一種利用黃單胞菌聯產α-熊果苷和黃原膠的方法
【專利摘要】本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及利用野油菜黃單胞菌發酵液離心或微濾膜過濾后的菌體和上清酶液，分別采取游離細胞法催化合成α-熊果苷和無細胞發酵黃原膠的方法。本發明包括野油菜黃單胞菌斜面種子的制備和一級液體發酵，以蔗糖和對苯二酚為底物利用游離細胞法催化合成α-熊果苷，無細胞發酵生產黃原膠。該方法合成α-熊果苷的轉化率達到75~90%，對苯二酚耐受度提高到50~67mmol/L；無細胞法產黃原膠產量達到10.0~20.0g/L，粘度4500~5380mPa·s。該方法具有酶活性高、條件易控、易于產物分離等優點。
CGMCC No.1243
20041108
【專利說明】一種利用黃單胞菌聯產0-熊果苷和黃原膠的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及利用野油菜黃單胞菌^/7^^5)06100勵.1243發酵液離心或微濾膜過濾后的菌體和上清酶液，分別采取游離細胞法催化合成0 ~熊果苷和無細胞發酵黃原膠的方法。
【背景技術】
[0002]熊果苷(八士機化)是杜鵑花科熊果屬的熊果葉子細胞里的一種成分，具有良好的皮膚美白效果，化妝品行業中用途很廣。研究表明0-熊果苷的化學性質比型更加穩定，美白效果更好，且對人體細胞的副作用更小。現在0-熊果苷的合成方法也多是通過微生物發酵添加底物來進行。
[0003]黃原膠08111:11811即111)是一種高分子胞外多糖，大多是由野油菜黃單胞菌、叉冊1±0皿138 031111)681:1-13)發酵產生。黃原膠具有特殊的三級螺旋分子結構，使其具有良好的水溶性、假塑性，常被用來做乳化劑、增稠劑等，已廣泛用于食品、石油、地質、醫藥、農藥、輕工業、印染、陶瓷等工業領域，有著很大的市場潛力。
[0004]前人對于黃單胞菌催化生產-熊果苷和生產黃原膠兩個方向分別有一定的研究。許喜林等利用離心方法得到除細胞發酵液，加入培養基后得到的黃原膠產量較一般方法略高，證明這種方法的可行性。王秀捧等探究了游離細胞法產0-熊果苷的條件，其轉化率約為80%，但是對苯二酚耐受度較低，只有30臟01凡。游離細胞法和無細胞發酵都有著各自的優點:游離細胞有著酶活性高的特點，反應條件容易控制，也利于熊果苷分離純化，但由于缺少黃原膠的保護，對對苯二酚的耐受度偏低。無細胞發酵的好處是對于氧氣的需求量較小，在分離純化中也更容易得到產品，降低物料消耗。但由于排出胞外的酶量小，酶促反應要求高，使得到的黃原膠在產量和粘度這兩個重要指標上都低于細胞發酵的水平。但利用同一菌種聯產兩種產物的研究至今未見報道。
[0005]本發明采用同一菌種，利用創新的聯產方式，在兩種產品的生產中分別采用游離細胞和無細胞發酵的方法，以期達到最大的產出比和最小的能源消耗。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種利用黃單胞菌聯產0 -熊果苷和黃原膠這兩種產物的方法，分別采用游離細胞催化合成0 ~熊果苷、無細胞發酵黃原膠，具有酶活性高、反應條件容易控制、產物易于分離純化的優點。本發明利用同一菌種，經過高速離心或微濾膜過濾處理后分別用于聯產兩種產物，可以達到節約物料、降低成本的目的，帶來較好的經濟效益和社會效益，具有創新性，為工業生產奠定了基礎。
[0007]本發明的整體技術構思是:
利用野油菜黃單胞菌03^681:1~1^0.1243聯產0-熊果苷和黃原膠的方法，該方法由下列工藝步驟組成:
(1)野油菜黃單胞菌03111^681:1~13) 06100 ^0.1243斜面種子的制備和一級液體發酵；
(2)將步驟(1)發酵液高速離心或微濾膜過濾獲得菌體和上清酶液；
(3)游離細胞法合成0-熊果苷；
(4)無細胞發酵生產黃原膠。
[0008]本發明的具體工藝步驟及工藝條件是:
步驟(1)中培養基成分為:
蔗糖15~308凡、牛肉蛋白胨1~108凡、1叻04 - 7！！20 1-10^/1,酵母粉1~108凡、^2！！？04 - 3！！20 1-10^/1,^01 1~108凡、瓊脂5~208凡。(斜面培養基加，液體培養基不加)斜面菌種的制備工藝為:將黃單胞菌接入裝有固體培養基的試管中，制成斜面菌種，在20~351條件下培養12~48小時。
[0009]一級液體發酵的制備工藝為:將斜面生長的黃單胞菌用滅菌后的生理鹽水溶解后，接種到501111液體培養基中，接種量為1%~10%，在20~35。匕100~20017111111的搖床中培養，米用好氧培養的方式培養12~48小時。
[0010]步驟(2)中高速離心:
將步驟(1)發酵液在5000~2000017111111條件下高速離心10~30111111，或者采用
0.201^11-0.45她微濾膜過濾收集菌體和上清酶液。
[0011]步驟(3)中游離細胞法合成0 -熊果苷具體工藝為:
收集離心后的菌體，在磷酸緩沖溶液中添加明膠和抗壞血酸，添加量分別為1~10%和0.1-2.08/1，洗滌菌體形成均勻的菌液，加入蔗糖和對苯二酚作為反應底物，在溫度20~351條件下反應12~48小時。
[0012]步驟(4)中無細胞發酵生產黃原膠具體工藝為:
離心上清酶液加入到等體積產膠培養基，溫度為15-351，培養15-45小時。
[0013]產膠培養基成分為:蔗糖10~308凡，酵母膏0.08^/1, 0^03 1-5^/1, %804 1.2^/
1,狃2？040.5^/1,1(01 5~308凡、檸檬酸 0.01^/1,邱6.0-8.0。
[0014]本發明所用的野油菜黃單胞菌03111^681:1~1 ^)06100勵.1243已經在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏地址為北京市海淀區中關村北一條13號中國科學院微生物研究所(100080),保藏號為野油菜黃單胞菌勵.1243，保藏時間為2004年11月8日。
[0015]本發明所取得的技術進步在于:
利用本發明聯產熊果苷和黃原膠的方法具有以下優點:
(1)本發明采用的游離細胞催化生產熊果苷的方法，具有酶活性高的特點，反應條件容易控制，產物純度高、熊果苷易于分離純化。
[0016](2)本發明有效降低了游離細胞緩沖液中對苯二酚對菌體的毒害作用，添加的水溶性高分子和抗氧化劑大幅提高了合成反應轉化率。
[0017](3)本發明采用的無細胞發酵黃原膠的方法，對于氧氣的需求量較小，解決了由于黃原膠的高粘度導致的產物難以分離的問題，降低物料消耗。
[0018](4)本發明利用創新的聯產方式，使用同一菌種，在兩種產品的生產中分別采用游離細胞和無細胞發酵的方法，以期達到最大的產出比和最小的能源消耗。
[0019]實施例:以下結合實施例對本發明作進一步描述。
[0020]實施例1
(1)野油菜黃單胞菌斜面種子的制備和一級液體發酵:
蔗糖 25g/L、牛肉蛋白胨 6.0g/L、MgS04.7H20 1.0g/L、酵母粉 2.5g/L、Κ2ΗΡ04.3H202.0g/L、NaCl 2.0g/L、瓊脂15g/L。(斜面培養基加，液體培養基不加)
斜面菌種的制備工藝為:將黃單胞菌接入裝有固體培養基的試管中，制成斜面菌種，在25°C條件下培養24小時。
[0021]一級液體發酵的制備工藝為:將斜面生長的黃單胞菌用滅菌后的生理鹽水溶解后，接種到50ml液體培養基中，接種量為2%，在28°C、150r/min的搖床中培養，采用好氧培養的方式培養12小時。
[0022](2)將步驟(1)發酵液高速離心獲得菌體和上清酶液:
將步驟(1)發酵液在15000r/min條件下高速離心30min,收集菌體和上清酶液。
[0023]( 3 )游離細胞法合成α -熊果苷:
收集離心后的菌體，在磷酸緩沖溶液中添加明膠和抗壞血酸，添加量分別為2%和
0.lg/L，洗滌菌體形成均勻的菌液，加入蔗糖和對苯二酚作為反應底物，在溫度22°C條件下反應48小時。在此反應條件下，α -熊果苷轉化率為75.43%，對苯二酚耐受度為37mmol/L0
[0024](4)無細胞發酵生產黃原膠:
離心上清酶液加入到等體積產膠培養基，溫度為15-35°C，培養15-45小時。黃原膠產量達到 12.4g/L，粘度 4520 mPa.s。
[0025]產膠培養基成分為:蔗糖10g/L，酵母膏 0.08g/L, CaC03 1.0g/L, MgS04 1.2g/L，KH2P04 0.5g/L, KC1 10g/L、檸檬酸 0.01g/L，pH7.5。
[0026]實施例2
(1)野油菜黃單胞菌斜面種子的制備和一級液體發酵:
蔗糖258/1、牛肉蛋白胨6.(^/1、1%504*7!120 1.0g/L、酵母粉 2.5g/L、Κ2ΗΡ04.3H202.0g/L、NaCl 2.0g/L、瓊脂15g/L。(斜面培養基加，液體培養基不加)
斜面菌種的制備工藝為:將黃單胞菌接入裝有固體培養基的試管中，制成斜面菌種，在25°C條件下培養24小時。
[0027]一級液體發酵的制備工藝為:將斜面生長的黃單胞菌用滅菌后的生理鹽水溶解后，接種到50ml液體培養基中，接種量為2%，在28°C、150r/min的搖床中培養，采用好氧培養的方式培養10小時。
[0028](2)將步驟(1)發酵液微濾膜過濾獲得菌體和上清酶液:
將步驟(1)發酵液使用0.20Mm微濾膜過濾，收集菌體和上清酶液。
[0029](3)游離細胞法合成α -熊果苷:
收集過濾后的菌體，在磷酸緩沖溶液中添加明膠和抗壞血酸，添加量分別為6%和
0.4g/L，洗滌菌體形成均勻的菌液，加入蔗糖和對苯二酚作為反應底物，在溫度22°C條件下反應48小時。在此反應條件下，α -熊果苷轉化率為90%，對苯二酚耐受度為40mmol/L。
[0030](4)無細胞發酵生產黃原膠:
離心上清酶液加入到等體積產膠培養基，溫度為32°C，培養36小時。黃原膠產量達到13.6g/L，粘度 5120 mPa.s。
[0031]產膠培養基成分為:蔗糖10g/L，酵母膏 0.08g/L, CaC03 3.0g/L, MgS04 1.2g/L，KH2P04 0.5g/L, KC1 5g/L、檸檬酸 0.01g/L，pH7.5。
[0032]實施例3
(1)野油菜黃單胞菌斜面種子的制備和一級液體發酵:
蔗糖258/1、牛肉蛋白胨6.(^/1、1%504*7!120 1.0g/L、酵母粉 2.5g/L、Κ2ΗΡ04.3H202.0g/L、NaCl 2.0g/L、瓊脂15g/L。(斜面培養基加，液體培養基不加)
斜面菌種的制備工藝為:將黃單胞菌接入裝有固體培養基的試管中，制成斜面菌種，在25°C條件下培養24小時。
[0033]一級液體發酵的制備工藝為:將斜面生長的黃單胞菌用滅菌后的生理鹽水溶解后，接種到50ml液體培養基中，接種量為2%，在28°C、150r/min的搖床中培養，采用好氧培養的方式培養14小時。
[0034](2)將步驟(1)發酵液微濾膜過濾獲得菌體和上清酶液:
將步驟(1)發酵液使用0.45Mm微濾膜過濾，收集菌體和上清酶液。
[0035]( 3 )游離細胞法合成α -熊果苷:
收集過濾后的菌體，在磷酸緩沖溶液中添加明膠和抗壞血酸，添加量分別為8%和
1.0g/L，洗滌菌體形成均勻的菌液，加入蔗糖和對苯二酚作為反應底物，在溫度24°C條件下反應48小時。在此反應條件下，α -熊果苷轉化率為80%，對苯二酚耐受度為67mmol/L。
[0036](4)無細胞發酵生產黃原膠:
離心上清酶液加入到等體積產膠培養基，溫度為32°C，培養36小時。黃原膠產量達到20g/L，粘度 5380 mPa.s。
[0037]產膠培養基成分為:蔗糖10g/L，酵母膏 0.08g/L, CaC03 5.0g/L, MgS04 1.2g/L，KH2P04 0.5g/L, KC1 15g/L、檸檬酸 0.01g/L，pH7.5。
【權利要求】
1.一種利用黃單胞菌聯產α-熊果苷和黃原膠的方法，其特征為:利用野油菜黃單胞菌(Za/?iAofflmas campestris) CGMCC N0.1243液體發酵液高速離心或微濾膜過濾后的菌體和上清酶液，分別使用游離細胞法合成α -熊果苷和無細胞發酵生產黃原膠，達到使用同一菌種聯產兩種產物的目的；游離細胞法合成α-熊果苷的轉化率達到75~90%，對苯二酚耐受度提高到50~67mmol/L ;無細胞法產黃原膠產量達到10.0-20.0g/L,粘度4500~5380mPa.S。
2.如權利要求1所述利用黃單胞菌聯產α-熊果苷和黃原膠的方法，其特征在于:其制備流程為:野油菜黃單胞菌campestris) CGMCC N0.1243斜面種子的制備和一級液體發酵；將步驟(I)發酵液高速離心或微濾膜過濾獲得菌體和上清酶液； 游離細胞法合成α -熊果苷；無細胞發酵生產黃原膠。
3.如權利要求2所述利用黃單胞菌聯產α-熊果苷和黃原膠的方法，其特征在于:所述(I)步驟中的培養基成分為蔗糖15~30g/L、牛肉蛋白胨l~10g/L、MgSO4.7H20 l~10g/L、酵母粉 l~10g/L、K2HPO4.3H20 l~10g/L、NaCl l~10g/L、瓊脂 5~20g/L。
4.根據權利要求2所述利用黃單胞菌聯產α-熊果苷和黃原膠的方法，其特征在于:所述(3)步驟中的游離細胞法合成α-熊果苷具體為:用磷酸緩沖溶液洗滌收集的菌體形成均勻的菌液，加入蔗糖和對苯二酚作為反應底物，催化合成α-熊果苷；反應條件為15~30°C、搖床轉速100~200r/min，反應時間12~60小時。
5.根據權利要求2所述利用黃單胞菌聯產α-熊果苷和黃原膠的方法，其特征在于:所述(3)步驟中的磷酸緩沖液需要添加明膠、聚乙烯醇、海藻酸鈉、聚丙烯酰胺和抗壞血酸、維生素Ε，添加量分別為1~10%和0.1-2.0g/L。
6.根據權利要求2所述利用黃單胞菌聯產α-熊果苷和黃原膠的方法，其特征在于:所述(4)步驟中的無細胞發酵生產黃原膠具體為:離心上清酶液加入到等體積產膠培養基，溫度為15-35°C，培養15-45小時。
7.根據權利要求2所述利用黃單胞菌聯產α-熊果苷和黃原膠的方法，其特征在于:所述(4)步驟中的產膠培養基成分為:蔗糖10~30g/L，酵母膏0.08g/L, CaCO3 l~5g/L,MgSO41.2g/L, KH2PO4 0.5g/L, KCl 5~30g/L、檸檬酸 0.0lg/L, pH6.0-8.0。
8.野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris ) CGMCC N0.1243。
【文檔編號】C12P19/44GK104498565SQ201410458385
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年9月11日 優先權日:2014年9月11日
【發明者】張鵬, 趙磊, 周建飛, 劉春巧, 陳毅明, 張俊 申請人:北京化工大學