一種低聚半乳的唾液酸衍生物及其合成方法
【專利摘要】本發明公開了一種低聚半乳的唾液酸衍生物及其合成方法與應用，HMO是人乳中低聚糖中的主要成分。本方法利用低聚半乳糖GOS和唾液酸（N-Acetylneuraminicacid，Sia）通過CMP-Sia合成酶和唾液酸轉移酶，合成HMO類似物。低聚半乳糖（GOS）是利用β一半乳糖苷酶對乳糖進行水解及合成而得，它是母乳中低聚半乳糖的主要成分，一般是在半乳糖或葡萄糖分子上連接1~7個半乳糖基，即(Gal)n-Glc/Gal(n=1-7)。本發明采用“一鍋雙酶法”合成了三種不同的GOS的唾液酸衍生物。解決了乳制品中唾液酸不足的問題，具有反應活性高，合成步驟簡單，產率高等優點，是一種新型功能的低聚糖，具有廣闊的應用前景。
【專利說明】一種低聚半乳的唾液酸衍生物及其合成方法
[0001]
【技術領域】
[0002] 本發明屬于糖工程【技術領域】，涉及一種ΗΜ0類似物的酶合成方法，特別是涉及到 一種低聚半乳的唾液酸衍生物及其合成方法與應用。
【背景技術】
[0003] ΗΜ0在嬰兒的發育過程中起著非常重要的作用，ΗΜ0由唾液酸殘基部分和多糖兩 部分組成。人母乳中含量較多，嬰兒體內的雙歧桿菌菌群的建立很大程度上依賴母乳中的 G0S成分。含有唾液酸殘基的低聚半乳糖廣泛存在于母乳中。唾液酸在嬰兒的早期生長中 發揮著重要的作用，唾液酸殘基具有抑制病毒，細菌和神經毒素的功能，新生兒合成的唾液 酸很有限。因此，人乳中的唾液酸對于保證嬰兒正常的生長發育至關重要。
[0004] 低聚半乳糖（Galactooligosaccharides，G0S)是一種具有天然屬性的功能性 低聚糖，其分子結構一般是在半乳糖或葡萄糖分子上連接1~7個半乳糖基，即Gal-(Gal) n-Glc/Gal(n為0-6)。在自然界中，動物的乳汁中存在微量的G0S，而人母乳中含量較多， 嬰兒體內的雙歧桿菌菌群的建立很大程度上依賴母乳中的G0S成分。
[0005] 唾液酸（Sialic acid，SA)，是一類含9個碳原子的羧基化單糖酰化衍生物的總 稱，在人體的唾液酸主要為N-乙酰神經氨酸和N-羥乙酰神經氨酸兩種，大多由葡萄糖代謝 生成。唾液酸廣泛分布于真核細胞表面糖蛋白或糖脂的寡糖鏈的最末端，是細胞膜上糖蛋 白、糖脂的重要成分。根據唾液酸與糖殘基的連接方式可將其分為α 2, 3-SA、α 2, 6-SA及 α 2, 8-SA三大類。血清唾液酸來源于細胞表面，以糖結合唾液酸和脂結合唾液酸兩種形式 存在。除硫酸化的糖類外，唾液酸是糖蛋白在生理pH條件下唯一帶凈負電荷的單糖。
【發明內容】
[0006] 本發明在低聚半乳糖的基礎上通過酶合成的方法，提供了一種新型的低聚半乳糖 的唾液酸衍生物以及他們的的制備和純化的方法。
[0007] 本發明的低聚半乳的唾液酸衍生物具有合成步驟簡便，產物性質穩定，轉化效率 高的特點，可以很好的解決乳制品中唾液酸缺乏或者含量不足的問題。
[0008] 為實現上述目的，本發明公開了如下的技術內容： 利用低聚半乳糖和唾液酸通過CMP-Sia合成酶和唾液酸轉移酶合成的ΗΜ0類似物，具 有如下的結構： Pmstl酶催化合成的2, 3-唾液酸連接的G0S唾液酸衍生物 Sia-a2,3-(Gal)n-Glc (n=l-7) Pd2, 6ST酶催化合成的2, 6-唾液酸連接G0S唾液酸衍生物 Sia-a2,6-(Gal)n-Glc (n=l-7) CSTII酶催化合成的2, 3/8-唾液酸連接的G0S唾液酸衍生物 (Sia-a2, 8)m-Sia-a2, 3-(Gal)n-Glc (n=l-7)。
[0009] 本發明進一步公開了 HMO類似物的合成方法，其特征在于按如下的步驟進行： (a) 酶法轉化：利用生物酶在一定條件下作用于低聚半乳糖溶液，生成低聚半乳糖的唾 液酸衍生物的混合物；其中所述的低聚半乳糖與生物酶的重量比例為： NMCSS/G0S=146ug/100mg ；PMSTl/G0S=172ug/100mg ； Pd2, 6ST/G0S=272ug/100mg ；CST II /G0S=616ug/100mg ； 所述生物酶指的是：CMP-Sia合成酶NMCSS和PMST1、Pd2, 6ST、CST II中的一種； (b) 酶分離：將反應產物煮沸終止反應，12000r/min離心20分鐘，分離變性的酶和反應 中的沉淀物，取上清液； (c) 底物和副產物的降解：將分離出的上清液用堿性磷酸酶處理，將反應中未完全反應 的CTP、CMP、CMP-Sia降解為胞苷，采用HPLC檢測； (d) 分離純化：將（c)制得的上清液，經分離、凍干后，制得低聚半乳糖的唾液酸純化后 產物。
[0010] 其中步驟（a)中所述的生物酶指的是：以（Gal)n-Glc/Gal(n=l-7)作為底物；由 來源于微生物中的兩種酶通過"一鍋雙酶法"來催化合成反應，合成三種不同的低聚半乳糖 的唾液酸衍生物。
[0011] 所述作為底物的濃度為20mM/L ;PMST1、Pd2, 6ST催化的反應的CTP和Neu5Ac的 濃度為40mM，CST II催化的反應的CTP和Neu5Ac的濃度為lOOmM，pH8 Tris-Hcl的濃度為 100mM，Mg2.濃度為20mM反應的溫度為37。。，反應時間為l_2h。
[0012] 步驟（c)中HPLC的檢測以磷酸鹽緩沖液，C18柱，260nm吸收波長進行檢測；所述 的磷酸鹽緩沖液指的是：磷酸氫二鈉35. 8 g、磷酸二氫鉀13. 6g加水900ml溶解用氫氧化 鈉溶液，調節pH至7.0,加入1.61g四甲基溴化銨，加水至1000ml。
[0013] 步驟（d)中分離純化：用規格15mm IDX 100cm的Bio-gel P2色譜柱進行色譜分 離，以水為流動相，色譜分離的樣品上樣量為l_2mL，洗脫流速為0. 4-1 mL/min ;最優的樣 品上樣量為lmL，洗脫流速為l-2mL/min，收集洗脫樣品。
[0014] 步驟（a)和（d)中還包括分離后的薄層層析檢測、合并遷移距離相同的產物的步 驟；其薄層層析檢測的步驟如下： 取0. 5 μ L洗脫液，薄層層析板點樣，在展層劑中展開，霧噴顯色劑后，于酒精燈上顯 色；上述展層劑由乙酸乙酯：甲醇：水按體積比4 :2 :1混合配制；顯色劑的配制為冰乙酸、 茴香醛、濃硫酸和乙醇，體積分別為5. 5ml、16ml、27ml和500ml。
[0015] 本發明優選ΗΜ0類似物的合成方法，其特征在于： (1) 稱取 3 份低聚半乳糖（G0S) 100. 00mg、CTP163. 96mg、Neu5Ac 96. 25mg 溶于 5mL ddH20 中，分別向三個試管中加入 ImolTris-Hcl lmL，lmolMgCl2 200ul，NMCSS 150ug ; (2) 向試管一種加入172ug PmSTl，試管二中加入272ug Pd2,6ST，試管三中加入616ug Cst II，加水定容到10. 417ml，混勻，37°C水浴lh，TLC檢測反應進程； (3) 將反應后的溶液100°C煮5min，冷卻，12000r/min離心10min，將上清液轉移到干凈 的試管中； (4) 分別向三個試管中的上清液中加入堿性磷酸酶450ug，37°C水浴4h，HPLC檢測反 應進度，色譜柱為C18柱，米用二兀梯度洗脫，磷酸鹽緩沖液和乙腈體積15%_90%，反應液 100°C煮5分鐘，冷卻，12000r/min離心lOmin，經0. 22 μ m膜過濾冷凍干燥，通過BioGel P-2柱子除去雜質，TLC檢測收集產物真空干燥，得到GOS-Sia產物，經色譜分析，純度達到 95%以上。
[0016] 本發明進一步公開了 ΗΜ0類似物在制備解決乳制品中唾液酸缺乏或含量不足方 面的應用。
[0017] 本發明采用"一鍋雙酶法"合成了三種不同的G0S的唾液酸衍生物，分別為：
【權利要求】
1. 利用低聚半乳糖和唾液酸通過CMP-Sia合成酶和唾液酸轉移酶合成的HMO類似物， 具有如下的結構： Pmstl酶催化合成的2, 3-唾液酸連接的G0S唾液酸衍生物 Sia-a2,3-(Gal)n-Glc (n=l-7) Pd2, 6ST酶催化合成的2, 6-唾液酸連接G0S唾液酸衍生物 Sia-a2,6-(Gal)n-Glc (n=l-7) CSTII酶催化合成的2, 3/8-唾液酸連接的G0S唾液酸衍生物 (Sia-a2, 8)m-Sia-a2, 3-(Gal)n-Glc (n=l-7)。
2. 權利要求1所述HMO類似物的合成方法，其特征在于按如下的步驟進行： 酶法轉化：利用生物酶在一定條件下作用于低聚半乳糖溶液，生成低聚半乳糖的唾液 酸衍生物的混合物；其中所述的低聚半乳糖與生物酶的重量比例為： NMCSS/G0S=146ug/100mg ；PMSTl/G0S=172ug/100mg ； Pd2, 6ST/G0S=272ug/100mg ；CST II /G0S=616ug/100mg ； 所述生物酶指的是：CMP-Sia合成酶NMCSS和PMST1、Pd2, 6ST、CST II中的一種； 酶分離：將反應產物煮沸終止反應，12000r/min離心20分鐘，分離變性的酶和反應中 的沉淀物，取上清液； 底物和副產物的降解：將分離出的上清液用堿性磷酸酶處理，將反應中未完全反應的 CTP、CMP、CMP-Sia降解為胞苷，采用HPLC檢測； 分離純化：將（c)制得的上清液，經分離、凍干后，制得低聚半乳糖的唾液酸純化后產 物。
3. 權利要求1所述HM0類似物的合成方法，其中步驟（a)中所述的生物酶指的是：以 (Gal)n-Glc/Gal(n=l-7)作為底物；由來源于微生物中的兩種酶通過"一鍋雙酶法"來催化 合成反應，合成三種不同的低聚半乳糖的唾液酸衍生物。
4. 權利要求2所述HM0類似物的合成方法，其中所述作為底物的濃度為20mM/L ; PMST1、Pd2, 6ST催化的反應的CTP和Neu5Ac的濃度為40mM，CST II催化的反應的CTP和 Neu5Ac的濃度為lOOmM，pH8 Tris-Hcl的濃度為lOOmM，Mg2+濃度為20mM反應的溫度為 37°C，反應時間為l_2h。
5. 權利要求2所述HMO類似物的合成方法，其中所述步驟（c)中HPLC的檢測以磷酸 鹽緩沖液，C18柱，260nm吸收波長進行檢測；所述的磷酸鹽緩沖液指的是：磷酸氫二鈉35. 8 g、磷酸二氫鉀13. 6g加水900ml溶解用氫氧化鈉溶液，調節pH至7. 0,加入1. 61g四甲基 溴化銨，加水至1000ml。
6. 權利要求2所述HMO類似物的合成方法，其中所述步驟（d)中分離純化：用規格15mm IDX 100cm的Bio-gel P2色譜柱進行色譜分離，以水為流動相，色譜分離的樣品上樣量為 l-2mL，洗脫流速為0. 4-1 mL/min ;最優的樣品上樣量為lmL，洗脫流速為l-2mL/min，收集 洗脫樣品。
7. 權利要求2所述HM0類似物的合成方法，其中所述步驟（a)和（d)中還包括分離后 的薄層層析檢測、合并遷移距離相同的產物的步驟；其薄層層析檢測的步驟如下 ： 取0. 5 μ L洗脫液，薄層層析板點樣，在展層劑中展開，霧噴顯色劑后，于酒精燈上顯 色；上述展層劑由乙酸乙酯：甲醇：水按體積比4 :2 :1混合配制；顯色劑的配制為冰乙酸、 茴香醛、濃硫酸和乙醇，體積分別為5. 5ml、16ml、27ml和500ml。
8. 權利要求1所述HMO類似物的合成方法，其特征在于： (1) 稱取 3 份低聚半乳糖（GOS) 100. OOmg、CTP163. 96mg、Neu5Ac 96. 25mg 溶于 5mL ddH20 中，分別向三個試管中加入 ImolTris-Hcl lmL，lmolMgCl2 200ul，NMCSS 150ug ; (2) 向試管一種加入172ug PmSTl，試管二中加入272ug Pd2,6ST，試管三中加入616ug Cst II，加水定容到10. 417ml，混勻，37°C水浴lh，TLC檢測反應進程； (3) 將反應后的溶液100°C煮5min，冷卻，12000r/min離心lOmin，將上清液轉移到干凈 的試管中； (4) 分別向三個試管中的上清液中加入堿性磷酸酶450ug，37°C水浴4h，HPLC檢測反 應進度，色譜柱為C18柱，米用二兀梯度洗脫，磷酸鹽緩沖液和乙腈體積15%_90%，反應液 100°C煮5分鐘，冷卻，12000r/min離心lOmin，經0. 22 μ m膜過濾冷凍干燥，通過BioGel P-2柱子除去雜質，TLC檢測收集產物真空干燥，得到GOS-Sia產物，經色譜分析，純度達到 95%以上。
9. 權利要求所述1所述的HM0類似物在制備解決乳制品中唾液酸缺乏或含量不足方面 的應用。
【文檔編號】C12P19/18GK104232707SQ201410462676
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月12日 優先權日:2014年9月12日
【發明者】程劍松, 王鵬, 王園明 申請人:南開大學