一種ɑ-角蛋白底物特異性提高的角蛋白酶機器構建方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種ɑ-角蛋白(羊毛鱗片)的底物特異性提高的角蛋白酶及其應用，屬于遺傳工程領域。本發明采用定點突變技術將地衣芽胞桿菌Bacillus licheniformis BBE11-1的角蛋白酶(ker)基因進行定點突變并克隆連接到枯草芽孢桿菌表達載體pMA5，轉化Bacillus subtilis WB600，經純化驗證得到一株可以產具有較好ɑ-角蛋白底物特異性的角蛋白酶的重組枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis WB600-pMA5-kerMA，該菌株表達的角蛋白酶在對天青角蛋白(ɑ-角蛋白)的比酶活較野生型增加了50％。同時突變體較野生型角蛋白酶具有更好的羊毛織物防氈縮效果，這為角蛋白酶的應用奠定了良好的基礎。
【專利說明】一種α-角蛋白底物特異性提高的角蛋白酶機器構建方法 和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種α_角蛋白（羊毛鱗片）的底物特異性提高的重組角蛋白酶及其 構建方法和應用，屬于遺傳工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002] 角蛋白酶（Keratinase)是一種可以特異性降解角蛋白的酶類，由細菌、放線菌和 真菌等多種微生物產生。角蛋白酶可以將羽毛角蛋白轉化為可溶性蛋白以及氨基酸，可以 代替糧食作物作為飼料喂養家禽。另外，角蛋白酶處理方法也可以應用在紡織物處理上取 代污染較嚴重的化學處理方法進而在保護環境的前提下改善織物的性能。同樣，角蛋白酶 在其他領域如清潔劑、醫藥、化妝品、皮革等行業也具有廣泛的應用價值。
[0003] 羊毛是一種α-角蛋白，其蛋白組成形式主要為α螺旋，并含有較高含量的半胱氨 酸殘基（10.5-17%)形成二硫鍵。同時，羊毛鱗片蛋白還具有較高含量的精氨酸、天冬氨 酸、谷氨酸和賴氨酸，眾多的二硫鍵結構與賴氨酸和谷氨酸形成的離子鍵結構使得羊毛鱗 片十分牢固因此很難被降解。由于羊毛鱗片是造成羊毛織物氈縮的主要原因，因此角蛋白 酶能否對鱗片進行有效降解是評價該酶防氈縮應用價值的主要指標。
[0004] 來源于地衣芽胞桿菌的角蛋白酶與subtilisin ΒΡΝ' 一樣，具有較廣的底物特異 性。根據與底物結合位置的不同角蛋白酶底物結合區域可以分為SI、S2、S3、S4、SI'、S2'、 S3'，其中起主要作用的為S1和S4底物結合區域，分別與底物的P1和P4位置殘基相連。 雖然角蛋白酶催化中心直接作用于與S1結合區域結合的底物P1位置的殘基，但研究發現 S4底物結合區域對底物的偏好性與S1結合區域一樣同等重要。因此，本發明通過對角蛋白 酶S4底物結合區域進行改造，提高了角蛋白酶對α-角蛋白的底物特異性。
【發明內容】
[0005] 本發明要解決的技術問題是提供一種對α-角蛋白（羊毛鱗片）的底物特異性提 高的角蛋白酶，其是對現有的角蛋白酶S4底物結合區域進行定點突變。
[0006] 所述角蛋白酶氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0007] AQTVPYGIPLIKADKVQAQGFKGANVKVAVLDTGIQASHPDLNVVGGASFVAGEAYNTDGNGHGTHVAG TVAALDNTTGVLGVAPSVSLYAVKVLNSSGSGSYSGIVSGIEWATTNGMDVINMSLGGASGSTAAKQAVDNAYARGV VVVAAAGNSGSSGNTNTIGYPAKYDSVIAVGAVDSNSNRASFSSVGAELEVMAPGAGVYSTYPTNTYATLNGTSMAS PHVAGAAALILSKHPNLSASQVRNRLSSTATYLGSSFYYGKGLINVEAAAQ
[0008] 本發明還提供了一種獲得所述角蛋白酶的方法，其特征在于以GenBank登錄號為 JX504681公布的基因序列基礎上，對角蛋白酶S4底物結合區域進行分子改造，具體將134 為Met替換為Ala。
[0009] 產所述產角蛋白酶的基因工程菌或轉基因細胞系也為本發明要求保護的范圍。
[0010] 本發明要解決的另一個技術問題是提供一種構建產角蛋白酶的基因工程菌的構 建方法，具體包括如下步驟：
[0011] 1)采用化學全合成或PCR方法克隆GenBank登錄號為JX504681 ;
[0012] 2)將步驟1)獲得的角蛋白酶基因進行定點突變，將134位Met替換為Ala，
[0013] 連接到枯草桿菌表達載體，得到重組表達載體；
[0014] 3)將步驟2)獲得的重組表達載體轉化Bacillus subtilis WB600得到基因工程 菌。
[0015] 所述表達載體優選pMA5。
[0016] 應用上述產角蛋白酶基因工程菌發酵生產角蛋白酶的方法，將其斜面活化制備種 子后，以3%的接種量轉入基本發酵培養基，于37°C、200rpm條件下培養24h。
[0017] 所述基本發酵培養基組成為胰蛋白胨l〇g/L，酵母抽提物5g/L，NaC110g/L，葡萄 糖 10g/L，MgS04 0· lg/L。
[0018] α-角蛋白活力測定方法：將發酵液離心10min(10000Xg，4°C )取發酵上清液，吸 取500uL適當稀釋的酶液，加入2. 5mL0. 05mol/L gly-NaOH緩沖液（pH9. 0)溶解1%的底物 (天青角蛋白），50°C培養60min，加入2mL4M TCA溶液以終止反應。離心lOmin，吸取上清 液移入到新的試管中。空白為在加入酶液的同時，加入500uL TCA溶液，經過相同過程反應 的過濾清液作為空白。在595nm處檢測吸光值，與空白相比較在595nm處每增加0. 01吸光 度定義為一個酶活單位。
[0019] 本發明采用定點突變技術將地衣芽胞桿菌Bacillus licheniformis BBE11-1 的角蛋白酶（ker)基因進行定點突變并克隆連接到枯草芽孢桿菌表達載體pMA5,轉化 Bacillus subtilis WB600,經純化驗證得到一株可以產具有較好α-角蛋白底物特異性的 角蛋白酶的重組枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis WB600-pMA5-kerMA，該菌株表達的角蛋 白酶在對天青角蛋白（α_角蛋白）的比酶活較野生型增加了 50%。同時突變體較野生型角 蛋白酶具有更好的羊毛織物防氈縮效果，這為角蛋白酶的應用奠定了良好的基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020] 圖1 :野生型角蛋白酶與突變體SDS-PAGE圖
[0021] M :Marker ;泳道 1-4 :野生型，Ι106Α, Μ134Α, Υ103Α。
[0022] 圖2 :野生型與突變體角蛋白酶酶解后氨基酸分析。
[0023] 圖3 :野生型與突變體角蛋白酶XPS分析。
[0024] 圖4 :野生型及突變體角蛋白酶對羊毛防氈縮效果的影響。
【具體實施方式】
[0025] 實施例1 α-角蛋白底物特異性提高的角蛋白酶
[0026] 本發明的角蛋白酶是在GenBank accession nos. JX504681公布的基因序列基 礎上，對S4底物結合區域進行分子改造，具體將134為Met替換為Ala。其獲得方法為以 GenBank accession nos. JX504681公布的基因為出發基因，通過化學全合成或定點突變的 方式進行氨基酸的取代。
[0027] 實施例2產角蛋白酶基因工程菌的構建及鑒定
[0028] 構建產角蛋白酶基因工程菌的步驟如下：
[0029] 1)以pMAS-ker為模板，采用PCR方法或化學全合成方法獲得ker基因突變子 kerTB ；
[0030] 2)S4底物結合區域的分子改造：Ilel06以及Metl34分別位于S4底物結合區域的 兩個不同位置的低端，其直接決定著S4結合區域的大小。同時，Tyrl03被證明是另外一個 決定S4區域大小的重要位置的氨基酸殘基。為了保證S4結合區域的疏水框架結構，分別 引入四個突變體來增大（Ι1〇6Α、Μ134Α和Y103A)和減小（I106F)S4底物結合區域。
[0031] PCR方法突變引物序列如下：
[0032]
【權利要求】
1. 一種對α-角蛋白底物特異性提高的角蛋白酶，其特征在于對現有的決定角蛋白酶 底物特異性的S4底物結合區域進行定點突變，通過對決定S4底物結合區域小的關鍵位點 氨基酸進行定點突變，提高了角蛋白酶對α-角蛋白的底物特異性。
2. 如權利要求1所述的角蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
3. 權利要求1所述的角蛋白酶，其特征在于以GenBank登錄號為JX504681公布的基因 序列基礎上，對S4底物結合區域進行分子改造，具體為將134為Met替換為Ala。
4. 產權利要求1-3任一所述產角蛋白酶的基因工程菌或轉基因細胞系。
5. -種構建產權利要求1或3所述角蛋白酶的基因工程菌的方法，其特征在于包括如 下步驟： 1) 采用化學全合成或PCR方法克隆GenBank登錄號為JX504681 ; 2) 將步驟1)獲得的角蛋白酶基因進行定點突變，將134位Met替換為Ala，連接到枯 草桿菌表達載體，得到重組表達載體； 3) 將步驟2)獲得的重組表達載體轉化Bacillus subtilis WB600得到基因工程菌。
6. 權利要求5所述的方法，其特征在于所述表達載體為pMA5。
7. -種發酵生產角蛋白酶的方法，其特征在于以權利要求5獲得的產角蛋白酶基因工 程菌為生產菌株，斜面活化制備種子后，以3%的接種量轉入已優化的基本發酵培養基，于 37 °C、200rpm條件下培養24h。
8. 權利要求7所述的方法，其特征在于基本發酵培養基組成為胰蛋白胨10g/L，酵母抽 提物 5g/L，NaC110g/L，葡萄糖 10g/L，0. lg/L MgS04。
【文檔編號】C12N9/56GK104232610SQ201410467083
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月12日 優先權日:2014年9月12日
【發明者】陳堅, 劉柏宏, 張娟, 堵國成, 方真 申請人:江南大學