一種選擇性擴增孕婦血漿中游離胎兒dna的方法

一種選擇性擴增孕婦血漿中游離胎兒dna的方法
【專利摘要】本發明涉及一種選擇性擴增游離胎兒DNA的方法，包括如下步驟：將孕婦血漿中游離DNA末端補平后經加A反應，得到有粘性末端的游離DNA后與利用寡核苷酸制備的接頭DNA進行連接反應，以連接產物為模板，寡核苷酸為引物進行PCR擴增反應：72℃接頭延伸，80-87℃預變性3min，80-87℃變性20s，72℃退火20s，72℃延伸，80-87℃變性20s，57℃退火20s，72℃延伸，4℃保溫。本方法選擇性擴增游離胎兒DNA而不擴增母體游離DNA，可最大程度消除母體DNA背景干擾，提高游離胎兒DNA濃度，從而提高診斷的靈敏度與特異性。
【專利說明】一種選擇性擴增孕婦血漿中游離胎兒DNA的方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及DNA擴增【技術領域】，具體指一種選擇性擴增孕婦血漿中游離胎兒DNA 的方法。

【背景技術】
[0002] 孕婦血楽中存在著少量的游離胎兒DNA (Cell-free fetal DNA, cffDNA)，是進行 無創性產前診斷的理想檢材，利用游離胎兒DNA可以早期、特異地進行產前篩查和診斷，且 不易受到以往妊娠的干擾，為無創性產前診斷方法提供了新的途徑。但孕婦血漿中游離胎 兒DNA含量極少，并且游離胎兒DNA與母體DNA混雜在一起，現有的對于孕婦血漿中游離胎 兒DNA的研究，都是在較高的母體DNA背景干擾下進行的，極容易引起誤差。
[0003] 血漿中大多數游離胎兒DNA分子片段長度小于300bp，而大多數母體DNA分子片段 長度大于300bp，根據這一特點，可以依據DNA分子片段長度的差異，特異性富集片段長度 小于300bp的DNA分子，主要有以下兩種方法：一種是通過瓊脂糖凝膠電泳法將小片段的游 離胎兒DNA與大片段的母體血漿DNA分離開，從而富集游離胎兒DNA分子；另一種是在磁珠 法或硅膠模法提取DNA的基礎上，通過調整吸附反應體系，選擇性吸附小片段的DNA分子， 從而達到富集游離胎兒DNA的目的。但血漿中的DNA含量非常少，富集游離胎兒DNA分子 方法精確度低，并且極容易帶入外源性核酸污染物其濃度在ng/ml水平，并且其中游離胎 兒DNA僅為血漿總游離DNA的19%左右，即使提取效率能夠達到100%，仍然需要幾毫升甚 至幾十毫升的血液樣品才能夠滿足常規檢測的要求。如何消除母體DNA背景干擾，提高游 離胎兒DNA濃度，從而提高診斷的靈敏度與特異性，已經成為亟待解決的問題。


【發明內容】

[0004] 針對現有技術的問題，本發明的目的是提供一種選擇性擴增孕婦血漿中游離胎兒 DNA的方法，在最大程度上消除母體DNA背景千擾情況下選擇性擴增孕婦血漿中游離胎兒 DNA，并能夠在保證DNA分子完整性的同時，包括如下步驟：
[0005] (l)PCR擴增反應模板的制備：
[0006] A.合成甲乙兩條寡核苷酸，寡核苷酸甲3'端為T堿基，從寡核苷酸甲3'端的第二 個堿基與寡核苷酸乙5'端開始互補；將寡核苷酸乙5'端用磷酸根修飾；經退火反應得到接 頭 DNA。
[0007] B.將游離DNA末端補平后經加 A反應，得到有A粘性末端的游離DNA。
[0008] C.將步驟A得到的接頭DNA和步驟B得到有粘性末端的游離DNA進行連接反應， 得到連接產物。
[0009] ⑵通過特定的PCR反應程序，選擇擴增孕婦血漿中游離胎兒DNA，而大多數母體 DNA分子片段長度大于300bp不能被擴增。
[0010] 利用步驟C所述的連接產物為模板，步驟A中的寡核苷酸甲為引物進行PCR擴增 過程如下：
[0011] (3)72。(：下接頭延伸5111111,
[0012] (b)80 ?87°C 下預變性 3min，
[0013] (c)8〇 ? 87°C下變性 2〇s，
[0014] (d) 72Γ下退火（每個循環較前一循環降低0. 5? ) 20s，
[0015] (e)72O 下延伸 2min，
[0016] (f)重復（c)-(e)30 個循環，
[0017] (g)80 ?87°C下變性 20s，
[0018] (h) 57Γ 下退火 20s，
[0019] (i)72°C 下延伸 2min，
[0020] (j)重復（g)-(i)l〇_2〇 個循環，
[0021 ] (k)72°C 下延伸 5min，
[0022] (1)4°C 下保溫。
[0023] 作為優選，PCR擴增反應過程如下：
[0024] (a) 72。〇下接頭延伸5min，
[0025] (b)82 ?84°C下預變性 3min，
[0026] (c)82 ?84°C下變性 2〇s,
[0027] (d) 72°C下退火（每個循環較前一循環降低0· 5°C ) 20s,
[0028] (e)72°C下延伸 2min,
[0029] ⑴重復（c)-(e) 3〇個循環，
[0030] (g)82 ?84?下變性 20s，
[0031] (h) 57 ? 下退火 20s，
[0032] (i)72O下延伸 2min，
[0033] (j)重復（g)-(i)l〇_20 個循環，
[0034] (k)72°C 下延伸 5min，
[0035] (1)4°C 下保溫。
[0036] 所述的寡核苷酸甲長度為10-50個堿基，所述的寡核苷酸乙長度為5-47個堿基， 寡核苷酸甲堿基數比寡核苷酸乙多3-30個。
[0037] 所述的磷酸根修飾是通過T4多聚核苷酸激酶實現的。
[0038] 所述的末端補平是通過T4DNA聚合酶實現的。
[0039] 所述的加 A是通過Taq DNA聚合酶實現的。
[0040] 所述的接頭DNA和有A粘性末端的游離DNA的連接是通過T4DNA連接酶實現的。
[0041] 本發明方法相對于現有技術具有以下優越性：1·在最大程度上消除母體DNA背景 千擾和避免帶入外源性核酸污染物情況下提高胎兒DNA濃度，從而提高診斷的靈敏度與特 異性。2.能夠在保證DNA分子完整性的同時，選擇性擴增孕婦血漿中游離胎兒DNA。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0042] 圖1是實施例2-8的電泳圖像。

【具體實施方式】
[0043] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0044] 下述實施例中所用的材料試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0045] 實施例1 :PCR擴增反應模板的制備
[0046] (1)設計并合成甲乙一 條募核昔酸：募核昔酸甲：5' -GCX} OTG A(X QX Μ? TGA ATT CT-3'，寡核苷酸乙：5' -GAA TTC AGA TC-3'。
[0047] (2)寡核苷酸乙5'端磷酸根修飾，反應如下（總體系5〇 y υ :
[0048] 核苷酸乙<100μ?νβ _ 1 〇χ reaction buffer A for T4 PNK Λ1Ρ: (IDmM): Q iul r ;M.多聚核酸激酶（1〇υ/μ?> ：1ι5μΙ ddE20 孫至
[0049] 輕柔吹打混勻，37°C水浴60min，75°C水浴lOmin滅活。
[0050] ⑶退火反應（總體系100 μ 1):
[0051] 經紮酸扎修飾;·5寡氣?=卩醜￡ 5αμ1 細辦 AnficmlirtgBiifiiribflMAOlLpis (5x) .眞 樣隨2〇 '1卜親綱_
[0052] 反應條件如下：
[0053] 95 °C 2min
[0054] %°C (每％sec 下降丨，降至 25Γ ) _] 4Γ下保溫
[0056]所得產物即為接頭DNA。 末端補平：糊1QQng經麵7氯仿，異鋪法提取的游離亂 進仃如下反應（總體系1〇 μ D :
[0058] lOtog
[0059] _WB_r m μα ?μ? dNTP Mixture C2.SmM^J ^ ddftO# 至 751下保濕5nin盾a: if^恒魁槽 T4 聚合_ IliI M加詳雛糧吹·甸， 3fU下像溫 ^Omin
[0060] 使用AxyPr印PCR清潔試劑盒純化DNA，溶解于25 μ 1 Eluent溶液中。
[0061] (5)經末端補平后的游離DNA的加 A反應：利用步驟⑷所得產物，進行如下反應 (總體系50 μ 1):
[0062] 經 Π 補平后DNA 24}h l^dA TailingBuffi* 25μ1 ciu/μ?) M 7?:.、\溫 施
[0063] 使用AxyPr印PCR清潔試劑盒純化DNA,樣品溶解于25 μ 1 Eluent溶液中。
[0064] (6)將步驟⑶得到的接頭DNA和步驟（5)得到有A粘性末端的游離DNA進行連 接反應，反應體系如下（總體系30 μ 1):
[0065] 有Α丨:張 ?:端的游l·.. 1:)Ν?Α 2、，ι1 義頭wa m 10M..,igase Buffer 3μ? 窺道為:鐘酶（3?μ?) 細1 ddHaO 補Μ 30μΙ
[0066] 反應程序如下：
[0067] 4X2 ia ?*C. lOmin
[0068] 實施例2:孕婦血漿中胎兒游離DNA選擇性PCR擴增
[0069] 利用實施例1的連接產物為模板，寡核苷酸甲為引物進行PCR擴增反應（總體系 20 μ 1)：
[0070] 實施例1產物 3μ1 lOxPlaiinum HiProof Taq PCR Buffer 2μ[ MgCh (25m.M) 1.2μ1 dNTP (2,5mM each) 1.6μΙ 霖核Tf酸平（20μΜ+) 0.5μΙ Platinum HiProof Taq (2υ/μ1) 0.5μ1 <MH20 補至 20μ1
[0071] PCR擴增反應過程如下：
[0072] (a)72°C下接頭延伸 5min,
[0073] (b)8〇°C下預變性 3min，
[0074] (c)80°C下變性 20s，
[0075] (d) 72°C下退火（每個循環較前一循環降低0· 5°C ) 20s，
[0076] (e)72°C 延伸 2min，
[0077] (f)重復（c) - (e) 30 個循環，
[0078] (g)8(TC 下變性 20s，
[0079] (h)57°C下退火 20s，
[0080] (i)72°C下延伸 2min，
[0081] (j)重復（g) _(i) 10-20 個循環，
[0082] (k)72°C 下延伸 5min，
[0083] (1) 4 °C 下保溫。
[0084] 實施例3:孕婦血漿中胎兒游離DNA選擇性PCR擴增
[0085] 利用實施例1的連接產物為模板，寡核苷酸甲為引物進行PCR擴增反應（總體系 20 μ 1)：
[0086] 實施例1產物 3μΙ
[0087] lO^Plattaan HIErorf'TaqTCR Buftr 2μ? M^la CI5mM> Ι.2μ1 dNTP C2.5mMeach> 1 鄭1 寡核苷酸甲--μΜ?: Θ,5μ1. FlMipiini.HiProof Taq ：(2?/μΙ): 0 5μ1 ddtfc&.l卜至 _2_i
[0088] PCR擴增反應過程如下：
[0089] (a)72°C接頭延伸 5min,
[0090] (b) 81°C 下預變性 3min,
[0091] (c)81°C下變性 20s,
[0092] (d)72°C下退火（每個循環較前一循環降低〇· 5°C )20s，
[0093] (e)72°C下延伸 2min,
[0094] (f)重復（c) - (e) 3〇 個循環，
[0095] (g)81°C下變性 20s,
[0096] (h)57°C下退火 20s,
[0097] (i)72°C下延伸 2min,
[0098] (j)重復（g) -(i) 10-20 個循環，
[0099] (k)72°C 下延伸 5min，
[0100] (1)4°C 下保溫。
[0101] 實施例4:孕婦血漿中胎兒游離DNA選擇性PCR擴增
[0102] 利用實施例1的連接產物為模板，寡核苷酸甲為引物進行PCR擴增反應（總體系 20 μ 1):
[0103] 實尥咧j托?；； ?μ1 1 〇χ Platinum HiProofTaq PCR Buffer 2μΙ MgCb (25fflM3： 1.2μ1 dNTP t2,5mM：'.eaeii) Ι,6μ1
[0104] 灘__甲:.__) ().5μ! Plaftim ffiPr〇ofTa| (2υ/μΙ> 〇.5μΙ 趣20μ1
[0105] PCR擴增反應過程如下：
[0106] (a)72°C下接頭延伸 5min，
[0107] (b)82°C 下預變性 3min，
[0108] (c)82°C下變性 2〇s，
[0109] (d) 72°C下退火（每個循環較前一循環降低0· 5°C ) 20s，
[0110] (e)72°C 下延伸 2min，
[0111] ⑴重復（c)_(e)3〇個循環，
[0112] (g)82°C下變性 20s，
[0113] (h)57°C下退火 20s，
[0114] (i)72°C下延伸 2min，
[0115] (j)重復（g) _(i) 10-20 個循環，
[0116] (k)72°C 下延伸 5min，
[0117] (1)4°C 下保溫。
[0118] 實施例5:孕婦血漿中胎兒游離DNA選擇性PCR擴增
[0119] 利用實施例1的連接產物為模板，寡核苷酸甲為引物進行PCR擴增反應（總體系 20 μ 1)：
[0120] 實施例1產物 3μ1 I()xPlatinum HiProof Taq PCR Buflfer 2μ1 MgCh (25mM) !.2μΙ dNTP (2.5mM each) !.6μ1 霖核(20μΜ) 0·5μ1 Platinum HI Proof Taq (2υ/μ1) 0,5μ1 ddH20 補至 20μ1
[0121] PCR擴增反應過程如下：
[0122] (a)72°C下接頭延伸 5min，
[0123] (b)83°C下預變性 3min，
[0124] (c)83°C下變性 20s，
[0125] (d)72°C下退火（每個循環較前一循環降低0· 5°C )20s，
[0126] (e)72°C下延伸 2min，
[0127] (f)重復（c)-(e) 30 個循環，
[0128] (g)83°C下變性 20s，
[0129] (h)57°C下退火 20s，
[0130] (i)72°C下延伸 2min，
[0131] (j)重復（g) _(i) 10-20 個循環，
[0132] (k)72°C 下延伸 5min，
[0133] (1)4°C 下保溫。
[0134] 實施例6:孕婦血漿中胎兒游離DNA選擇性PCR擴增
[0135]利用實施例1的連接產物為模板，寡核苷酸甲為引物進行PCR擴增反應（總體系 20 μ 1)：
[0136] :實施_ 1.:產:_ 3μ? lO^Platinum HiPraof Tkq PCR Bufier 2一 M鋒(25mM> ；l,3pl 3MTP C!JmM each:) 1, jpj 寡核蕾麵：ψ α〇μΜ) 〇.5pl Platinum HiProofTaq (2?/μ1) 〇.§μ| 補至 _
[0137] PCR擴增反應過程如下：
[0138] (&)72。(：下接頭延伸51^11，
[0139] (b)84°C 下預變性 3min，
[0140] (c)84°C下變性 20s,
[0141] (d) 72 °C下退火（每個循環較前一循環降低〇. 5? ) 20s，
[0142] (e)72°C 下延伸 2min，
[0143] (f)重復（c) - (e) 30 個循環，
[0144] &)84。(：下變性2〇8，
[0145] (h)57°C 下退火 20s，
[0146] (i)72°C下延伸 2min，
[0147] (j)重復（g)-(i) 1〇_20 個循環，
[0148] (k)72°C下延伸 5min，
[0149] (1)4°C 下保溫。
[0150] 實施例7:孕婦血漿中胎兒游離DNA選擇性PCR擴增
[0151] 利用實施例1的連接產物為模板，寡核苷酸甲為引物進行PCR擴增反應（總體系 20 μ 1)：
[0152] 實施鈳i產物 m 10 ^Platimun HiProof TaqPCR Buffer 2μ1 MgCla C15mM> _ miW C2 5mM^*} 1.6μ! __議申（20_} 0.5μ1 Piafttura HiProaf 1-- (2ΚμΙ) 〇,5μΛ 鋪iO#至 ?μ?
[0153] PCR擴增反應過程如下：
[0154] (a)72°C下接頭延伸 5min，
[0155] (b)86°C下預變性 3min，
[0156] (c)86°C下變性 2〇s，
[0157] (d)72°C下退火（每個循環較前一循環降低0· 5°C )20s，
[0158] (e)72°C下延伸 2min，
[0159] (f)重復（c) - (e) 30 個循環，
[0160] (g)86°C下變性 20s，
[0161] (h)57°C 下退火 20s，
[0162] (i)72°C下延伸 2min，
[0163] (j)重復（g)-(i)10_20 個循環，
[0164] (k)72°C 下延伸 5min，
[0165] (1)4°C 下保溫。
[0166] 實施例8:孕婦血漿中胎兒游離DNA選擇性PCR擴增
[0167] 利用實施例1的連接產物為模板，寡核苷酸甲為引物進行PCR擴增反應（總體系 20 μ 1):
[0168] 實施例1產_ 10 X Plattemi Hffroof laq P? Buf&r 2μ1 MgCh CtlmM：) 1.2μ1 dNTP C：2JmM eaeli) Up! 寒核豐_甲_ (2〇.μΜ) ：0.Sp Platinum 碰_Fllq C21%1) :〇.3_ ddHaD 補至 20μΙ
[0169] PCR擴增反應過程如下：
[0170] (a)72°C下接頭延伸 5min，
[0171] (b)87°C下預變性 3min，
[0172] (c)87°C下變性 20s，
[0173] (d)72°C下退火（每個循環較前一循環降低0· 5°C )20s，
[0174] (e)72°C下延伸 2min，
[0175] (f)重復（c)-(e) 30 個循環，
[0176] (g)87°C下變性 20s，
[0177] (h)57°C下退火 20s，
[0178] (i)72°C下延伸 2min，
[0179] (j)重復（g) _(i) 10-20 個循環，
[0180] (k)72°C 下延伸 5min，
[0181] (1)4°C 下保溫。
[0182] 取實施例2-8產物進行電泳，結果如圖1所示，其中泳道1為DL2000DNA Marker， 泳道2為實施例2產物，泳道3為實施例3產物，泳道4為實施例4產物，泳道5為實施例 5產物，泳道6為實施例6產物，泳道7為實施例7產物，泳道8為實施例8產物，泳道9為 空白對照。
[0183] 結果表明：本方法選擇的溫度80_87°C能夠選擇擴增小片段的DNA分子，而大片段 DNA分子不能被擴增。
【權利要求】
1. 一種選擇性擴增孕婦血漿中游離胎兒DNA的方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 合成兩條寡核苷酸，寡核苷酸甲3'端為T堿基，從寡核苷酸甲3'端的第二個堿基與 寡核苷酸乙5'端開始互補；將寡核苷酸乙5'端用磷酸根修飾；經退火反應得到接頭DNA ; (2) 將游離DNA末端補平后經加 A反應，得到有A粘性末端的游離DNA ; (3) 將步驟（1)得到的接頭DNA和步驟（2)得到的有A粘性末端的游離DNA進行連接 反應，得到連接產物； (4) 利用步驟⑶所述的連接產物為模板，步驟⑴中的寡核苷酸甲為引物進行PCR擴 增，反應過程如下： (a) 72°C下接頭延伸5min， (b) 80?87°C下預變性3min, (c) 8〇 ?87°C下變性 2〇s， (d) 72°C下退火（每個循環較前一循環降低0· 5°C )20s， (e) 72°C下延伸 2min， (f) 重復（c)-(e) 30個循環， (g) 8〇 ?87°C下變性 2〇s， (h) 57°C下退火 20s， (i) 72°C下延伸 2min， (j) 重復（g)-(i)l〇_2〇 個循環， (k) 72°C 下延伸 5min， (l) 4°C下保溫。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（4)中（b)82?84°C下預變性3min。
3. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于：步驟（4)中（c) 82?84°C下變性20s。
4. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于：步驟（4)中（g) 82?84°C下變性20s。
5. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1)中所述的磷酸根修飾是通過T4 多聚核苷酸激酶實現的。
6. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2)中所述的末端補平是通過T4DNA 聚合酶實現的。
7. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟⑵中所述的加 A是通過Taq DNA聚 合酶實現的。
8. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（3)中所述的連接是通過T4DNA連 接酶實現的。
【文檔編號】C12Q1/68GK104232771SQ201410468117
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月12日 優先權日:2014年9月12日
【發明者】張桂珍, 楊麒巍, 杜珍武, 宋旸, 于杉 申請人:吉林大學