利用rt-pcr法進行家蠶相對強健品種選擇的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用RT-PCR法進行家蠶相對強健品種選擇的方法：選用飼養至5齡第2天的家蠶，對每種家蠶均依次進行如下步驟1)～5)：1)將家蠶進行高溫沖擊處理；2)將高溫沖擊處理家蠶以及飼養至5齡第2天的家蠶分別處死后進行解剖提取脂肪體；3)對脂肪體進行RNA抽提；4)以提取的RNA為模板進行反轉錄；5)利用所得的cDNA進行熱激蛋白基因的熒光定量PCR檢測，得熱激蛋白基因表達量；5齡第2天家蠶的基因熒光表達量為X1，高溫沖擊后家蠶的基因熒光表達量為X2，X1+2(X2－X1)＝Y；6)將不同品種的家蠶所對應的Y進行比對，Y值大的所對應的家蠶為家蠶相對性強健品種。
【專利說明】利用RT-PCR法進行家蠶相對強健品種選擇的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種家蠶品種的輔助選育方法，具體地說，是涉及一種利用RT-PCR法 進行家蠶強健性品種選擇的方法。
【背景技術】
[0002] 中國是世界養蠶業的發源地，具有五千年的悠久歷史。栽桑養蠶曾經是廣大農村 經濟發展的支柱和農民脫貧致富的重要手段；蠶絲業也是傳統的出口創匯產業，為國民經 濟建設作出了重要貢獻。家蠶新品種選育是蠶絲業科技進步的基礎和核心之一，在新中國 成立后，我國的家蠶品種選育取得了巨大的成就，在全國范圍內先后進行了多次蠶品種的 更新換代，極大地促進了蠶絲業的發展。但隨著農村經濟的快速發展，第二、三產業的迅猛 崛起，大量農村勞動力涌入工商企業，從事養蠶業的大多為老弱及婦女，傳統的精細飼養方 法已不適合當今時代發展的需要，需要有一種能適合省力化、粗放經營的蠶品種；另一方 面，家蠶作為實驗材料及生物反應器的優異特性正逐步得到社會的肯定，利用家蠶生產具 有高科技含量的生物制品已經取得重大進展，迫切需要有一種能周年進行飼養的強健性蠶 品種。傳統的強健性蠶品種的選育大多采用誘發鑒定方法，即人工創造所需的不良環境 (高溫多濕、添食各種病毒、病菌及微量農藥或污染物），促使參加鑒定的品種暴露出遺傳 本質差異，達到篩選鑒定的目的，但這種方法需要將家蠶飼養至上簇、結繭及化蛹，通過調 查這些性狀了解該品種的強健性，時間周期長，而且浪費大量的人力物力。
【發明內容】
[0003] 本發明要解決的技術問題是提供一種利用RT-PCR法進行家蠶相對強健性品種選 擇的方法，采用本發明可選擇得到相對強健的品種。
[0004] 為了解決上述技術問題，本發明提供一種利用RT-PCR法進行家蠶相對強健品種 選擇的方法：選用飼養至5齡第2天的家蠶，以至少2種的家蠶作為待測對象，對每種家蠶 均依次進行如下步驟1)?5) :
[0005] 1)、將家蠶進行高溫沖擊處理，所述高溫沖擊處理為：將飼養至5齡第2天的家蠶 于34. 5?35. 5°C放置3. 5?4. 5小時；
[0006] 2)、將高溫沖擊處理家蠶以及飼養至5齡第2天的家蠶分別處死后進行解剖提取 脂肪體；
[0007] 3)、對步驟2)所得的脂肪體進行RNA抽提；
[0008] 4)、以提取的RNA為模板進行反轉錄，得CDNA ;
[0009] 5)、利用所得的cDNA進行熱激蛋白基因的熒光定量PCR檢測，得熱激蛋白基因表 達量；
[0010] 5齡第2天家蠶的基因熒光表達量為XI，高溫沖擊后家蠶的基因熒光表達量為X2， X1+2(X2 - XI) =Y；
[0011] 6)、將不同品種的家蠶所對應的Y進行比對，Y值大的所對應的家蠶為家蠶相對性 強健品種。
[0012] 備注說明：本發明是將所得的每種家蠶所對應的熱激蛋白基因（Shsp23. 7)表達 量進行比對，選擇大的熱激蛋白基因表達量所對應的家蠶為家蠶相對性強健品種。
[0013] 熒光定量中目的基因（即，熱激蛋白基因，亦稱標記基因）表達量大的個體為抗 高溫的個體，其對高溫等不良環境的抵抗性強，因此作為強健性品種留種。高溫指34. 5? 35. 5°C (特別指 35°C )。
[0014] 備注說明：待測對象最終所得的Y值之間的差距越大，越能精確的說明Y值大的所 對應的為家蠶相對強健品種。
[0015] 一般而言，Y大于10,可被認定為家蠶相對強健品種。
[0016] 作為本發明的利用RT-PCR法進行家蠶相對性強健品種選擇的方法的：
[0017] 所述步驟5)的PCR檢測體系為
[0018]
【權利要求】
1. 利用RT-PCR法進行家蠶相對強健品種選擇的方法，其特征是：選用飼養至5齡第2 天的家蠶，以至少2種的家蠶作為待測對象，對每種家蠶均依次進行如下步驟1)?5): 1) 、將家蠶進行高溫沖擊處理；所述高溫沖擊處理為：將飼養至5齡第2天的家蠶于 34. 5?35. 5°C放置3. 5?4. 5小時； 2) 、將高溫沖擊處理家蠶以及飼養至5齡第2天的家蠶分別處死后進行解剖提取脂肪 體； 3) 、對步驟2)所得的脂肪體進行RNA抽提； 4) 、以提取的RNA為模板進行反轉錄，得cDNA ; 5) 、利用所得的cDNA進行熱激蛋白基因的熒光定量PCR檢測，得熱激蛋白基因表達 量； 5齡第2天家蠶的基因熒光表達量為XI，高溫沖擊后家蠶的基因熒光表達量為X2， X1+2(X2 - XI) = Y ； 6) 、將不同品種的家蠶所對應的Y進行比對，Y值大的所對應的家蠶為家蠶相對性強健 品種。
2. 根據權利要求1所述的利用RT-PCR法進行家蠶相對性強健品種選擇的方法，其特征 是： 所述步驟5)的PCR檢測體系為
PCR 檢測條件為：95°C，3min ;95°C變性 15sec，60°C退火 40sec，72°C延伸 40sec，共循 環 40 個循環；72°C lOmin。
3. 根據權利要求2所述的利用RT-PCR法進行家蠶相對性強健品種選擇的方法，其特征 是： 所述PCR檢測體系中的引物為： 5' -ATGAAGAATTTCATTCC-3' 5' -TTATTGCATTTCTGAC-3'。
4. 根據權利要求2或3所述的利用RT-PCR法進行家蠶相對性強健品種選擇的方法，其 特征是：所述高溫沖擊處理溫度為35°C，時間為4小時。
【文檔編號】C12Q1/68GK104293918SQ201410469260
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月15日 優先權日:2014年9月15日
【發明者】屠振力 申請人:浙江大學