特征在于，用于檢測β-內酰胺酶耐藥基因 blaTEM、blaSHV、blaOXA、blaCTX-M-l 和 blaCTX-M-9 時，包括以下步驟： (l)DNA模板提取： 采用DNA提取試劑盒和核酸提取儀提取和純化臨床分離的腸桿菌科菌株的總DNA ; ⑵采用多重PCR擴增檢測β -內酰胺酶耐藥基因 blaTEM、blaSHV、blaOXA、 blaCTX-M-1 和 blaCTX-M-9,反應體系如下： 反應體系，總體系20 μ L 細菌 DNA 1μ§； ().5pmol/L 的 SEQ 丨D NO: 1-9 所示的引物 各 0.5pL; 5xPCR 緩沖液 4.0μ?; 1U DNA 聚合酶 1 ·0μ?; 250μιηο1/? dNTP 4.0μ?; ddH20 補充至 20.uL; (3) 多重PCR反應循環參數如下： 預變性：94°C，5 ?lOmin ;變性：94°C，30-60s ;退火：61°C，30-60s ;延伸：72°C，1 ? 2min，連續30?40個循環；最終延伸：72°C，5?lOmin ; (4) 耐藥基因檢測結果鑒定： 取4 μ L PCR產物通過2%的瓊脂糖凝膠電泳，100V?120V電壓電泳45?60min，溴化 乙錠浸潤染色凝膠5min后，在紫外光下觀察，DNA大小標記米用100bp間隔的DNA分子量標 記進行比對，802bp、758bp、564bp、665bp、518bp 的條帶，分別指示 blaTEM、blaSHV、blaOXA、 blaCTX-M-1 和 blaCTX-M-9 基因。
3. 根據權利要求2所述的多重PCR引物組，其特征在于，步驟（3)中所述的多重PCR反 應循環參數為：預變性：94°C，10min ;變性：94°C，45s ;退火：61°C，45s ;延伸：72°C，lmin， 連續30個循環；最終延伸：72°C，lOmin。
4. 根據權利要求2所述的多重PCR引物組，其特征在于，步驟（4)中所述的瓊脂糖凝膠 電泳的條件為：取4 μ L PCR產物通過2%的瓊脂糖凝膠電泳，120V電壓電泳45min，溴化乙 錠浸潤染色凝膠5min后，在紫外光下觀察。
5. 權利要求1-4任一項所述的多重PCR引物組在制備檢測β-內酰胺酶耐藥基因的 試劑中的應用，其中，所述β -內酰胺酶耐藥基因包括blaTEM、blaSHV、blaOXA、blaCTX-M-l 和 blaCTX-M-9。
6. -種用于快速檢測β-內酰胺酶耐藥基因的多重PCR檢測試劑盒，其特征在于含有 權利要求1-4任一項所述的多重PCR引物組。
【文檔編號】C12N15/11GK104293925SQ201410489889
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月23日 優先權日:2014年9月23日
【發明者】張鳳民, 詹姆斯, 宋武琦, 付英梅, 張文莉, 蔡文輝 申請人:哈爾濱醫科大學