一種用于制備診斷5歲以下兒童肺結核的試劑盒及應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種用于制備診斷5歲以下兒童肺結核的試劑盒及應用。通過提取外周血單核細胞中的RNA，分別利用SEQIDNO：1、SEQIDNO：2所示的引物對，使用特異性聚合酶鏈式反應進行實時定量熒光PCR擴增白介素-9（Interleukin-9，IL-9），測定IL-9的反應Ct數值，通過實時定量PCR反應來檢測外周血單核細胞中的IL-9改變，以此利用設定好的試劑盒來判定患兒是否患有肺結核，具有很高的特異性和準確率；而相對于現有技術采用的干擾素-γ釋放試驗在針對5歲以下兒童肺結核的診斷中未顯示出任何診斷意義而言，本發明對該人群患兒提供了一種準確有效的免疫診斷手段。
【專利說明】—種用于制備診斷5歲以下兒童肺結核的試劑盒及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及醫藥【技術領域】，具體的說，本發明具體涉及用于肺結核診斷的試劑盒的【技術領域】，更進一步講，本發明具體涉及一種用于制備診斷5歲以下兒童肺結核的試劑盒的【技術領域】。
【背景技術】
[0002]在發展中國家，結核的年感染率為2-5%，病死率為8-20%。在一歲以下結核感染的嬰兒，終生轉化為結核病的比例為50%，對1-2歲的幼兒，比例為20-30%。一般來說，70%的嬰幼兒結核為胸腔內結核，23%為結核性腦膜炎，4%為擴散性結核。目前對5歲以下兒童肺結核的診斷主要依靠臨床癥狀，體征，影像學檢查，痰培養，以及結核菌素試驗。由于嬰幼兒免疫功能尚未發育成熟，結核病患兒經常發展為重型結核，像結核性腦膜炎等，而且發病迅速。因此，一種早期，快速，準確的結核病診斷方法將有利于確診疾病，并快速，正確實施治療。目前對5歲以下結核病患兒的診斷主要有以下幾種方法:
(I)臨床指征:大約60%的結核病患兒是以常見的發燒，咳嗽來醫院就診。并輔助以X光檢查。但這些檢查均為非特異性的檢查，常常難以和其他肺部感染性病灶，比如肺炎相區分。
[0003](2)痰涂片/培養:痰涂片/培養是診斷兒童肺結核的唯一金標準。但對5歲以下的兒童，痰液收集極為困難，而且培養結果陽性率極低。另外，痰涂片需時過長，常常延誤治療的實施。
[0004](3)結核菌素試驗:是結核診斷中使用時間最長的一種方法。雖然簡單，易行，價格低廉，但缺點是病人需二次就診，結果判讀可靠性差，導致特異性低，已逐漸被干擾素釋放試驗方法取代。
[0005](4)干擾素-Y釋放試驗(QuantiFERON-TB或T-SP0T.TB):該試驗基于的原理是，當結核菌感染個體的特異性T細胞受到結核桿菌抗原刺激時，會釋放大量的干擾素，測定血中干擾素的濃度即可判斷該個體是否受到結核菌感染。雖然該試驗已在歐美被廣泛的用于成人結核菌感染和結核病診斷，但該試驗只能用于診斷個體是否受到結核菌感染，無法區分是結核菌感染的正常個體還是結核菌感染后的患者。在結核高感染區，如中國、印度人群中70-80%的個體已受到結核菌感染，干擾素-Y釋放試驗在這些區域的應用便受到了限制，因其無法區分開結核病人和結核菌感染的健康人H et al.2006)。更何況，干擾素-Y釋放試驗在兒童結核病診斷中應用的相關報道尚少，而且，研究表明該方法對兒童結核病的診斷效果與結核菌素試驗沒有區別AM et al.2011)。因此有必要提供一種新的針對5歲以下兒童肺結核的診斷方法來克服現有技術中存在的缺陷。
[0006]目前，已有數種實驗室方法用于結核病的診斷，包括免疫診斷方法，基于培養基、噬菌體的核酸擴增或熒光顯色方法檢測結核菌，測定尿中脂阿拉伯甘露聚糖濃度等等。但以干擾素-Y釋放試驗為代表的免疫學診斷方法是唯一經FDA批準并在多個國家廣泛使用的診斷方法，表明尋找結核病的免疫診斷方法是一條可行的方向。但是，干擾素-Y釋放試驗無法區分開成人結核病人和結核菌感染的健康人，其應用在高結核菌負荷區受到了限制，該方法在兒童肺結核診斷方面的應用研究更是匱乏。
【發明內容】
[0007]針對目前國內外未見針對5歲以下兒童肺結核診斷的相關試劑盒，現有技術又無法區分開成人結核病人和結核菌感染的健康人，其應用在高結核菌負荷區受到了限制的技術現狀。本發明旨在提供一種用于制備診斷5歲以下兒童肺結核的試劑盒及應用技術方案，用于制備準確診斷5歲以下兒童肺結核，特別是對于結核病高發地區兒童，其開發和應用具有廣泛的現實意義和價值。
[0008]本發明采用的技術方案:
本發明通過提供一種試劑盒，試劑盒包括提供一種結核分枝桿菌分泌的特異性蛋白質ESAT-6 {Early secretory antigenic target 6),將特異性蛋白質 ESAT-6 與患兒外周血單核細胞共同培養，以激活外周血單核細胞中特異性T細胞，并表達相應的細胞因子。由于只有致病的野生型結核分枝桿菌分泌ESAT-6蛋白，而用于疫苗免疫的BCG菌株及其他非致病性的結核桿菌并不分泌ESAT-6蛋白，因此，正常BCG免疫的個體不會對ESAT-6的刺激產生免疫反應，也不會因被刺激而表達相應的細胞因子。試劑盒包括制備ESAT-6蛋白，提取外周血單核細胞中的RNA，分別利用SEQ IDNO:USEQ ID NO:2所示的引物對，使用特異性聚合酶鏈式反應進行實時定量熒光PCR擴增白介素-9 (Interleukin 9，IL-9)，測定IL-9的反應Ct數值，通過實時定量PCR反應來檢測外周血單核細胞中IL-9的改變，以此利用設定好的試劑盒來判定患兒是否患有肺結核，具有很高的特異性和準確性；而相對于現有技術采用的干擾素-Y釋放試驗在針對5歲以下兒童肺結核的診斷中未顯示出任何診斷意義而言，本發明對該人群患兒提供了一種準確有效的免疫診斷手段。
[0009]本發明具體提供了一種用于制備診斷5歲以下兒童肺結核的試劑盒，所述的試劑盒包括:
(I)制備ESAT-6蛋白。
[0010](2)提取外周血單核細胞中的RNA。
[0011](3)分別利用SEQ ID NO:USEQ ID NO:2所示的引物對。
[0012]SEQ ID NO:1:TGCAGTGCTAATGTGACCAGTTG ；
SEQ ID NO:2:TGGTCTGGTGCAGTTGTCAGA。
[0013](4)使用特異性聚合酶鏈式反應進行實時定量熒光PCR擴增IL-9。
[0014](5)測定IL-9的反應Ct數值。
[0015]同時，本發明提供一種用于IL-9擴增，包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示的引物對， 所述的引物:
SEQ ID NO:1:TGCAGTGCTAATGTGACCAGTTG ；
SEQ ID NO:2:TGGTCTGGTGCAGTTGTCAGA。
[0016]可以擴增GeneBank 登錄號為 ΝΜ_000590.I (序列 591bp，位點 150-212)人 IL-9的mRNA特異性核苷酸序列。
[0017]進一步，本發明提供一種用于制備診斷5歲以下兒童肺結核試劑盒的應用，通過實時定量PCR反應來檢測外周血單核細胞中的IL-9改變來判定患兒是否患有肺結核的應用，具有很高的特異性和準確性。
[0018]現有技術知悉，IL-9 一直被認為是一種Th2細胞因子，主要由Th2細胞分泌，其功能主要是拮抗Thl細胞因子，如干擾素-Y。最近的研究表明，IL-9也可由多種T細胞亞類分泌，比如Th9細胞，Thl7細胞和T調節細胞，并兼有免疫調節功能。因此，IL-9是一種多功能細胞因子。
[0019]基于現有技術中針對兒童肺結核尚無有效的免疫診斷方法，兒童肺結核與成人肺結核截然不同。由于嬰幼兒的免疫功能尚未完善，在受到結核菌感染時，其免疫反應首先趨于Th2反應，分泌Th2細胞因子，比如IL-4，IL-5，IL-9，IL-13等。同時也誘導了 T調節細胞的增加。本領域熟知，由于IL-9既具有Th2細胞因子的功能又兼有免疫調節因子的功能，本發明進一步探索了 IL-9在兒童肺結核診斷方面的應用。發現通過測定5歲以下兒童血液中IL-9的變化，可以診斷兒童結核，特別是兒童肺結核。
[0020]通過實施本發明具體的技術方案，實現本
【發明內容】
，可以達到以下有益效果。
[0021](I)本發明提供一種用于肺結核診斷的試劑盒，所述試劑盒包含一種結核分枝桿菌分泌的特異性蛋白質ESAT-6，用于激活結核病患兒外周血單核細胞中的特異性T細胞，使其表達相應的細胞因子。應用所包含的SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2的一對引物對，并通過特異性聚合酶鏈式反應，來檢測血液中IL-9，用于準確判定5歲以下兒童是否患有肺結核，具有較高的敏感性、特異性和準確性，敏感性達66.67%，特異性達96%和準確率達88.24%。
[0022](2)本發明提供用于肺結核診斷的試劑盒的一對引物對，一對引物對具有SEQIDN0:U SEQ ID NO:2所示的序列，并通過特異性聚合酶鏈式反應，來檢測血液中IL-9，以判定5歲以下兒童是否患有肺結核。通過應用提供的試劑盒，針對5歲以下兒童肺結核的免疫診斷應用中，利用分子生物學原理檢測血液中IL-9的表達量能夠有效診斷5歲以下兒童肺結核并具有較高的敏感性、特異性和準確性，而相對于現有技術常見采用的干擾素-Y釋放試驗在針對5歲以下兒童肺結核的診斷中未顯示出任何診斷意義而言，本發明對該人群患兒提供了一種準確有效的免疫診斷手段。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]圖1顯示為干擾素-Y的表達量圖。圖中顯示在結核病人，肺炎病人和正常人之間沒有差別，表明干擾素一Y無法區分結核病人和正常人。
[0024]圖2顯示為干擾素-Y的表達量圖。圖中顯示在肺結核病人，肺外結核病人和正常人之間沒有差別，表明干擾素- Y也無法區分肺結核病人和肺外結核病人。
[0025]圖3顯示為IL-9的表達量圖。圖中顯示結核病人明顯高于肺炎病人和正常人，表明IL-9可以區分結核病人和正常人。
[0026]圖4顯示為IL-9的表達量圖。圖中顯示肺結核病人明顯高于正常人，表明IL-9可以區分肺結核病人和正常人。通過肺外結核病人中IL-9的表達量和肺結核病人及正常人相比，無顯著性差異，表明IL-9無法區分肺外結核病人和正常人。
[0027]圖5顯示為IL-9的ROC曲線圖。圖中顯示可以有效區分結核病人和正常人(敏感性=82.76%,特異性=64%,準確率=74.07%, AUC=0.7676,95% 可信區間(Cl)，0.64 - 0.89)。
[0028]圖6顯示為IL-9的ROC曲線圖。圖中顯示可以有效區分肺結核病人和肺外結核病人(敏感性=66.67%，特異性=96%,準確率=88.24%，AUC=0.8533，95%可信區間(Cl)，0.67 -1)。
【具體實施方式】
[0029]下面，舉實施例說明本發明，但是，本發明并不限于下述的實施例。另外，在下述的說明中，如無特別說明，％皆指質量百分比。
[0030]采用的主要儀器設備:II級生物安全柜、37°C 5%C02培養箱、高速/低速離心機、熒光定量PCR儀、Thermo Fisher公司NanoDrop Lite、水浴鍋、_80°C低溫冰箱等。
[0031]主要原輔材料、試劑:ESAT_6蛋白、淋巴細胞分離液、SYBR Green PCR Mastermix、逆轉錄酶、RNase抑制劑、細胞裂解液(RLT緩沖液)、RPM1-1640 (含L-谷氨酰胺)、胎牛血清、青霉素/鏈霉素、非必需氨基酸，丙酮酸鈉等。
[0032]本發明中選用的所有試劑、儀器及原輔材料都為本領域熟知選用的，但不限制本發明的實施，其他本領域熟知的一些試劑和設備都可適用于本發明以下實施方式的實施。
[0033]實施例一:用于制備診斷5歲以下兒童肺結核的試劑盒用于制備診斷5歲以下兒童肺結核的試劑盒，該試劑盒包括:
(I)制備ESAT-6蛋白。
[0034](2)提取外周血單核細胞(PBMC)中的RNA。
[0035](3)分別利用SEQ ID NO:USEQ ID NO:2所示的引物對:
SEQ ID NO:1:TGCAGTGCTAATGTGACCAGTTG ；
SEQ ID NO:2:TGGTCTGGTGCAGTTGTCAGA。
[0036](4)使用特異性聚合酶鏈式反應進行實時定量熒光PCR擴增IL-9。
[0037](5)測定IL-9的反應Ct數值。
[0038]通過上述實施例提供的一對引物對具有SEQ IDN0:U SEQ ID NO:2所示的序列，并通過特異性聚合酶鏈式反應來檢測血液中IL-9，以判定5歲以下兒童是否患有肺結核。通過應用提供的試劑盒，針對5歲以下兒童肺結核的免疫診斷應用中，利用分子生物學原理檢測血液中IL-9的表達量能夠有效診斷5歲以下兒童肺結核并具有較高的敏感性、特異性和準確性，而相對于現有技術采用的干擾素-Y釋放試驗在針對5歲以下兒童肺結核的診斷中未顯示出任何診斷意義而言，本發明對該人群患兒提供了一種準確有效的免疫診斷手段。
[0039]實施例二:用于制備診斷5歲以下兒童肺結核試劑盒的構建
1.ESAT-6的表達:凍干的重組ESAT-6蛋白由美國ProtevoB1公司提供。用無菌的PBS將ESAT-6稀釋至lmg/mL濃度；小體積分裝，保存使用。
[0040]2.外周血單核細胞(PBMC)的分離
(I)用EDTA抗凝采血管采集兒童靜脈血注入盛有等體積的Hank’ s液的無菌試管中，混勻。
[0041](2)將血液2倍體積的淋巴細胞分離液注入無菌離心管中，再將稀釋好的抗凝血小心沿管壁加至分離液上，應注意保持兩者界面清晰。
[0042](3)室溫2000 r / min離心20min,管內可分為四層。
[0043](4)采用2mL一次性無菌吸管輕輕吸出乳白色的PBMC，加入另一支已含有20mLHank’ s液的離心管中，混勻。
[0044](5)室溫下，1500r / min 離心 lOmin。
[0045](6)棄上清,重復洗漆一次。加入5mLHank’s液定容計數，1500r / min離心10min。
[0046](7)計數方法:將細胞懸浮液與0.4%臺盼藍按1:1混勻，染色2_3min。于顯微鏡下計數板計數，放大倍數為40X10。
[0047]3.PBMC的培養和刺激
在上述PBMC沉淀中加入2 mL預配好的培養液，吹打混勻，分別吸取ImL (PBMC為I X 16/ mL)加入兩個細胞培養孔中，其中，一孔加10 μ LESAT-6 (lmg /mL)，另一孔不加，置于細胞培養箱中(37°C，5%C02)培養24h。培養液的配制方法:90%RPM1-1640 (含L-谷氨酰胺);10%胎牛血清；青霉素(100U/mL)/鏈霉素(100 μ g/mL),非必需氨基酸溶液(100 X )，丙酮酸鈉(10mM)。
[0048]4.RNA的提取:采用常見的試劑盒Qiagen RNeasy Mini KU，貨號:74104，按照試劑盒說明書操作步驟即可。用此試劑盒可以從I X 16PBMC中提取獲得約3 μ gRNA,用ThermoFisher 公司 NanoDrop Lite 測得 RNA 純度為 1.89-2.03 之間。
[0049]5.cDNA的合成:采用常見的試劑盒Roche Transcriptor cDNA Synth.Kit,貨號:04896866001。按試劑盒要求取< I μ g RNA，取0.2-1 μ g RNA進行逆轉錄效果較好，通過反轉錄得到同樣濃度的cDNA。
[0050]6.1L-9 的擴增:采用常見的 Qiagen 公司 QuantiFast SYBR Green PCR Kit 貨號:204056。我們采用這個試劑盒推薦的反應條件，擴增IL-9特異序列，得到的Ct值在20-30之間，是一個理想的反應區域，在技術上是可信的。
[0051]實施例三:
本發明的原理是基于應用肺結核分枝桿菌的特異性蛋白，ESAT-6刺激結核病患兒外周血中的特異性T細胞，使其表達和產生細胞因子IL-9。應用實時定量熒光PCR方法測定血液中IL-9的表達量來診斷兒童是否患有結核病。實時定量熒光PCR方法已愈來愈多的用于疾病的分子診斷，具有極高的靈敏性和特異性。干擾素-Y釋放試驗是經FDA批準的目前唯一用于成人結核菌感染及結核病診斷的免疫診斷方法。因此首先判斷是否通過檢測干擾素-Y表達量能夠診斷5歲以下兒童結核病人。
[0052]本發明將正常兒童、肺炎患兒及結核病兒童的PBMC進行分離培養和ESAT-6刺激后，應用實時熒光定量PCR法檢測外周血中干擾素-Y的表達量，將不同組之間干擾素-Y表達量進行比較，得出結論見附圖1、2 ;參見附圖1所示，相對于正常兒童及肺炎患兒，結核病兒童的干擾素-Y表達量并未顯示出任何差異。進一步將結核病兒童分為肺結核和肺外結核，和正常兒童相比，也未發現干擾素-Y表達量有任何差異，參見附圖2，表明干擾素-Y表達量在5歲以下的兒童中，無法區分正常兒童和結核病兒童，也無法區分正常兒童和肺結核兒童。
[0053]其次，本發明將正常兒童、肺炎患兒及結核病兒童(包括肺結核和肺外結核兒童)的PBMC進行分離培養和ESAT-6刺激后，應用實時熒光定量PCR法檢測外周血中IL-9的表達量，將不同組之間IL-9表達量進行比較，得出結論見附圖3、4:當測定結核病患兒外周血中特異性T細胞的IL-9表達量時，結核病患兒明顯高于正常兒童(p〈0.01)和肺炎兒童(p〈0.05)，提示高表達量的IL-9可以區分肺結核兒童和正常及肺炎兒童，參見附圖3。進一步觀察肺結核和肺外結核兒童，肺結核兒童仍然較正常兒童顯示出較高的IL-9表達量，而肺外結核兒童的IL-9表達量和正常兒童沒有區別，表明高IL-9表達量可以區分肺結核兒童和正常兒童，但無法區分肺外結核兒童和正常兒童，參見附圖4。
[0054]本發明將結核病兒童(包括肺結核和肺外結核兒童)和正常兒童的PBMC進行分離培養和ESAT-6刺激后，應用實時熒光定量PCR檢測外周血IL-9的表達量，評估其診斷的敏感性、特異性及準確性，得出結論見附圖5、6 =ROC曲線分析表明高IL-9表達量可以較好的區分結核病兒童和正常兒童(敏感性=82.76%，特異性=64%，準確率=74.07%, AUC=0.7676，95%可信區間(Cl)，0.64-0.89)，參見附圖5，但對肺結核兒童的區分率更高(敏感性=66.67%，特異性=96%，準確率=88.24%, AUC=0.8533,95% 可信區間(Cl), 0.67 - 1)，參見附圖6。
[0055]通過上述實驗驗證本發明提供的試劑盒，用于針對5歲以下兒童肺結核的免疫診斷應用，利用分子生物學原理檢測血液中IL-9的表達量能夠有效診斷5歲以下兒童肺結核并具有較高的敏感性、特異性和準確性，敏感性達66.67%，特異性達96%和準確率達88.24%，參見附圖5、6，而現有技術采用的干擾素- Y釋放試驗在針對5歲以下兒童肺結核的診斷中未顯示出任何診斷意義，參見附圖1、2，相對于現有技術未能有效解決5歲以下兒童肺結核免疫診斷的現有技術問題，本發明對該人群患兒提供了一種準確有效的免疫診斷手段。
[0056]實施例四:試劑盒Qiagen RNeasy Mini Kit,貨號:74104說明步驟采用Qiagen RNeasy Mini Kit,貨號:74104,嚴格按照試劑盒說明書操作步驟操作。
[0057](I)收集培養24小時的細胞(懸浮的細胞≤5x106個細胞/1^)，1500印111離心10min,小心吸棄上清液，加入350 μ L RLT緩沖液，震蕩或吹吸混勻。
[0058](2)向細胞裂解物中加入等體積的70%酒精，抽吸混勻。
[0059](3)將上述混合液(約700 μ L)轉移至帶有2mL收集管的離心柱中，輕輕蓋上蓋子，8000g離心Imin,丟棄穿通液。
[0060](4)向離心柱中加入700 μ LRffl緩沖液，輕輕蓋上蓋子，8000g離心lmin，丟棄穿通液。
[0061](5)向離心柱中加入500 μ LRPE緩沖液，輕輕蓋上蓋子8000g或1000rpm離心lmin,丟棄穿通液。
[0062](6)向離心柱中加入500 μ L RPE緩沖液，輕輕蓋上蓋子8000g或1000rpm離心2min,丟棄穿通液。
[0063](7)將離心柱移至一個新的2mL收集管中，以最高轉速離心lmin,以干燥膜。
[0064](8)將離心柱移至一個無RNA酶的1.5mLEP管中，將30 μ I無RNA酶水直接加入離心柱的膜上，輕輕蓋上蓋子，8000g離心lmin，洗脫RNA。
[0065]實施例五:試劑盒Roche Transcriptor cDNA Synth.Kit 說明步驟 Roche Transcriptor cDNA Synth.Kit,貨號:04896866001。
[0066]根據RNA濃度，取0.2-1 μ g RNA進行逆轉錄效果較好，RNA最多加11 μ L，加入2μ L隨機引物(600μΜ)，65?水浴lOmin，置冰上2min，在上述反應液中加入2μ L dNTP(1mM)混合液、0.5μ L 逆轉錄酶(20U/μ L)、0.5 μ L RNase 抑制劑(40U /yL)和 cDNA 合成 buffer (5X ) 4μ L,25°C 10min,50°C 60min,85°C 5min，完成 cDNA 制備。
[0067]實施例六:試劑盒Qiagen公司QuantiFast SYBR Green PCR Kit說明步驟Qiagen 公司 QuantiFast SYBR Green PCR Kit，貨號:204056
SYBR 熒光PCR 反應體系為 20 μ L，IL-9 引物混合液 IyL (20mM), 2 X SYBR Green PCRMaster mix 10 μ L, cDNAl μ L, DEPC 水 8 μ L，擴增條件:95°C 5min ；95°C 10s,60°C 30s, 40個循環，每個循環最后一步檢測熒光，制備融解曲線。
【權利要求】
1.一種用于制備診斷5歲以下兒童肺結核的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括: Cl)制備ESAT-6蛋白； (2)提取外周血單核細胞中的RNA； (3)分別利用SEQIDNO:USEQ ID NO:2所示的引物對: 正義引物:TGCAGTGCTAATGTGACCAGTTG ； 反義引物:TGGTCTGGTGCAGTTGTCAGA ； (4)使用特異性聚合酶鏈式反應進行實時定量熒光PCR擴增白介素-9(Interleukin-9, IL-9)； (5)測定IL-9的反應Ct數值。
2.一種用于IL-9擴增的引物，其特征在于，所述的引物包含SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2所示的引物對: 正義引物:TGCAGTGCTAATGTGACCAGTTG ； 反義引物:TGGTCTGGTGCAGTTGTCAGA。
3.一種用于制備診斷5歲以下兒童肺結核試劑盒的應用，其特征在于，通過實時定量PCR反應來檢測外周血單核細胞中的IL-9改變，以此來判定患兒是否患有肺結核的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104178580SQ201410470575
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年9月16日 優先權日:2014年9月16日
【發明者】吳波, 孫荷, 李奇鳳, 余亮 申請人:吳波, 孫荷