基于木糖苷酶的工程菌及其實現方法
【專利摘要】一種基因工程領域的木糖苷酶的工程菌，以灰略紅鏈霉菌基因組DNA為模板，與含有酶切位點和聚組氨酸標簽的引物進行PCR擴增得到編碼木糖苷酶的核苷酸序列；然后將擴增得到的基因序列連接到表達載體，再將獲得的連接產物轉入大腸桿菌表達菌株內，獲得木糖苷酶過表達重組菌株。本發明針對現有技術存在的由于木糖苷酶在生物體內多為胞內酶且表達量較低導致的應用范圍和效果嚴重受限等不足，應用基因工程手段實現其體外的大量表達合成，此外本發明通過在表達重組蛋白C端添加聚組氨酸標簽的方法，提高蛋白活性的同時也保證了純化后木糖苷酶的純度；此外，本發明通過載體信號肽實現了目的蛋白的周質空間表達，提高了木糖苷酶的活性。
CGMCC NO.5706
2012.01.09
【專利說明】基于木糖苷酶的工程菌及其實現方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及的是一種生物基因工程【技術領域】的基因及其工程菌株，具體是一種灰 略紅鏈霉菌的基于木糖苷酶的工程菌及其實現方法。
【背景技術】
[0002] 木質纖維素是植物界中最為豐富的天然高分子化合物，是植物通過光合作用產生 的主要干物質，主要包括纖維素、半纖維素和木質素。木質纖維素的生物降解和解聚作用是 一個高度復雜的過程，它涉及眾多酶系的參與。
[0003] 木質纖維素中的半纖維素組分是由幾種不同類型的單糖構成的異質多聚體，這些 糖是五碳糖和六碳糖，包括木糖、阿伯糖、甘露糖和半乳糖等。半纖維素主要分為三類：聚木 糖類、聚葡萄甘露糖類和聚半乳糖葡萄甘露糖類，其中聚木糖類是以1，4 - β -D -吡喃型木 糖構成主鏈，以4 -氧甲基-吡喃型葡萄糖醛酸為支鏈的多糖；聚葡萄甘露糖類是由D -吡 喃型葡萄糖基和吡喃型甘露糖基以1，4 - β型連接成主鏈；另一類聚半乳糖葡萄甘露糖類 則還有D -吡喃型半乳糖基用支鏈的形式以1，6 - α型連接到此主鏈上的若干D -吡喃型 甘露糖基和D -吡喃型葡萄糖基上。半纖維素的主要降解酶有內切-β - 1，4 -木聚糖酶 (Endo - β - 1，4 - xylanases)和 β - 1，4 -木糖苷酶（β - 1，4 - xylosidase)，其中木糖苷 酶主要催化水解木糖苷和以外切方式從非還原性末端水解木二糖及木二糖以上的低聚木 糖，水解產物為木糖。因此，木糖苷酶在半纖維素徹底水解過程中起十分關鍵的作用。
[0004] 木糖苷酶在自然界分布非常廣泛，現已從細菌、真菌（包括酵母）等微生物和高等 植物中分離得到。與真核生物木糖苷酶基因相比，細菌木糖苷酶基因具有不含內含子、易克 隆、易表達及種類多等優勢。其中灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens)是一種常 見的土壤細菌。然而之前鏈霉菌研究重點集中在如何改造其代謝途徑以提高抗生素的發酵 產量，對其基因組內其他功能基因的開發和利用還相對不足。
[0005] 與大多數細菌相比，鏈霉菌具有較為復雜的生長分化機制，對大分子多糖物質如 半纖維素有很強的分解利用能力。因此，研究鏈霉菌對半纖維素的分解利用機制，發掘全新 的半纖維素酶基因序列并通過基因工程手段實現目的基因進行外源表達，對新型半纖維素 酶制劑的開發乃至生產具有重大意義。
[0006] 經過對現有技術的檢索發現：中國專利文獻號CN101429518公開（公告）日 2009. 05. 13，公開了一種耐高溫木糖苷酶XynB2和編碼該酶的基因與應用，該技術由嗜熱 脫氮芽抱桿菌（Geobacillus thermodenitrificans)NG80 -2基因組DNA借助PCR擴增而得 到的木糖苷酶XynB2構建表達載體在大腸桿菌中表達出該基因編碼的重組木糖苷酶。該酶 的最適反應溫度為65°C，最適反應pH為6. 0,在偏酸性環境中熱穩定性好。適合分解寡聚 木聚糖產生木糖。但該技術所得到的重組木糖苷酶的環境適宜能力依舊難以滿足現有工業 需要。
【發明內容】
[0007] 本發明針對現有技術存在的由于木糖苷酶在生物體內多為胞內酶且表達量較低 導致的應用范圍和效果嚴重受限等不足，提出一種基于木糖苷酶的工程菌及其實現方法， 能夠應用基因工程手段實現其體外的大量表達合成，此外本發明通過在重組蛋白添加聚組 氨酸標簽的方法，方便了后期蛋白的純化，所得到的木糖苷酶除對高溫（最適反應溫度為 50°C )具有將強的耐受能力外，還可在堿性環境（pH 8.0 - 12.0)下維持穩定的酶學活性， 具有廣泛的工業用途。。
[0008] 本發明是通過以下技術方案實現的：
[0009] 本發明涉及一種木糖苷酶的工程菌，該工程菌為外源表達木糖苷酶的大腸桿菌。
[0010] 所述的胞內木糖苷酶具體為灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1 木糖苷酶編碼基因，即木糖苷酶SG - X0的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，該核苷酸序列 為1518bp，共編碼505個氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0011] 所述的木糖苷酶編碼基因通過全基因組測序和PCR擴增的方式克隆獲得。
[0012] 所述的灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1，現保藏于中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，保藏編號為CGMCC No. 5706,保藏日期為 2012年1月9日，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所 郵編 100101。
[0013] 本發明涉及上述工程菌的實現方法，以灰略紅鏈霉菌基因組DNA為模板，與含有 酶切位點和聚組氨酸（HIS 6 · Tag)標簽的引物進行PCR擴增得到編碼木糖苷酶的核苷酸序 列SG -X0 ;然后將擴增得到的基因序列連接到表達載體pET -22b(+)，再將獲得的連接產物 轉入大腸桿菌表達菌株內，獲得木糖苷酶過表達重組菌株。
[0014] 所述的含有酶切位點和聚組氨酸標簽的引物，即含有Msc I和EcoR I酶切位點引 物具體包括：
[0015] X0 - Msc I - F:GATGGCCATGGTGATCCACGTGCCCGCGGAGCC
[0016] X0 - EcoR I - R:GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGTGCCGTGTCCCGGCCGAGCA
[0017] 所述的PCR擴增的條件為：98°C預變性3min ;98°C變性10s，68°C延伸45s ;30個 循環后68°C終延伸3min。
[0018] 所述的大腸桿菌表達菌株為Transetta(DE3)大腸桿菌。
[0019] 本發明涉及一種木糖苷酶的工程菌的應用，將其用于木糖苷酶的體外高效表達， 并將木糖苷酶用于木糖的工業發酵生產。 技術效果
[0020] 現有木糖苷酶在灰略紅鏈霉菌內為胞內酶且表達量很低，因此嚴重限制了其使用 范圍和效果；與現有技術相比，本發明提供了一種全新的木糖苷酶基因序列；通過構建外 源表達載體，實現了木糖苷酶的外源高效表達，并通過在表達重組蛋白C端添加聚組氨酸 標簽（HIS 6 · Tag)的方法，提高蛋白活性的同時也保證了純化后木糖苷酶的純度；此外，本 發明通過載體信號肽實現了目的蛋白的周質空間表達，提高了木糖苷酶的活性；所述的木 糖苷酶在如高溫及堿性的特殊條件下具有更穩定的酶學特性。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021] 圖1為灰略紅鏈霉菌木糖苷酶信號肽預測圖。
[0022] 圖2為灰略紅鏈霉菌木糖苷酶在不同碳源誘導下表達量示意圖。
[0023] 圖3為重組木糖苷酶（HIS6 · Tag)體外表達SDS - PAGE驗證圖。
[0024] 圖4為重組木糖苷酶（HIS6 · Tag)在不同pH下相對酶活性示意圖。
[0025] 圖5為重組木糖苷酶（HIS6 · Tag)在不同溫度下相對酶活性示意圖。
【具體實施方式】
[0026] 下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施 例。 實施例1
[0027] 本實施例包括以下步驟：
[0028] 步驟1)灰略紅鏈霉菌的分離及培養
[0029] 灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens)分離自上海市浦江鎮收集的腐爛結 桿，保藏編號為CGMCC No. 5706。將該菌種接種于LB液體培養基，32°C培養48h。
[0030] 上述LB液體培養基組分為：蛋白胨10. Og/L，酵母提取物5. Og/L，NaCl 10. Og/L， pH6. 8 - 7. 2。在液體培養基中加入15. 0 - 20. 0g/L瓊脂即得LB固體培養基。
[0031] 步驟2)灰略紅鏈霉菌基因組DNA提取
[0032] 收集2. OmL菌液，12000rpm離心2min。棄上清，收集菌體沉淀，加入180 μ L溶菌酶 (20mg/mL)和20yL EDTA溶液（0.5M，pH 8.0)，37°C處理45min，加入4yL RNase A(100mg/ mL)，震蕩混勻15s，室溫放置5min，隨后按照細菌DNA提取試劑盒（TIANGEN)操作說明完成 剩余操作，得到高純度基因組DNA。通過0. 8%瓊脂糖凝膠電泳確定基因組DNA質量，確保 無明顯RNA條帶，基因組條帶清洗、完整、無降解、無污染。
[0033] 步驟3)灰略紅鏈霉菌基因組測序
[0034] 確定全基因組鳥槍法（WGS)策略，采用第二代測序技術，構建不同插入片段長度 的文庫，采用Mise q(2X250bp)平臺進行測序。收集測序的原始數據，對帶接頭、低質量的 數據進行過濾，隨后采用Newbler version 2. 8對去除接頭的測序數據進行從頭拼接，構建 contigs及scaffolds,最后使用GapCloser程序進行缺口填補得到鏈霉菌基因組草圖。
[0035] 步驟4)蛋白編碼基因功能預測
[0036] 采用Glimmer 3. 0軟件對全基因組序列進行基因預測。基因預測模型選取自我訓 練基因預測模型，即提取拼裝序列中最長的序列，以該序列作為基因預測模型訓練的序列。 然后以該序列構建的基因預測模型，對所有序列進行基因預測，設定開放閱讀框的長度為 ll〇bp，其余參數為Glimmer 3. 0的默認設置。
[0037] 步驟5)木糖苷酶膜定位預測
[0038] 采用SignalP 4. 1分別對木糖苷酶氨基酸序列進行信號肽模擬預測，如圖1所示。 結果表明木糖苷酶不存在明顯的信號肽序列，推測該酶為胞內酶。
[0039] 步驟6)灰略紅鏈霉菌總RNA的提取
[0040] 將鏈霉菌JSD -1接種于以水稻秸桿（纖維素、木聚糖、果膠、木質素或葡萄糖）為 唯一碳源的無機鹽培養基，32°C、150rpm條件下培養72h。離心收集菌體沉淀，并按細菌總 RNA提取試劑盒要求（TIANGEN)提取高純度的鏈霉菌總RNA。
[0041] 上述無機鹽培養基組分為：KN032. Og/L，KH2P041. Og/L，NaCl 0. 5g/L，MgS04 · 7H20 0. 5g/L，CaCl2 · 2H200. lg/L，FeS04 · 7H20 0. 01g/L，水稻秸桿（纖維素、木聚糖、果膠、木質 素或葡萄糖）10. 〇g/L。
[0042] 步驟7)灰略紅鏈霉菌木糖苷酶表達水平測定
[0043] 根據木糖苷酶基因序列，通過DNAMAN 6.0軟件設計特異性PCR引物，引物序列如 下：
[0044] X0 - F:CCACGCCGACTCCTTCTCCT
[0045] X0 - R:GGTGGTAGGTGGGTTTGCGG
[0046] 同樣的，根據16S rRNA的特異性序列設計引物，并作為內參基因，引物序列如下：
[0047] 16S rRNA - F:CGTATTCACCGCAGCAATGC
[0048] 16S rRNA - R:GCGAGGTGGAGCGAATCTCA
[0049] 以鏈霉菌總RNA模板進行反轉錄獲得cDNA文庫，并按照熒光定量PCR試劑盒 (TaKaRa)要求進行相關操作。設置三個重復，待實驗完成收集處理數據，分析在不同碳源誘 導作用下，木糖苷酶的表達量（如圖2)。結果表明，當以水稻秸桿與木聚糖為碳源進行誘導 時，該木糖苷酶的表達量顯著上調，證明該酶參與半纖維素的代謝過程。
[0050] 上述的熒光定量PCR的反應條件為：95°C預變性30s ;95°C變性10s，60°C退火 30s，72°C延伸15s，共40個循環。
[0051] 步驟8)木糖苷酶表達載體構建
[0052] 根據木糖苷酶基因序列，設計含有酶切位點和聚組氨酸（HIS6 · Tag)標簽的引物 如下：
[0053] X0 - Msc I - F:GATGGCCATGGTGATCCACGTGCCCGCGGAGCC
[0054] X0 - EcoR I - R:GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGTGCCGTGTCCCGGCCGAGCA
[0055] 以灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens)基因組DNA為模板，用含有Msc I和EcoR I酶切位點引物進行PCR擴增獲得木糖苷酶基因序列，使用DNA A-Tailing Kit 加 A后連接到T - Vector PMDTM 19 -T (TaKaRa)，并將連接產物轉入DH5 α大腸桿菌內。挑 選陽性克隆，搖菌提取質粒測序。Msc I和EcoR I進行雙酶切（37°C )，回收木糖苷酶DNA 片段X0。用相同內切酶酶切表達載體pET-22b(+)并回收載體DNA片段。將X0與載體片 段混合，T4DNA Ligase(TaKaRa)過夜連接（16°C )，將連接產物轉入DH5a大腸桿菌感受態 細胞內，通過抗性平板及菌落PCR篩選含有目的基因的表達載體的陽性克隆。挑取陽性克 隆接種于含有氨芐青霉素（1〇〇 μ g/mL)的LB液體培養基中，180rpm、37°C培養16小時后提 取質粒。
[0056] 上述PCR擴增條件為：98°C預變性3min ;98°C變性10s，68°C延伸45s ;30個循環 后68°C終延伸3min。
[0057] 步驟9)木糖苷酶過表達轉基因菌株的構建
[0058] 將上述表達載體轉入Transetta(DE3)大腸桿菌，在含有氨節青霉素（100 μ g/mL) 和氯霉素（34 μ g/mL)的LB固體培養基上篩選，獲得木糖苷酶過表達菌株。
[0059] 上述的Transetta(DE3)具有以下特征：該菌株具有氯霉素（Camr)，且含有大腸桿 菌缺乏的6種稀有密碼子（AGA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA)對應的tRNA，可有效提高外源基 因，尤其是真核生物及鏈霉菌等高GC含量生物基因在原核系統中的表達水平。
[0060] 步驟10)重組木糖苷酶的外源高效表達
[0061] 挑取陽性克隆于含有氨芐青霉素（100 μ g/mL)和氯霉素（34 μ g/mL)的LB液體培 養基中，在32°C震蕩培養，當0D_達到0. 6 - 0. 8時，加入IPTG溶液使培養液IPTG濃度達 到50 μ M，25°C繼續培養16小時進行誘導表達。誘導表達培養好的發酵液離心收集菌體，利 用破胞緩沖液洗滌菌體一次，再利用1/10發酵液體積的磷酸鹽緩沖液重懸菌體后在冰浴 條件下利用超聲波破胞至菌液澄清，13000rpm/min離心15min收集上清，上清液即為木糖 苷酶的粗酶液。
[0062] 重組木糖苷酶的SDS - PAGE驗證
[0063] 制備 12% SDS -PAGE 膠，將粗酶液與 5XSDS -PAGE Loading Buffer 比例混合，與 沸水浴5min，每個點樣孔上樣20 μ L，在160V電壓下電泳60 - 70min，直至溴酚藍指示條帶 完全跑出膠。停止電泳，用考馬斯亮藍R - 250溶液染色20min，然后用脫色液進行洗滌，直 至背景色完全脫去，條帶清晰可見（如圖3)。
[0064] 所述的12% SDS - PAGE是由濃縮膠與分離膠構成的，其組分分別為：
[0065] 分離膠：蒸餾水 1. 6mL，30%丙烯酰胺溶液 2. OmL，1. 5M Tris -HC1 (pH 8. 8) 1. 3mL， 10% 過硫酸銨（APS)O. 05mL，10% SDS 溶液 0· 05mL，TEMED 0· 002mL ;
[0066] 濃縮膠：蒸餾水 0· 68mL，30 % 丙烯酰胺溶液 0· 17mL，1. 0M Tris - HC1 (pH 6. 8)0. 13mL，10%過硫酸銨（APS)O. OlmL，10% SDS 溶液 0· OlmL，TEMED 0· OOlmL ;
[0067] 所述的 5XSDS - PAGE Loading Buffer 組分為：1M Tris - HC1 (pH 6. 8) 1. 25mL， SDS 0· 5g，溴酚藍25mg，甘油2. 5mL，去離子水定容至5mL。小份分裝（500 μ L)后與室溫保 存，使用前每小份加入β -巰基乙醇25 μ L。
[0068] 所述的考馬斯亮藍R - 250溶液組分為：考馬斯亮藍R - 2501g，異丙醇250mL，冰醋 酸100mL，去離子水650mL。
[0069] 所述的脫色液組分為：冰醋酸100mL、無水乙醇50mL、去離子水850mL。
[0070] 不同條件下木聚糖的酶學特性測定
[0071] 木糖苷酶活性是指由從底物對硝基苯酚-β - D -木糖苷釋放出對硝基苯酚的量 來確定的。測定體系總體積為800 μ L，反應體系為200 μ L，內含10 μ L 20mM底物硝基苯 酚-β - D-木糖苷、185yL lOOmM pH 6. 0的鄰苯二甲酸氫鉀-咪哇緩沖液、5yL適量稀 釋粗酶液，于65°C反應5min，然后加入600 μ L 1M的Na2C03溶液終止反應并顯色，在405nm 處測定光吸收值的增加量。一個酶活單位定義為：在該反應條件下，lmin內催化產生1 μ Μ 的對硝基苯酚所需要的酶量。
[0072] 采用上述方法測定在不同溫度（20°C _80°C )及ρΗ(3. 0 -12. 0)下，木糖苷酶粗酶 液的活性。測定結果表明（圖4和圖5)，木聚糖酶在pH 8. 0和50°C下，具有最大酶活性， 說明該木糖苷酶在高溫和堿性條件下依然可以維持較為穩定的生物學活性。
【權利要求】
1. 一種木糖苷酶的工程菌，其特征在于，該工程菌為外源表達木糖苷酶的大腸桿菌； 所述的胞內木糖苷酶具體為灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens)JSD-l木 糖苷酶編碼基因，即木糖苷酶SG-X0的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，該核苷酸序列為 1518bp，共編碼505個氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
2. 根據權利要求1所述的工程菌，其特征是，所述的灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1，現保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (CGMCC)，保藏編號為CGMCC No. 5706,保藏日期為2012年1月9日。
3. -種根據權利要求1或2中所述的工程菌的實現方法，其特征在于，以灰略紅鏈霉菌 基因組DNA為模板，與含有酶切位點和聚組氨酸標簽的引物進行PCR擴增得到編碼木糖苷 酶的核苷酸序列SG -X0 ;然后將擴增得到的基因序列連接到表達載體pET - 22b (+)，再將獲 得的連接產物轉入大腸桿菌表達菌株內，獲得木糖苷酶過表達重組菌株。
4. 根據權利要求3所述的方法，其特征是，所述的含有酶切位點和聚組氨酸標簽的引 物，即含有Msc I和EcoR I酶切位點引物具體包括： X0 - Msc I - F:GATGGCCATGGTGATCCACGTGCCCGCGGAGCC XO - EcoR I - R:GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGTGCCGTGTCCCGGCCGAGCA。
5. 根據權利要求3所述的方法，其特征是，所述的PCR擴增的條件為：98°C預變性 3min ;98°C變性10s，68°C延伸45s ;30個循環后68°C終延伸3min。
6. 根據權利要求3所述的方法，其特征是，所述的大腸桿菌表達菌株為 Transetta(DE3)大腸桿菌。
7. -種根據上述任一權利要求所述的木糖苷酶的工程菌的應用，其特征在于，將其用 于木糖苷酶的體外高效表達，并將木糖苷酶用于木糖的工業發酵生產。
【文檔編號】C12N9/42GK104232554SQ201410462373
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月12日 優先權日:2014年9月12日
【發明者】周培, 馮海瑋, 孫玉靜, 支月娥, 羅艷青 申請人:上海交通大學