一種食品致病菌的檢測試劑盒及檢測方法

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一種食品致病菌的檢測試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發明涉及一種食品致病菌的快速檢測試劑盒及檢測方法，所述的食品致病菌的檢測試劑盒由以下組分制成：TaqDNA聚合酶
2~5U,dNTP3×10-3~5×10-3mmol,10×反應緩沖液2.5ul,致病菌引物對50×10-3~100×10-3mmol,緩沖溶液A30-50ml,緩沖溶液B30-50ml，硫酸銨30-50ml。采用該檢測試劑盒可以對食品中空腸彎曲桿菌、副溶血弧菌、產氣莢膜桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌、宋內志賀氏菌進行多重PCR檢測，檢測迅速，檢測結果可靠，靈敏度高，尤其適合食品安全監管部門對市售食品有安全監測及質量監督，從而保障人們的健康。
【專利說明】一種食品致病菌的檢測試劑盒及檢測方法
[0001]

【技術領域】
[0002]本發明屬于食品安全檢測領域，具體涉及食品致病菌的檢測試劑盒及檢測方法。

【背景技術】
[0003]民以食為天，食以安為先，但近年來，食品安全件事頻發，對人們的健康構成了較大的威脅。食品微生物污染問題日漸突出，已成為全球范圍內重要的公共衛生問題。根據美國農業部經濟研究局的統計結果顯示，沙門氏菌、致病性大腸桿菌、彎曲桿菌、副溶血性弧菌、葡萄球菌及毒素、致病性蠟樣芽胞桿菌、產氣莢膜梭菌、變形桿菌屬、李斯特菌、志賀氏菌等幾類重要的細菌會造成巨大的經濟損失，而志賀氏菌具有高度傳染性，是引起感染性腹瀉的主要致病菌之一；致病性蠟樣芽胞桿菌多存在于蛋白質和碳水化合物豐富的米飯及肉類食品中，可引起腹瀉綜合征及嘔吐綜合征。人們在食用被上述這些細菌污染的食物后，可引起腹瀉、惡心、嘔吐，嚴重者可致腹痛、出血性腸炎及尿毒綜合征甚至死亡。近年來，隨著器官移植、導管技術及血液疾病、惡性腫瘤等免疫力低下的患者日益增加，條件致病霉菌感染也逐年上升。因此，食品安全性檢測與評價逐步受到我國及其他國家的重視與關注。
[0004]針對食品微生物污染的現狀，各國已經發展和衍生了多種食品微生物檢測技術，目前，主要的幾種快速檢測技術包括實時熒光PCR法、熒光免疫檢測法、基于PCR基礎的凝膠電泳法等，但上述方法均有應用范圍的局限性，實時熒光PCR法檢測成本高，對致病菌的檢測范圍小；基于PCR基礎的凝膠電泳法操作繁瑣，易引起污染。因此，尋找和建立一種快速、高效、準確的食品微生物的檢測方法十分重要。

【發明內容】

[0005]本發明的目的就是針對上述現有技術中存在的缺陷提供一種食品致病菌的快速檢測試劑盒及檢測方法。
[0006]本發明的技術方案如下:
一種食品致病菌的檢測試劑盒，該檢測試劑盒由以下組分制成:
TaqDNA聚合酶2?5U,
dNTP3X10-3?5X10-3mmol,
1X反應緩沖液2.5 ul ，
致病菌引物對50X10-3?100X10-3mmol,
緩沖溶液A30-50ml,
緩沖溶液B30-50ml
硫酸銨30-50ml。
所述的緩沖溶液A是濃度為0.15-0.30mmol/L的TEAA水溶液，所述的緩沖溶液B是TEAA水溶液與乙腈的混合溶液，所述的TEAA水溶液與乙腈的混合溶液的體積比為(2_5):(1-3)。
[0007]優選的，所述的硫酸銨的濃度為0.3-0.6mmol/L。
所述的1X反應緩沖液由100-200ml Tris-C1、50_100ml 氯化物、10_20mlTrotpmx-100配制而成。
[0008]優選的，所述的Trotpmx-100的質量體積濃度為0.5%_2% ;所述的Tris-CI的濃度為2X10-3?5X10-3mmol /L ;所述的氯化物的濃度為2_5mol/L。
[0009]優選的，所述的氯化物選自氯化鎂、氯化鈣、氯化鉀或氯化鈉中的一種或多種；所述的致病菌引物對選自空腸彎曲桿菌引物對、副溶血弧菌引物對、產氣莢膜桿菌引物對、金黃色葡萄球菌弓I物對、蠟樣芽胞桿菌弓丨物對、宋內志賀氏菌引物對的一種或多種。
[0010]采用如上所述的檢測試劑盒對待測樣品進行致病菌檢測的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟:
(1)無菌操作采集待測樣品5-20g，加入100-200ml滅菌鹽水中，采用均質器進行均質，制得樣品待測液；
(2)取10-20ml步驟(I)中制得的樣品待測液接種于加有增菌液的蛋白胨及瓊脂培養基內，在37°C培養4-6h ；
(3)多重PCR擴增與分析，具體步驟包括:
Ca)取步驟(2)中培養的菌落加至含有5-10ml滅菌生理鹽水的離心管中，以10000-12000 r/min速度離心 3-5min,棄上清，加 1X 反應緩沖液 5-lOml，以 10000-12000r/min速度離心3_5min，棄上清，反復洗滌3次；加120_150ul雙蒸水，混勻，100。。煮沸8-10min后，以10000-12000 r/min速度離心8_10min,得到致病菌DNA液;
(b)取Iul 步驟(a)中得到的 DNA 液，TaqDNA 聚合酶 1U, dNTP lX10-3mmol, 14ul滅菌超純水加入至PCR反應管中，6000-8000 r/min,離心8_10s，加入硫酸銨5_10ml，以10000-12000 r/min速度離心8-lOmin，然后進行PCR循環制得PCR擴增產物；
(c)將步驟(b)中制得的擴增產物進行變性高效液相色譜分析，色譜柱:PS-DVB&C18DNASep色譜柱；柱溫:50°C ;流動相:緩沖溶液A:緩沖溶液B ；
根據變性高相液相色譜中待征色譜峰的保留時間、峰高、峰寬,來確定待測樣品中致病菌的種類和含量。
[0011]優選的，步驟(I)中所述的滅菌鹽水的質量體積濃度為0.2-0.5%。
[0012]優選的，所述的增菌液為GN增菌液，所述的培養基的PH為7-8。優選的，所述的步驟(c)中的多利PCR擴增參數為:
流動相體積比:
Omin,緩沖溶液A:緩沖溶液B體積比為48%:52%;
0.5min,緩沖溶液A:緩沖溶液B體積比為42.9%: 57.1%;
2.4min,緩沖溶液A:緩沖溶液B體積比為40.1%:59.9%;
4.3min,緩沖溶液A:緩沖溶液B體積比為38.2%:61.8%;
6.1min,緩沖溶液A:緩沖溶液B體積比為36.9%:63.1%;
8 min,緩沖溶液A:緩沖溶液B體積比為36.0%:64.0%;
預變性:95°C，3min ；
進入循環:95°C變性60s, 55°C退火60s，70°C延伸60s，30次循環；終止延伸:70°C,6min ；
流速:0.5 ml -lml/min ；
進樣量:5ul。
[0013]和現有技術相比，本發明的有益效果如下:
1.本組發明將PCR技術與DHPLC技術有機的結合在一起，對食品中常見的多種致病菌同時進行檢測，檢測方法便捷，檢測準確，靈敏度高，可節省大量的人力與財力，可滿足食品監管部門對市售食品的質量監督。
[0014]2.采用多重PCR技術，在同一反應體系中加入多種致病菌的引物，與特異性的模板結合，經過變性、退火、延伸及30個循環后，在同一反應體系中可擴增多條目的DNA片斷；由于DNA聚合酶具有極高的保真性，所以同一反應體系中各引物交叉結合而引起非特異性擴增的可能性幾乎為零，保證了多重PCR檢測的敏感性，特異性，而多重PCR具有高效、經濟、簡便等優點，尤其適用于食品微生物的檢測。
[0015]3.由于某些食品中微生物含量較低，在檢測時可能出現假陰性，從而漏檢，而GB/T 4789-2003中對食品微生物的檢測步驟包括前增菌、增菌、選擇性平板分離培養等，步驟繁瑣，本組發明在檢測前對樣品均質后直接接種于加入了增菌液的蛋白胨及營養瓊脂培養基中進行培養，可一定程度達到增菌效果，避免了傳統增菌的繁瑣，也保證了后續檢測的準確性。
[0016]4.本發明在PCR擴增前，先加入硫酸銨并離心，硫酸銨可破壞蛋白質的穩定因素，使蛋白質析出，本發明中，加入硫酸銨可去除相關試劑以后的其他雜質蛋白，可解開引物與模板的非特異性結合，提高PCR反應的特異性，加入0.3-0.6mmol/L的硫酸銨可使PCR反應對退火溫度的要求寬松許多。

【具體實施方式】
[0017]下面結合實施例對本發明做進一步說明。
[0018]實施例中所述的TaqDNA聚合酶為市售材料；所述的dNTP為脫氧核糖核苷三磷酸，所述的致病菌弓I物對均為市售材料。
[0019]實施例1
一種食品致病菌的檢測試劑盒，該檢測試劑盒由以下組分制成:
TaqDNA聚合酶2U,
dNTP3X10_3mmol,
1X反應緩沖液2.5 ul ，
空腸彎曲桿菌引物對50X10-3mmol,
緩沖溶液A30ml,
緩沖溶液B30ml
硫酸銨30ml。
所述的緩沖溶液A是濃度為0.15mmol/L的TEAA水溶液，所述的緩沖溶液B是TEAA水溶液與乙腈的混合溶液，所述的TEAA水溶液與乙腈的混合溶液的體積比為2:1。
[0020]所述的硫酸銨的濃度為0.3mmol/L。
所述的1X反應緩沖液由1001 Tris-CI,50ml氯化物、1ml Trotpmx-100配制而成。[0021 ] 所述的Trotpmx-100的質量體積濃度為0.5% ;所述的Tris-CI的濃度為2 X 1^mmol /L ;所述的氯化物為氯化鎂，其濃度為2mol/L。
[0022]采用如上所述的檢測試劑盒對待測樣品進行致病菌檢測的檢測方法，包括以下步驟:
(1)無菌操作采集待測樣品5g，加入10ml滅菌鹽水中，采用均質器進行均質，制得樣品待測液；
(2)取1ml步驟(I)中制得的樣品待測液接種于加有增菌液的蛋白胨及瓊脂培養基內，在37°C培養4h ；
(3)多重PCR擴增與分析，具體步驟包括:
(a)取步驟(2)中培養的菌落加至含有5ml質量體積濃度為0.2%的滅菌生理鹽水的離心管中，以10000 r/min速度離心3min,棄上清,加1X反應緩沖液5ml,以10000 r/min速度離心3min，棄上清，反復洗滌3次；加120ul雙蒸水，混勻，100°C煮沸8min后，以10000r/min速度離心8min,得到致病菌DNA液；
(b)取Iul 步驟(a)中得到的 DNA 液，TaqDNA 聚合酶 1U, dNTP I X 10-3mmol, 14ul 滅菌超純水加入至PCR反應管中，6000r/min,離心8s,加入硫酸銨5ml,以10000 r/min速度離心8min，然后進行PCR循環制得PCR擴增產物；
(c)將步驟(b)中制得的擴增產物進行變性高效液相色譜分析，色譜柱:PS-DVB&C18DNASep色譜柱；柱溫:50°C ;流動相:緩沖溶液A:緩沖溶液B ；
根據變性高相液相色譜中待征色譜峰的保留時間、峰高、峰寬，來確定待測樣品中致病菌的種類和含量。
[0023]步驟(2)中所述的增菌液為GN增菌液，所述的培養基的PH為7。
[0024]優選的，所述的步驟(C)中的多利PCR擴增參數為:
流動相體積比:
Omin,緩沖溶液A:緩沖溶液B體積比為48%:52%;
0.5min,緩沖溶液A:緩沖溶液B體積比為42.9%: 57.1%;
2.4min,緩沖溶液A:緩沖溶液B體積比為40.1%:59.9%;
4.3min,緩沖溶液A:緩沖溶液B體積比為38.2%:61.8%;
6.1min,緩沖溶液A:緩沖溶液B體積比為36.9%:63.1%;
8 min,緩沖溶液A:緩沖溶液B體積比為36.0%:64.0%;
預變性:95°C，3min ；
進入循環:95°C變性60s, 55°C退火60s，70°C延伸60s，30次循環；
終止延伸:70°C,6min ；
流速:0.5 ml/min ；
進樣量:5ul。
[0025]實施例2
一種食品致病菌的檢測試劑盒，該檢測試劑盒由以下組分制成:
TaqDNA聚合酶5U,
dNTP5X10_3mmol,
1X反應緩沖液2.5 ul ，副溶血弧菌引物對100X10_3mmol，
緩沖溶液A50ml,
緩沖溶液B50ml
硫酸銨50ml。
所述的緩沖溶液A是濃度為0.30mmol/L的TEAA水溶液，所述的緩沖溶液B是TEAA水溶液與乙腈的混合溶液，所述的TEAA水溶液與乙腈的混合溶液的體積比為5:3。
[0026]所述的硫酸銨的濃度為0.6mmol/L。
所述的1X反應緩沖液由200ml Tris-CIUOOml氯化物、20ml Trotpmx-100配制而成。
[0027]優選的，所述的Trotpmx-100的質量體積濃度為2% ;所述的Tris-CI的濃度為5X10_3mmol /L ;所述的氯化物為氯化|丐，其濃度為5mol/L。
[0028]采用如上所述的檢測試劑盒對待測樣品進行致病菌檢測的檢測方法，包括以下步驟:
(1)無菌操作采集待測樣品20g，加入200ml質量體積濃度為0.5%滅菌鹽水中，采用均質器進行均質，制得樣品待測液；
(2)取20ml步驟(I)中制得的樣品待測液接種于加有增菌液的蛋白胨及瓊脂培養基內，在37°C培養6h ；
(3)多重PCR擴增與分析，具體步驟包括:
Ca)取步驟(2)中培養的菌落加至含有1ml滅菌生理鹽水的離心管中，以12000 r/min速度離心5min,棄上清,加1X反應緩沖液10ml,以12000 r/min速度離心5min,棄上清，反復洗滌3次；加150ul雙蒸水，混勻，100°C煮沸1min后，以12000 r/min速度離心lOmin，得到致病菌DNA液；
(b)取Iul 步驟(a)中得到的 DNA 液，TaqDNA 聚合酶 1U, dNTP lX10-3mmol, 14ul 滅菌超純水加入至PCR反應管中，8000 r/min,離心10s，加入硫酸銨10ml，以12000 r/min速度離心lOmin，然后進行PCR循環制得PCR擴增產物；
(c)將步驟(b)中制得的擴增產物進行變性高效液相色譜分析，色譜柱:PS-DVB&C18DNASep色譜柱；柱溫:50°C ;流動相:緩沖溶液A:緩沖溶液B ;
根據變性高相液相色譜中待征色譜峰的保留時間、峰高、峰寬,來確定待測樣品中致病菌的種類和含量。
[0029]優選的，所述的增菌液為GN增菌液，所述的培養基的PH為8。優選的，所述的步驟
(c)中的多利PCR擴增參數為:
流動相體積比:
Omin,緩沖溶液A:緩沖溶液B體積比為48%:52%;
0.5min,緩沖溶液A:緩沖溶液B體積比為42.9%: 57.1%;
2.4min,緩沖溶液A:緩沖溶液B體積比為40.1%:59.9%;
4.3min,緩沖溶液A:緩沖溶液B體積比為38.2%:61.8%;
6.1min,緩沖溶液A:緩沖溶液B體積比為36.9%:63.1%;
8 min,緩沖溶液A:緩沖溶液B體積比為36.0%:64.0%;
預變性:95°C，3min ；進入循環:95°C變性60s, 55°C退火60s，70°C延伸60s，30次循環；
終止延伸:70°C,6min ；
流速:0.5 ml -lml/min ；
進樣量:5ul。
[0030]實施例3
一種食品致病菌的檢測試劑盒，該檢測試劑盒由以下組分制成:
TaqDNA聚合酶3U,
dNTP4X10-3mmol,
1X反應緩沖液2.5 ul ，
金黃色葡萄球菌引物對、80X10-3mmol，
緩沖溶液A40ml,
緩沖溶液B40ml
硫酸銨40ml。
所述的緩沖溶液A是濃度為0.20mmol/L的TEAA水溶液，所述的緩沖溶液B是TEAA水溶液與乙腈的混合溶液，所述的TEAA水溶液與乙腈的混合溶液的體積比為3:2。
[0031]優選的，所述的硫酸銨的濃度為0.5mmol/L。
所述的1X反應緩沖液由150ml Tris_C1、80ml氯化物、15ml Trotpmx-100配制而成。
[0032]優選的，所述的Trotpmx-100的質量體積濃度為1.5% ;所述的Tris-CI的濃度為
3.5 X 10_3_ο1 /L ;所述的氯化物為濃度為氯化鉀，其濃度為3.5mol/L。
[0033]采用如上所述的檢測試劑盒對待測樣品進行致病菌檢測的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟:
(1)無菌操作采集待測樣品15g，加入150ml滅菌鹽水中，采用均質器進行均質，制得樣品待測液；
(2)取10-20ml步驟(I)中制得的樣品待測液接種于加有增菌液的蛋白胨及瓊脂培養基內，在37°C培養4-6h ；
(3)多重PCR擴增與分析，具體步驟包括:
Ca)取步驟(2)中培養的菌落加至含有5-10ml質量體積濃度為0.3%的滅菌生理鹽水的離心管中，以11000 r/min速度離心4min,棄上清，加1X反應緩沖液8ml，以11000 r/min速度離心4min,棄上清，反復洗漆3次；加130ul雙蒸水，混勻，10(TC煮沸9min后，以11000 r/min速度離心9min,得到致病菌DNA液；
(b)取Iul 步驟(a)中得到的 DNA 液，TaqDNA 聚合酶 1U, dNTP lX10-3mmol, 14ul 滅菌超純水加入至PCR反應管中，7000 r/min,離心9s，加入硫酸銨8ml，以11000 r/min速度離心9min，然后進行PCR循環制得PCR擴增產物；
(c)將步驟(b)中制得的擴增產物進行變性高效液相色譜分析，色譜柱:PS-DVB&C18DNASep色譜柱；柱溫:50°C ;流動相:緩沖溶液A:緩沖溶液B ；
根據變性高相液相色譜中待征色譜峰的保留時間、峰高、峰寬，來確定待測樣品中致病菌的種類和含量。
[0034]優選的，所述的增菌液為GN增菌液，所述的培養基的PH為7.5。優選的，所述的步驟(C)中的多利PCR擴增參數為:
流動相體積比:
Omin,緩沖溶液A:緩沖溶液B體積比為48%:52%;
0.5min,緩沖溶液A:緩沖溶液B體積比為42.9%: 57.1%;
2.4min,緩沖溶液A:緩沖溶液B體積比為40.1%:59.9%;
4.3min,緩沖溶液A:緩沖溶液B體積比為38.2%:61.8%;
6.1min,緩沖溶液A:緩沖溶液B體積比為36.9%:63.1%;
8 min,緩沖溶液A:緩沖溶液B體積比為36.0%:64.0%;
預變性:95°C，3min ；
進入循環:95°C變性60s, 55°C退火60s，70°C延伸60s，30次循環；
終止延伸:70°C,6min ；
流速:0.8ml/min ；
進樣量:5ul。
[0035]以上所述實施例只是本發明的較佳實例，并非來限制本發明實施范圍，故凡依本發明申請專利范圍所述的構造、特征及原理所做的等效變化或修飾，均應包括本發明專利申請范圍內。
【權利要求】
1.一種食品致病菌的檢測試劑盒，其特征在于，該檢測試劑盒由以下組分制成: TaqDNA聚合酶2?5U, dNTP3Xl(T3?5Xl(T3mmol， 1X反應緩沖液2.5 ul ，致病菌引物對50 X I(T3?100 X I(T3Himol, 緩沖溶液A30-50ml, 緩沖溶液B30-50ml 硫酸銨30-50ml。
2.根據權利要求1所述的食品致病菌的檢測試劑盒，其特征在于，所述的緩沖溶液A是濃度為0.15-0.30mmol/L的TEAA水溶液，所述的緩沖溶液B是TEAA水溶液與乙腈的混合溶液，所述的TEAA水溶液與乙腈的混合溶液的體積比為(2-5): (1-3)。
3.根據權利要求1所述的食品致病菌的檢測試劑盒，其特征在于，所述的硫酸銨的濃度為 0.3-0.Bmmol /I,η
4.根據權利要求1所述的食品致病菌的檢測試劑盒，其特征在于，所述的1X反應緩沖液由 100-200ml Tris-CI,50-100ml 氯化物、10_20ml Trotpmx-100 配制而成。
5.根據權利要求2所述的食品致病菌的檢測試劑盒,其特征在于,所述的Trotpmx-1OO的質量體積濃度為0.5%-2% ;所述的Tris-CI的濃度為2 X 10_3?5 X ΚΛιπιοΙ /L ;所述的氯化物的濃度為2-5mol/L。
6.根據權利要求2所述的食品致病菌的檢測試劑盒，其特征在于，所述的氯化物選自氯化鎂、氯化鈣、氯化鉀或氯化鈉中的一種或多種。
7.根據權利要求1所述的一種食品致病菌的檢測試劑盒，其特征在于，所述的致病菌引物對選自空腸彎曲桿菌引物對、副溶血弧菌引物對、產氣莢膜桿菌引物對、金黃色葡萄球菌引物對、蠟樣芽胞桿菌引物對、宋內志賀氏菌引物對的一種或多種。
8.采用如權利要求Γ7任一所述的檢測試劑盒對待測樣品進行致病菌檢測的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)無菌操作采集待測樣品5-20g，加入100-200ml滅菌鹽水中，采用均質器進行均質，制得樣品待測液； (2)取10-20ml步驟(I)中制得的樣品待測液接種于加有增菌液的蛋白胨及瓊脂培養基內，在37°C培養4-6h ； (3)多重PCR擴增與分析，具體步驟包括: Ca)取步驟(2)中培養的菌落加至含有5-10ml滅菌生理鹽水的離心管中，以10000-12000 r/min速度離心 3-5min,棄上清，加 1X 反應緩沖液 5-lOml，以 10000-12000r/min速度離心3_5min，棄上清，反復洗滌3次；加120_150ul雙蒸水，混勻，100。。煮沸8-10min后，以10000-12000 r/min速度離心8_10min,得到致病菌DNA液； (b)取Iul 步驟(a)中得到的 DNA 液，TaqDNA 聚合酶 1U, dNTP 1 X 1 (T3mn11, 14ul 滅菌超純水加入至PCR反應管中，混勻，6000-8000 r/min,離心8_10s，加入硫酸銨5_10ml，以10000-12000 r/min速度離心8-lOmin，然后進行PCR循環制得PCR擴增產物； (c)將步驟(b)中制得的擴增產物進行變性高效液相色譜分析，色譜柱:PS-DVB&C18DNASep色譜柱；柱溫:50°C ;流動相:緩沖溶液A:緩沖溶液B ; 根據變性高相液相色譜中待征色譜峰的保留時間、峰高、峰寬，來確定待測樣品中致病菌的種類和含量。
9.根據權利要求8所述的檢測方法，其特征在于，步驟(I)中所述的滅菌鹽水的質量體積濃度為0.2-0.5%。
10.根據權利要求8所述的檢測方法，其特征在于，步驟(2)中所述的增菌液為GN增菌液，所述的培養基的PH為7-8。
【文檔編號】C12Q1/04GK104372077SQ201410484210
【公開日】2015年2月25日申請日期:2014年9月20日優先權日:2014年9月20日
【發明者】郭狄申請人:中山鼎晟生物科技有限公司

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