基于外切葡聚糖酶的工程菌及其實現方法
【專利摘要】一種基因工程領域的基于外切葡聚糖酶的工程菌及其實現方法，以灰略紅鏈霉菌基因組DNA為模板，與含有酶切位點和谷胱甘肽標簽的引物進行PCR擴增得到編碼外切葡聚糖酶的核苷酸序列；然后將擴增得到的基因序列連接到表達載體，再將獲得的連接產物轉入大腸桿菌表達菌株內，獲得外切葡聚糖酶過表達重組菌株。本發明通過構建外源表達載體，優化蛋白誘導表達的條件和融合標簽等方法，實現了外切葡聚糖酶的胞外過表達。
CGMCC NO.5706
2012.01.09
【專利說明】基于外切葡聚糖酶的工程菌及其實現方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及的是一種生物基因工程【技術領域】的基因及其工程菌株，具體是一種灰 略紅鏈霉菌的基于胞外外切葡聚糖酶的工程菌及其實現方法。
【背景技術】
[0002] 木質纖維素是植物界中最為豐富的天然高分子化合物，是植物通過光合作用產生 的主要干物質，主要包括纖維素、半纖維素和木質素。據估計，每年全世界綠色植物光合作 用產生的木質纖維素總干重為1730億t，所含總能量可達2 X 1018kJ，相當于每年全世界消 耗能量的10倍。木質纖維素的生物降解和解聚作用是一個高度復雜的過程，它涉及眾多酶 系的參與。
[0003] 木質纖維素中的纖維素組分是由葡萄糖組成的大分子多糖，不溶于水及一般有機 溶劑，性質穩定；纖維素降解需要纖維素酶的參與，纖維素酶并不是一種簡單的酶，而是由 若干種相互關聯的酶組成的一個復雜的酶系統，主要由3類組成：內切-β - 1，4 -葡聚糖 酶（Endo - β - 1，4 - glucanase)，又被稱為Cen酶；外切葡聚糖酶（Exoglucanses)，又被稱 為Cex酶；β -葡萄糖苷酶（β -glucosidase)，又被稱為BG酶。目前普遍接受的觀點是 3種酶協同作用于纖維素的降解過程，即首先由Cen酶在纖維素聚合物的內部起作用，在纖 維素的非結晶部位進行切割，產生新的末端，然后再由外切葡聚糖酶以纖維二糖為單位，從 末端進行水解，最后由CB酶將纖維二糖徹底水解為葡萄糖。因此，外切葡聚糖酶（Cex)在 纖維素徹底水解過程中起十分關鍵的作用。
[0004] 目前，各種纖維素酶基因均已在細菌中發現并被克隆。與真核生物纖維素酶基因 相比，細菌纖維素酶基因具有不含內含子、易克隆、易表達及種類多等優勢。其中灰略紅鏈 霉菌（Streptomyces griseorubens)是一種常見的土壤細菌（或放線菌）。之前，鏈霉菌研 究重點為如何改造其代謝途徑以提高抗生素尤其是鏈霉素的發酵產量，對其基因組內其他 功能基因的開發和利用還相對不足。
[0005] 與大多數細菌相比，鏈霉菌具有較為復雜的生長分化機制，對大分子多糖物質如 纖維素有很強的分解利用能力。因此，研究鏈霉菌對大分子多糖物質的分解利用機制，發現 全新的纖維素酶基因序列并對目的基因進行外源表達，對新型纖維素酶制劑的開發及生產 具有重大意義。
[0006] 經過對現有技術的檢索發現：中國專利文獻號CN101307295公開（公告）日 2008. 11. 19,公開了一種表達嗜熱毛殼菌（Chaetomium thermophilum)熱穩定外切一β - 1，4 一葡聚糖酶基因 cbh3的畢赤酵母工程菌Pichia pastoris GS - CBH3 - 27。通過RT - PCR及RACE方法從嗜熱毛殼菌獲得外切一 β - 1，4 一葡聚糖酶基因 cbh3,然后將得到的 外切一 β - 1，4 一葡聚糖酶基因 cbh3表達載體pPIC9K/cbh3導入到畢赤酵母GS115中，從 中篩選出了表達外切一 β - 1，4 一葡聚糖酶的酵母工程菌GS - CBH3 - 27。該工程菌外 切一 β - 1，4 一葡聚糖酶表達量高達1. 7mg/mL，酶在60°C是穩定的，在70°C保溫60min， 仍有60 %的活性，80°C的半衰期為10min，具熱穩定性，用于轉化植物纖維素的生物降解， 具有較高經濟價值和社會價值。但該工程菌在堿性條件下的酶學性質難以滿足現有工業需 要。
【發明內容】
[0007] 本發明針對現有技術存在的由于外切葡聚糖酶在生物體內多為胞內酶且表達量 較低導致的應用范圍和效果嚴重受限等不足，提出一種基于外切葡聚糖酶的工程菌及其實 現方法，通過構建外源表達載體，優化蛋白誘導表達的條件和融合標簽等方法，實現了外切 葡聚糖酶的胞外過表達，本發明不僅在高溫條件下具有較高的生物學活性，此外在堿性條 件下也可以維持穩定的酶學性質。
[0008] 本發明是通過以下技術方案實現的：
[0009] 本發明涉及一種外切葡聚糖酶的工程菌，該工程菌為外源表達外切葡聚糖酶的大 腸桿菌。
[0010] 所述的胞內外切葡聚糖酶具體為灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1胞外外切葡聚糖酶基因 SG - CX，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，氨基酸序列如 SEQ ID No. 2所示，編碼該外切葡聚糖酶核苷酸序列為1737bp，共編碼578個氨基酸，其中 信號肽切割位于N端第32個氨基酸與第33個氨基酸之間。
[0011] 所述的 SEQ ID NO. 1 克隆自灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD-1, 現保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，保藏編號為CGMCC No. 5706,保藏日期為2012年1月9日，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國 科學院微生物研究所郵編100101。
[0012] 所述的外切葡聚糖酶編碼基因通過全基因組測序和PCR擴增的方式克隆獲得。
[0013] 本發明涉及上述工程菌的實現方法，以灰略紅鏈霉菌基因組DNA為模板，與含有 酶切位點和谷胱甘肽的引物進行PCR擴增得到編碼外切葡聚糖酶的核苷酸序列；然后將擴 增得到的基因序列連接到表達載體PET - 41a(+)，再將獲得的連接產物轉入大腸桿菌表達 菌株內，獲得外切葡聚糖酶過表達重組菌株。
[0014] 所述的含有酶切位點和谷胱甘肽標簽的引物，即含有Spe I和EcoR I酶切位點引 物，具體包括：
[0015] CX - Spe I - F:GACTAGTGCCGCCGTCCCCTGCACCGTGGA
[0016] CX - EcoR I - R:GGAATTCTCACGACACCGGCGGGTAGGCGT
[0017] 所述的PCR擴增的條件為：98°C預變性3min ;98°C變性10s，68°C延伸45s ;30個 循環后68°C終延伸3min。
[0018] 所述的大腸桿菌表達菌株為Transetta(DE3)大腸桿菌。
[0019] 本發明涉及一種外切葡聚糖酶的工程菌的應用，將其用于外切葡聚糖酶的體外高 效表達，并用于外切葡聚糖酶的規模化發酵生產。 技術效果
[0020] 與現有技術相比，本發明克服現有技術中的外切葡聚糖酶在生物體內多為胞內酶 且表達量較低，導致應用范圍和效果嚴重受限等不足，應用基因工程手段實現其體外的大 量表達與合成。此外，本發明通過在重組蛋白N端添加谷胱甘肽標簽的方法，在顯著提高表 達量的同時也方便了蛋白后期的純化，為外切葡聚糖酶的規模化發酵生產提供一種新的方 向。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021] 圖1為灰略紅鏈霉菌外切葡聚糖酶信號肽預測圖。
[0022] 圖2為重組木質素過氧化酶（GST · Tag)體外過表達SDS - PAGE驗證圖。
[0023] 圖3為重組木質素過氧化酶（GST · Tag)體外過表達Western Bolt驗證圖。
【具體實施方式】
[0024] 下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施 例。 實施例1
[0025] 本實施例包括以下步驟：
[0026] 步驟1)灰略紅鏈霉菌的分離及培養
[0027] 灰略紅鏈霉菌分離自上海市浦江鎮收集的腐爛秸桿，保藏編號為CGMCC No. 5706。 將該菌種接種于LB液體培養基，32 °C培養48h。
[0028] 上述LB液體培養基組分為：蛋白胨10. Og/L，酵母提取物5. Og/L，NaCl 10. Og/L， pH6. 8 - 7. 2。在液體培養基中加入15. 0 - 20. 0g/L瓊脂即得LB固體培養基。
[0029] 步驟2)灰略紅鏈霉菌基因組DNA提取
[0030] 灰略紅鏈霉菌基因組DNA提取
[0031] 收集2. OmL菌液，12000rpm離心2min。棄上清，收集菌體沉淀，加入180 μ L溶菌酶 (20mg/mL)和 20yL EDTA 溶液（0.5M，pH 8.0)，37°C 處理 45min，加入 4yL RNase A(100mg/ mL)，震蕩混勻15s，室溫放置5min，隨后按照細菌DNA提取試劑盒（TIANGEN)操作說明完成 剩余操作，得到高純度基因組DNA。通過0. 8%瓊脂糖凝膠電泳確定基因組DNA質量，確保 無明顯RNA條帶，基因組條帶清洗、完整、無降解、無污染。
[0032] 步驟3)灰略紅鏈霉菌基因組測序
[0033] 確定全基因組鳥槍法（WGS)策略，采用第二代測序技術，構建不同插入片段長度 的文庫，采用Illumina Miseq(2X250bp)平臺進行測序。收集測序的原始數據，對帶接頭、 低質量的數據進行過濾，隨后采用Newbler v2. 8對去除接頭的測序數據進行從頭拼接，構 建contig及scaffold,最后使用GapCloser程序進行缺口填補得到鏈霉菌基因組草圖。
[0034] 步驟4)蛋白編碼基因功能預測
[0035] 采用Glimmer 3. 0軟件對全基因組序列進行基因預測。基因預測模型選取自我訓 練基因預測模型，即提取拼裝序列中最長的序列，以該序列作為基因預測模型訓練的序列。 然后以該序列構建的基因預測模型，對所有序列進行基因預測，設定開放閱讀框的長度為 ll〇bp，其余參數為Glimmer 3. 0的默認設置。
[0036] 步驟5)外切葡聚糖酶膜定位預測
[0037] 采用SignalP 4. 1分別對外切葡聚糖酶氨基酸序列進行信號肽模擬預測，如圖1 所示。結果表明外切葡聚糖酶存在明顯的信號肽序列，推測該酶為胞外酶，預測切割位點為 N端第32個氨基酸（精氨酸）與第33個氨基酸（精氨酸）之間。
[0038] 步驟6)外切葡聚糖酶表達載體構建
[0039] 根據外切葡聚糖酶基因序列，設計含有酶切位點的引物，序列如下：
[0040] CX - Spe I - F:GACTAGTGCCGCCGTCCCCTGCACCGTGGA
[0041] CX - EcoR I - R:GGAATTCTCACGACACCGGCGGGTAGGCGT
[0042] 以灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens)基因組DNA為模板，用含有Spe I和EcoR I酶切位點引物進行PCR擴增獲得外切葡聚糖酶基因序列，使用DNA A -Tailing Kit加 A后連接到T-Vector PMDTM 19-T(TaKaRa)，并將連接產物轉入DH5a大腸桿菌內。 挑選陽性克隆，搖菌提取質粒測序。Spe I和EcoR I進行雙酶切（37°C)，回收外切葡聚糖 酶DNA片段CX。用相同內切酶酶切表達載體pET-41a(+)并回收載體DNA片段。將CX與 載體片段混合，T4DNA Ligase(TaKaRa)過夜連接（16°C)，將連接產物轉入DH5a大腸桿菌 感受態細胞內，通過抗性平板及菌落PCR篩選含有目的基因的表達載體的陽性克隆。挑取 陽性克隆接種于含有卡那霉素（50 μ g/mL)的LB液體培養基中，180rpm、37°C培養16小時 后提取質粒。
[0043] 上述PCR擴增條件為：98°C預變性3min ;98°C變性10s，68°C延伸45s ;30個循環 后68°C終延伸3min。
[0044] 步驟7)外切葡聚糖酶過表達轉基因菌株的構建
[0045] 將上述表達載體轉入Transetta(DE3)大腸桿菌并在含有卡那霉素（50 μ g/mL)和 氯霉素（34 μ g/mL)的LB固體培養基上篩選，獲得外切葡聚糖酶過表達菌株。
[0046] 上述的Transetta(DE3)具有以下特征：該菌株具有氯霉素（Camr)且含有大腸桿 菌缺乏的6種稀有密碼子（AGA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA)對應的tRNA，可有效提高外源基 因，尤其是真核生物及鏈霉菌等高GC含量生物基因在原核系統中的表達水平。
[0047] 步驟8)重組外切葡聚糖酶體外過表達及純化
[0048] 挑取陽性克隆于含有卡那霉素（50 μ g/mL)和氯霉素（34 μ g/mL)的LB液體培養 基中，在32°C震蕩培養，當0D_達到0. 6 -0. 8時，加入IPTG溶液使其在培養液中的濃度達 至IJ 100 μ M，28°C繼續培養16小時進行誘導表達。誘導表達培養好的發酵液離心收集菌體， 利用破胞緩沖液洗滌菌體一次，再利用1/10發酵液體積的磷酸鹽緩沖液緩沖液重懸菌體 后在冰浴條件下利用超聲波破胞至菌液澄清，13000rpm/min離心15min收集上清,上清液 即為外切葡聚糖酶的粗酶液。通過〇. 45 μ m濾膜過濾掉粗酶液中的雜質，隨后通過GST蛋 白純化試劑盒的操作要求完成融合蛋白的純化。
[0049] 重組菌誘導表達外切葡聚糖酶的SDS - PAGE驗證
[0050] 制備 12% SDS -PAGE 膠，將粗酶液與 5XSDS -PAGE Loading Buffer 比例混合，與 沸水浴5min，每個點樣孔上樣20 μ L，在160V電壓下電泳60 - 70min，直至溴酚藍指示條帶 完全跑出膠。停止電泳，用考馬斯亮藍R - 250溶液染色20min，然后用脫色液進行洗滌，直 至背景色完全脫去，條帶清晰可見（如圖2)。
[0051] 所述的12% SDS - PAGE是由濃縮膠與分離膠構成的，其組分分別為：
[0052] 分離膠：蒸餾水 1. 6mL，30%丙烯酰胺溶液 2. OmL，1. 5M Tris -HC1 (pH 8. 8) 1. 3mL， 10% 過硫酸銨（APS)0. 05mL，10% SDS 溶液 0· 05mL，TEMED 0· 002mL ;
[0053] 濃縮膠：蒸餾水 0· 68mL，30 % 丙烯酰胺溶液 0· 17mL，1. 0M Tris - HC1 (pH 6. 8)0. 13mL，10%過硫酸銨（APS)0· OlmL，10% SDS 溶液 0· OlmL，TEMED 0· OOlmL ;
[0054] 所述的 5XSDS - PAGE Loading Buffer 組分為：1M Tris - HC1 (pH 6· 8) 1. 25mL， SDS 0· 5g，溴酚藍25mg，甘油2. 5mL，去離子水定容至5mL。小份分裝（500 μ L)后與室溫保 存，使用前每小份加入β -巰基乙醇25 μ L。
[0055] 所述的考馬斯亮藍R - 250溶液組分為：考馬斯亮藍R - 2501g，異丙醇250mL，冰醋 酸100mL，去離子水650mL。
[0056] 所述的脫色液組分為：冰醋酸lOOmL，無水乙醇50mL，去離子水850mL。
[0057] 重組菌誘導表達外切葡聚糖酶的Western Blot驗證
[0058] Western Blot詳細步驟如下：
[0059] 按順序組裝轉膜裝置：正電極、海綿、三張濾紙、PVDF膜、SDS - PAGE膠、三張濾紙、 海綿和負電極。其中PVDF膜使用前先用甲醇泡10min，濾紙用電轉液浸泡。將裝好的轉膜 裝置放入電轉槽，4°C 100V轉60 - 70min。
[0060] 所述的SDS - PAGE膠是指：實施例9中已完成電泳、未染色的膠塊；所述電轉液的 組分為：甘氨酸2. 9g/L，Tris 5. 8g/L，SDS 0. 37g，甲醇200mL，去離子水800mL，配好之后 4°C預冷。
[0061] 封閉：將轉好的PVDF膜置于封閉液中，并置于水平振蕩器上室溫封閉lh。
[0062] 所述封閉液組分為：5. 0g脫脂奶粉溶解于100mL TBST緩沖液；所述的TBST緩沖 液組分為：NaCl 8. 8g，1M Tris - HC1 (pH 8. 0) 20mL，吐溫-200. 5mL，去離子水 980mL。
[0063] 一抗雜交：將封閉完的PVDF膜轉入一抗溶液中，置于滾動搖床37°C、150rpm孵育 lh〇
[0064] 所述的一抗溶液組分為：將抗His -兔多克隆抗體以1 :5000溶在封閉液中。
[0065] 洗膜：將一抗孵育完的PVDF膜轉入TBST緩沖液中，在搖床上震蕩清洗3次，每次 l〇min ;之后再在TBS緩沖液中清洗1次，10min。
[0066] 所述TBS緩沖液是指不含吐溫-20組分的TBST緩沖液。
[0067] 二抗雜交：將沖洗干凈的PVDF膜放入二抗溶液中，置于滾動搖床37°C、150rpm孵 育lh。
[0068] 所述的二抗溶液組分為：將羊抗兔IgG - HRP以1 :5000溶在封閉液中。
[0069] 洗膜：同前。
[0070] 染色：將染色液均勻涂抹于PVDF膜上，靜置lmin。通保鮮膜包好PVDF膜，置于X -光片盒中，并用透明膠帶固定。
[0071] 所述的染色液組分是將EasySee Western Blot Kit(TRANSGEN)中 500μ L溶液A、 500 μ L溶液Β與1 μ L溶液C混合。
[0072] 顯影：于暗室中壓片洗膜顯影，結果如圖3所示。
【權利要求】
1. 一種外切葡聚糖酶的工程菌，其特征在于，該工程菌為外源表達外切葡聚糖酶的大 腸桿菌； 所述的胞內外切葡聚糖酶具體為灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens)JSD-l 外切葡聚糖酶基因 SG -CX，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，氨基酸序列如SEQ ID No. 2 所示，編碼該外切葡聚糖酶核苷酸序列為1737bp，共編碼578個氨基酸，其中信號肽切割位 于N端第32個氨基酸與第33個氨基酸之間。
2. 根據權利要求1所述的工程菌，其特征是，所述的灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1，現保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (CGMCC)，保藏編號為CGMCC No. 5706,保藏日期為2012年1月9日。
3. -種根據權利要求1或2中所述的工程菌的實現方法，其特征在于，以灰略紅鏈霉菌 基因組DNA為模板，與含有酶切位點和谷胱甘肽標簽的引物進行PCR擴增得到編碼外切葡 聚糖酶的核苷酸序列；然后將擴增得到的基因序列連接到表達載體PET -41a(+)，再將獲得 的連接產物轉入大腸桿菌表達菌株內，獲得外切葡聚糖酶過表達重組菌株。
4. 根據權利要求3所述的方法，其特征是，所述的含有酶切位點和谷胱甘肽標簽的引 物，即含有Spe I和EcoR I酶切位點引物，具體包括： CX - Spe I - F:GACTAGTGCCGCCGTCCCCTGCACCGTGGA CX - EcoR I - R:GGAATTCTCACGACACCGGCGGGTAGGCGT〇
5. 根據權利要求3所述的方法，其特征是，所述的PCR擴增的條件為：98°C預變性 3min ;98°C變性10s，68°C延伸45s ;30個循環后68°C終延伸3min。
6. 根據權利要求3所述的方法，其特征是，所述的大腸桿菌表達菌株為 Transetta(DE3)大腸桿菌。
7. -種根據上述任一權利要求所述的外切葡聚糖酶的工程菌的應用，其特征在于，將 其用于外切葡聚糖酶的體外高效表達，并用于外切葡聚糖酶的規模化發酵生產。
【文檔編號】C12N15/70GK104232558SQ201410462541
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月12日 優先權日:2014年9月12日
【發明者】周培, 馮海瑋, 支月娥, 孫玉靜, 羅艷青 申請人:上海交通大學