一種敗醬草懸浮細胞的快速繁殖方法
【專利摘要】本發明研究了一種敗醬草懸浮細胞的快速繁殖方法，包括無菌葉片的獲得、愈傷組織的誘導、懸浮細胞培養、細胞懸浮體系的優化等步驟。本發明方法所制備的敗醬草懸浮細胞中含有較高含量的次生代謝產物，本發明有助于敗醬草資源的充分利用和保護敗醬草種質資源的可持續生長，并且有利于建立敗醬草懸浮細胞的大規模工廠化生產。
【專利說明】一種敗醬草懸浮細胞的快速繁殖方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及組培條件下敗醬草懸浮細胞的培養，屬于植物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]敗醬草，arvense Zi/?/?,又名:蘇敗醬、遏藍菜，多年生草本，生于山坡草地、路旁。主產江蘇、浙江、湖北、安徽。含白花敗醬甙(villoside)、莫羅忍冬甙(morroniside)、番木鳘式(1ganin)等。性味性涼,味辛、苦。功能主治:清熱解毒，祛瘀排膿。用于闌尾炎、痢疾、腸炎、肝炎、眼結膜炎、產后瘀血腹痛、癰腫疔瘡。目前敗醬草主要使用種子繁殖，每年6月種子成熟后進行采收、陰干，選取籽粒飽滿無病蟲害的種子裝袋并存于冰箱。來年3月下旬春播。組培方法研究目前尚處于起步階段，懸浮細胞培養還無人研究，懸浮細胞具有操作簡單可控，生產成本低，繁殖率高等優點。
【發明內容】
[0003]本發明所要解決的技術問題是提供敗醬草懸浮細胞培養的快速繁殖方法，并通過硝酸鐠對懸浮細胞調控獲得生長良好、次生代謝物質含量高的懸浮細胞。
[0004]為解決上述技術問題，本發明采用下列技術方案:
選用敗醬草幼嫩的葉片，用漂白粉浸泡三分鐘，自來水沖洗55分鐘，在超凈工作臺上用0.1 %的升汞消毒8分鐘，無菌水沖洗5-6次，接種在MS+NAA0.4mg/L+2,4-D4.0mg/L+KT0.4mg/L愈傷組織誘導培養基上，培養條件為光照15001x，暗室培養，溫度25-28°C，濕度70%-80%。將誘導出來的愈傷組織接入液體培養基MS+NAA0.2mg/L+2,4-D1.5mg/L+TDZ0.08mg/L+200g/L馬鈴薯汁培養基上進行懸浮細胞培養30天，待懸浮細胞生長穩定，在培養基中附加30硝酸鐠進行敗醬草懸浮細胞的調控。
[0005]采用本發明制備的敗醬草懸浮細胞，生長速度快，能耗小，污染小，次生代謝物含量高。
[0006]下面將結合【具體實施方式】對本發明作進一步闡述，但本發明要求保護的范圍并不局限于下列實施方式。
【具體實施方式】
[0007]實施例1
選用敗醬草幼嫩的葉片，用漂白粉浸泡三分鐘，自來水沖洗55分鐘，在超凈工作臺上用0.1 %的升汞消毒8分鐘，無菌水沖洗5-6次，接種在MS+NAA0.4mg/L+2,4-D4.0mg/L+KT0.4mg/L愈傷組織誘導培養基上，培養條件為光照15001x，暗室培養，溫度25-28°C，濕度70%-80%。將誘導出來的愈傷組織接入液體培養基MS+NAA0.lmg/L+2,4-Dlmg/L+TDZ0.06mg/L+200g/L馬鈴薯汁培養基上進行懸浮細胞培養30天，待懸浮細胞生長穩定，在培養基中附加20硝酸鐠進行敗醬草懸浮細胞的調控。
[0008]實施例2選用敗醬草幼嫩的葉片，用漂白粉浸泡三分鐘，自來水沖洗55分鐘，在超凈工作臺上用0.1 %的升汞消毒8分鐘，無菌水沖洗5-6次，接種在MS+NAA0.4mg/L+2,4-D4.0mg/L+KT0.4mg/L愈傷組織誘導培養基上，培養條件為光照15001x，暗室培養，溫度25-28°C，濕度70%-80%。將誘導出來的愈傷組織接入液體培養基MS+NAA0.2mg/L+2,4-D1.5mg/L+TDZ0.12mg/L+200g/L馬鈴薯汁培養基上進行懸浮細胞培養30天，待懸浮細胞生長穩定，在培養基中附加40硝酸鐠進行敗醬草懸浮細胞的調控。
[0009]實施例3
選用敗醬草幼嫩的葉片，用漂白粉浸泡三分鐘，自來水沖洗55分鐘，在超凈工作臺上用0.1 %的升汞消毒8分鐘，無菌水沖洗5-6次，接種在MS+NAA0.4mg/L+2,4-D4.0mg/L+KT0.4mg/L愈傷組織誘導培養基上，培養條件為光照15001x，暗室培養，溫度25-28°C，濕度70%-80%。將誘導出來的愈傷組織接入液體培養基MS+NAA0.2mg/L+2,4-D1.5mg/L+TDZ0.06mg/L+200g/L馬鈴薯汁培養基上進行懸浮細胞培養30天，待懸浮細胞生長穩定，在培養基中附加 30硝酸鐠進行敗醬草懸浮細胞的調控。
【權利要求】
1.一種敗醬草懸浮細胞的快速繁殖方法，其特征是:敗醬草的葉片經消毒處理，接種在MS+NAA0.4mg/L+2，4-D4.0mg/L+KT0.4mg/L愈傷組織誘導培養基上，將誘導出來的愈傷組織接入液體培養基 MS+NAA0.1-0.2mg/L+2,4-Dl-l.5mg/L+TDZ0.06-0.12mg/L+200g/L 馬鈴薯汁培養基上進行懸浮細胞培養30天，待懸浮細胞生長穩定，在培養基中附加20-40硝酸鐠進行敗醬草懸浮細胞的調控。
2.根據權利要求1所述的一種敗醬草懸浮細胞的快速繁殖方法，其特征是:所述的消毒處理為:選用敗醬草幼嫩的葉片，用漂白粉浸泡三分鐘，自來水沖洗55分鐘，在超凈工作臺上用0.1 %的升汞消毒8分鐘,無菌水沖洗5-6次。
3.根據權利要求1所述的一種敗醬草懸浮細胞的快速繁殖方法，其特征是:誘導愈傷組織的條件為光照15001x，暗室培養，溫度25-28°C，濕度70%_80%。
4.根據權利要求1所述的一種敗醬草懸浮細胞的快速繁殖方法，其特征是:懸浮細胞培養中加入了馬鈴薯汁，可以緩沖PH的變化，且為懸浮細胞提供營養物質。
5.根據權利要求1所述的一種敗醬草懸浮細胞的快速繁殖方法，其特征是:在懸浮細胞中加入了 20-40硝酸鐠，既可促進懸浮細胞的生長和增殖，又可調控其次生代謝物的含量。
【文檔編號】C12N5/04GK104178449SQ201410462965
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年9月12日 優先權日:2014年9月12日
【發明者】楊存 申請人:南京通澤農業科技有限公司