一種稀磷酸結合汽爆預處理改進木質纖維酶解糖化的方法
【專利摘要】本發明公開了一種稀磷酸結合汽爆預處理改進木質纖維酶解糖化的方法，利用黑曲霉C112進行液體發酵生產β-葡萄糖苷酶，在一定培養條件下，所得β-葡萄糖苷酶酶活力可達15.496IU/ml。將黑曲霉C112生產的β-葡萄糖苷酶與里氏木霉RUT C30生產的纖維素酶進行酶系復合，制備出高活性復合纖維素酶，用于處理經稀磷酸浸漬蒸汽爆破處理后的木質纖維酶解糖化率可達到80％以上，同步糖化共發酵乙醇得率達到83.191％。
CCTCC NO: M 2012129
2012.04.23
【專利說明】一種稀磷酸結合汽爆預處理改進木質纖維酶解糖化的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物化工及生物能源【技術領域】，具體涉及一種稀磷酸結合汽爆預處理 改進木質纖維酶解糖化的方法。
【背景技術】
[0002] 纖維素酶是指能降解纖維素的一類多組分復合酶系的總稱，主要包括三個酶組 分：內切型-β -葡聚糖酶（exd〇-l，4_0 -D_glucanase，EG)、外切型-β -葡聚糖酶（exo-1， 4-3_D-glucanase，CHB)和β-葡萄糖苷酶（0_glucosidase，BG)。纖維素酶的作用機理 是EG先降解纖維素分子內部的非結晶區形成新的游離末端；然后由CHB作用于纖維素線狀 分子非還原性末端水解β-1，4-糖苷鍵形成纖維二糖；最后由BG水解纖維二糖為2個葡萄 糖。
[0003] 在纖維素的酶解糖化過程中，若BG型酶不能有效的酶解纖維二糖，將會對EG酶和 CHB酶產生很強的反饋抑制作用，最終限制纖維素的酶解糖化率。為提高纖維素酶的酶解 糖化率，十分有必要通過人工措施制備具有高活性EG、CHB和BG型纖維素酶的復合纖維素 酶。目前公認的能產生高活性EG和CHB型纖維素酶的菌種為里氏木霉，而該菌種所產的BG 型纖維素酶活性較低。目前能產生高活性BG型纖維素酶的菌種為黑曲霉。將黑曲霉生產 的β-葡聚糖苷酶與里氏木霉生產的纖維素酶復合制備出高活性復合纖維素酶，優化酶系 配比，提高木質纖維素的酶解得率，具有重要的現實意義。
[0004] 此外，木質纖維原料是自然界最豐富的生物質原料，主要由纖維素、半纖維素和木 質素構成，分別占干重的38 % -50 %，23 % -32 %，15 % -25 %。纖維素的結晶區、高聚合度、 表面空隙結構以及纖維素、半纖維素與木質素相互粘合形成緊密的交聯結構，均使木質纖 維難以生物降解。因此，運用高效的預處理技術破壞木質纖維原料的天然結構，解除木質素 的包裹作用和降低纖維素與半纖維素的聚合度是高效水解的前提。本發明試圖將稀磷酸結 合蒸汽爆破預處理木質纖維，再結合制備的高活性復合纖維素酶進行發酵。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種采用高活性復合纖維素酶處理稀磷酸結合蒸汽爆破 預處理木質纖維進行發酵的方法。該方法能夠明顯改善酶解效果。
[0006] -種稀磷酸結合汽爆預處理改進木質纖維酶解糖化的方法，稀酸充分浸漬木質 纖維原料后結合蒸汽爆破，然后將爆破物脫毒，最后采用高活性復合纖維素酶進行酶解 發酵；酶解所用的高活性復合纖維素酶的制備方法如下：分別將保藏編號為CCTCC NO: M 2012129的黑曲霉C112生產的β-葡萄糖苷酶與保藏編號為ATCC 56765的里氏木霉 RUT C30生產的纖維素酶濃縮提純，并將濃縮后的酶液混合使得β-葡萄糖苷酶活/濾紙 酶活比值為1.048?2.685 ;黑曲霉Cl 12通過產β-葡萄糖苷酶的培養基得到高活力的 β -葡萄糖苷酶，培養基配方為：玉米芯25?30g/L，稻草粉20?30g/L，蛋白胨5?6g/ L，（NH4)2SO4IO ?13g/L，KH2P046 ?8g/L，CaCl2 · 2H20 0· 5 ?I. Og/L，MgSO4 · 7H20 0· 5 ? I. Og/L，吐溫-801?2ml/L，Mandels微量元素濃縮液0. 5?lml/L，lmol/L朽1檬酸緩沖液 100?150ml/L，加水配制成1L。
[0007] 上述方法優選將濃縮后的酶液混合使得β -葡萄糖苷酶活/濾紙酶活比值為 1.536 ;黑曲霉C112通過產β-葡萄糖苷酶的培養基得到高活力的β-葡萄糖苷酶，培養基 配方為：玉米芯 25g/L，稻草粉 30g/L，蛋白胨 5g/L，（NH4) 2S0410g/L，KH2P046g/L，CaCl 2 ·2Η20 0· 9g/L，MgSO4 · 7Η20 0· 9g/L，吐溫-801ml/L，Mandels 微量元素濃縮液 lml/L，lmol/L 檸檬 酸緩沖液l〇〇ml/L，加水配制成1L。
[0008] 上述方法中黑曲霉C112的產β -葡萄糖苷酶的培養過程如下：將黑曲霉菌C112 的種子培養液，以體積百分比5-8 %的接種量接種于裝有40-60ml產酶培養基的250ml搖瓶 中，26-28°C，180-220r/min條件下培養4-6天，離心，取上清液得到粗酶液。
[0009] 上述方法中黑曲霉C112的種子培養：從保存的黑曲霉C112 土豆固體平板培養基 中挑取孢子，接種于裝有40-60ml種子培養基的250ml搖瓶中，26-28°C，180-220r/min條件 下培養2?3天作為接種物；黑曲霉Cl 12種子培養基：馬鈴薯250?300g/L，葡萄糖15? 25g/L，pH 值 6. 5 ?7. 0。
[0010] 上述方法中黑曲霉Cl 12生產的纖維素酶β-葡萄糖苷酶活為13. 368?15. 496U/ mL，濾紙酶活為0. 183?0. 215IU/mL，經超濾濃縮儀濃縮后，β -葡萄糖苷酶活為18. 793? 24. 741U/mL，濾紙酶活為0. 785?0. 932IU/mL ;里氏木霉RUT C30生產的纖維素酶β-葡萄 糖苷酶活為1. 205?I. 652U/mL，濾紙酶活為5. 931?6. 212IU/mL ;經超濾濃縮儀濃縮后， β -葡萄糖苷酶活為9. 379?12. 662U/mL，濾紙酶活為43. 335?48. 912IU/mL。
[0011] Mandels 微量元素濃縮液配方為：FeSO4 · 7H20 5g/L，MnSO4 · H2O L 6g/L， ZnSO4 · 7H20 I. 4g/L，CoCl2 · 6H20 3. 7g/L，加水配制成 IL ;
[0012] lmol/L 檸檬酸緩沖液的配方為：檸檬酸（C6H8O7 · H2O) 210g，H2O 750ml，加 NaOH 78g，冷卻后測pH為4. 2,加水至1000ml，pH 4. 5。
[0013] 上述方法中所述的稀酸為質量濃度范圍為0.05% -5%的稀磷酸（優選 0. 05% -2% );木質纖維原料與稀磷酸固液質量比為1:1-1:10的范圍浸漬，浸漬時間為固 液混合均勻后l_24h (優選木質纖維原料與稀磷酸固液質量比為1:2-1:5的范圍浸漬，浸 漬時間為固液混合均勻后l_12h);蒸汽爆破壓強為0. 5-3Mpa，保壓時間為：60-240s (優選 蒸汽爆破壓強為0. 5-2. 5Mpa，保壓時間為90-220S，進一步優選蒸汽爆破壓強為2Mpa，保壓 時間為180s。）。此外，爆發速度：0.00875S。蒸汽爆破后采用氨水中和脫毒，具體的工藝 為：先加入檸檬酸緩沖液后，再用氨水調節pH至4. 5-6. 0。優選0. 05mol/L，pH4. 8的檸檬 酸緩沖液結合l_2mol/L氨水中和脫毒。氨水與浸漬磷酸發生酸堿中和反應易生成磷酸氫 銨，利于后續發酵。同時，可達到中和脫毒，調節，穩定PH的目的。
[0014] 收集含水率為82±3%的爆破物，按絕對干重的爆破物與容器總裝載量體積比為 0. 05:1-0. 2:1加入，再加入占容器裝載量體積百分比15-30%的0. 05mol/L檸檬酸緩沖液， 總裝載量占容器體積的2/5-4/5,余量為水，然后加入氨水調節pH值至5. 5±0. 5,以濾紙酶 活FPU為15-30IU/g底物加入所述的高活性復合纖維素酶，50±5°C下酶解24-96h。
[0015] 收集含水率82 ± 3 %的爆破物，按絕對干重的爆破物與容器總裝載量體積比為 0.05:1-0. 2:1加入2. 5-1000L發酵罐中，再加入占發酵罐裝載量體積百分比15-30 %的 0. 05mol/L的檸檬酸緩沖液，總裝載量占容器體積的2/5-4/5,余量為水，再用l-2mol/L 氨水中和脫毒調節 pH 值至 5· 5±0· 5,加入 KH2PO4O. 25-lg/L，CaCl2 · H2O 0· 0· 2-0. 8g/L， MgSO4 ·7Η20 0. 2-0. 8g/L，以濾紙酶活FPU為15-30IU/g底物加入所述的高活性復合纖維素 酶，50±5°C下酶解4-12h后，降溫至37±3°C，加入發酵菌種混合酶解發酵24-96h。
[0016] 所述的發酵菌種優選為釀酒酵母和大腸桿菌K011，添加的細胞干重初始濃度分別 優選為lg/L和0· 33g/L。
[0017] 上述方法中木質纖維原料包括楊樹、桉樹、柳樹在內的速生植物，或者秸桿、刨花、 木屑。
[0018] 上述方法中木質纖維原料粉碎成長寬3-5cm，厚< 5mm的片狀，或直徑長 2-15mm的粒狀。
[0019] 本發明通過大量探索試驗獲得利用黑曲霉產高活性β -葡聚糖苷酶的培養基，將 黑曲霉生產的β-葡聚糖苷酶與里氏木霉生產的纖維素酶復合制備出高活性復合纖維素 酶，優化酶系配比，大大提高木質纖維素的酶解得率，具有重要的現實意義。本發明還采用 稀磷酸與蒸汽爆破結合的方式來處理木質纖維原料，經過氨水中和脫毒后進行酶解發酵。 稀磷酸結合汽爆可明顯降低爆破壓強和縮短保壓時間，同時減少后續發酵培養基中磷元素 的添加量。氨水中和脫毒相比于NaOH和Ca (OH) 2來說比較溫和，這樣可以降低對設備的要 求和減少后續處理工藝，同時稀磷酸浸漬中的磷元素和氨水中的NH 4+生成磷酸氫銨對發酵 具有促進作用。總之，通過對預浸漬工藝，爆破條件和中和脫毒工藝的探索，達到了減少能 耗，縮短生產周期，改善酶解效果，提高乙醇得率，降低成本的效果。
[0020] 本發明的黑曲霉C112Aspergillus niger C112,2012年4月23日保藏于《中國典 型培養物保藏中心》，地址為：中國·武漢·武漢大學，其保藏號為CCTCC Ν0:Μ 2012129。
[0021] 本發明所用里氏木霉RUT C30 (Trichoderma reesei RUT C30)，購自美國模式菌種 收集中心（ATCC)，編號：ATCC 56765,其產纖維素酶生產方法，見參考文獻3。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022] 圖1為本發明單一碳源對黑曲霉C112產β-葡萄糖苷酶的影響；
[0023] 圖2為本發明單一氮源對黑曲霉C112產β-葡萄糖苷酶的影響；
[0024] 圖3為本發明黑曲霉C112搖瓶產β -葡萄糖苷酶活隨時間的變化曲線；
[0025] 圖4為本發明β -葡萄糖苷酶/濾紙酶比值對還原糖的影響；
[0026] 圖5為本發明稀磷酸浸漬木質纖維照片；
[0027] 圖6為本發明稀磷酸結合蒸汽爆破（爆破壓強：2Mpa)預處理木質纖維照片；
[0028] 圖7為本發明稀磷酸結合蒸汽爆破（爆破壓強：3Mpa)預處理木質纖維照片。
【具體實施方式】
[0029] 以下結合實施例旨在進一步說明本發明，而非限制本發明。
[0030] 實施例1 :本發明提供了單因素和正交試驗對黑曲霉C112產β-葡萄糖苷酶工藝 的優化過程，具體如下。
[0031] 黑曲霉C112的種子培養：從實驗室保存的黑曲霉C112 土豆固體平板培養基中挑 取兩環孢子，接種于裝有50ml 土豆培養基的250ml搖瓶中，28 °C，200r/min條件下培養2? 2. 5天作為接種物。黑曲霉Cl 12種子培養基：馬鈴薯300g/L，葡萄糖20g/L，pH值6. 80。
[0032] 黑曲霉C112的產酶培養：將活化好的黑曲霉菌液，以6% (v/v)接種量接種于裝 有50ml產酶培養基的250ml搖瓶中，28°C，200r/min條件下培養5天。所有搖瓶實驗均為 3個平行。4000r/min下離心lOmin，取上清液（粗酶液）測定其β-葡萄糖苷酶活力。
[0033] 用于篩選培養基的最優單因素的黑曲霉C112產酶基本培養基：玉米芯30. 7g/ L，麩皮 l〇g/L，酵母粉 5g/L，（NH4) 2S047g/L，KH2P046g/L，CaCl 2 · 2H20 0· 9g/L，MgSO4 · 7H20 0. 9g/L，吐溫-801ml/L，Mandels微量元素濃縮液lml/L，lmol/L朽1檬酸緩沖液100ml/L。
[0034] 其中，Mandels 微量元素濃縮液：FeSO4 ·7Η20 5g/L，MnS04 ·Η20 I. 6g/L，ZnS04 ·7Η20 1. 4 g/L，CoCl2 · 6H20 3. 7g/L ;加水至 1000ml。
[0035] lmol/L 檸檬酸緩沖液：檸檬酸（C6H8O7 · H2O) 210g，H2O 750ml，加 NaOH 78g，冷卻后 測pH約為4. 2,加水至1000ml，pH約為4. 5。
[0036] 本發明所采用β_葡萄糖苷酶活力的p-NPG測定法，見參考文獻1。
[0037] 產酶培養基單因素試驗：保持產酶液體培養基中其他成分不變，分別改變碳源、復 合碳源、氮源、復合氮源這四個因素，篩選出黑曲霉C112產酶培養基的最優單因素。
[0038] 保持產酶培養基中其他成分不變，分別加入1.0%、1.5%、2. 0%的麩皮、玉米芯、 稻草粉、微晶纖維素、麥芽浸粉和乳糖作為碳源，比較不同濃度的單一碳源對黑曲霉C112 產β-葡萄糖苷酶的影響（圖1)。結果表明，玉米芯和稻草粉的產酶效果較好，其中在濃度 為2. 0%時，玉米芯和稻草粉的β -葡萄糖苷酶活力分別達到3. 577U/mL和3. 320U/mL。表 明玉米芯和稻草粉對黑曲霉的誘導產酶能力較強。
[0039] 選取單一碳源中效果較好的玉米芯與稻草粉，研究不同濃度的復合碳源對黑曲霉 Cl 12產β-葡萄糖苷酶的影響（表1)。當玉米芯為2%，稻草粉為3%時，β-葡萄糖苷酶 活力最高達到8. 768U/mL。
[0040] 表1復合碳源對黑曲霉Cl 12產β -葡萄糖苷酶的影響
[0041]
【權利要求】
1. 一種稀磷酸結合汽爆預處理改進木質纖維酶解糖化的方法，其特征在于，稀酸充分 浸漬木質纖維原料后結合蒸汽爆破，然后將爆破物脫毒，最后采用高活性復合纖維素酶進 行酶解發酵；酶解所用的高活性復合纖維素酶的制備方法如下：分別將保藏編號為CCTCC NO :M 2012129的黑曲霉C112生產的β-葡萄糖苷酶與保藏編號為ATCC 56765的里氏木 霉RUT C30生產的纖維素酶濃縮提純，并將濃縮后的酶液混合使得β-葡萄糖苷酶活/濾 紙酶活比值為1.048?2.685 ;黑曲霉C112通過產β-葡萄糖苷酶的培養基得到高活力的 β -葡萄糖苷酶，培養基配方為：玉米芯25?30g/L，稻草粉20?30g/L，蛋白胨5?6g/ L，（NH4) 2S0410 ?13g/L，KH2P046 ?8g/L，CaCl2 · 2H20 0· 5 ?1. Og/L，MgS04 · 7H20 0· 5 ? 1. Og/L，吐溫-801?2ml/L，Mandels微量元素濃縮液0. 5?lml/L，lmol/L朽1檬酸緩沖液 100?150ml/L，加水配制成1L。
2. 根據權利要求1所述的稀磷酸結合汽爆預處理改進木質纖維酶解糖化的方法，其特 征在于，濃縮后的酶液混合使得β -葡萄糖苷酶活/濾紙酶活比值為1. 536 ;黑曲霉C112通 過產β-葡萄糖苷酶的培養基得到高活力的β-葡萄糖苷酶，培養基配方為：玉米芯25g/ L，稻草粉 30g/L，蛋白胨 5g/L，（NH4)2S0410g/L，KH2P0 46g/L，CaCl2 ·2Η20 0· 9g/L，MgS04 ·7Η20 0. 9g/L，吐溫-801ml/L，Mandels微量元素濃縮液lml/L，lmol/L朽1檬酸緩沖液100ml/L，加 水配制成1L。
3. 根據權利要求1或2所述的稀磷酸結合汽爆預處理改進木質纖維酶解糖化的方法， 其特征在于，黑曲霉C112的產β-葡萄糖苷酶的培養過程如下：將黑曲霉菌C112的種子 培養液，以體積百分比5-8%的接種量接種于裝有40-60ml產酶培養基的250ml搖瓶中， 26-28°C，180-220r/min條件下培養4-6天，離心，取上清液得到粗酶液。
4. 根據權利要求3所述的稀磷酸結合汽爆預處理改進木質纖維酶解糖化的方法，其特 征在于， 黑曲霉C112的種子培養：從保存的黑曲霉C112 土豆固體平板培養基中挑取孢子，接 種于裝有40-60ml種子培養基的250ml搖瓶中，26-28°C，180-220r/min條件下培養2?3 天作為接種物；黑曲霉C112種子培養基：馬鈴薯250?300g/L，葡萄糖15?25g/L，pH值 6. 5 ?7. 0〇
5. 根據權利要求1所述的稀磷酸結合汽爆預處理改進木質纖維酶解糖化的方法，其特 征在于， 黑曲霉C112生產的纖維素酶β -葡萄糖苷酶活為13. 368?15. 496U/mL，濾紙酶活為 0. 183?0. 215IU/mL，經超濾濃縮儀濃縮后，β -葡萄糖苷酶活為18. 793?24. 741U/mL， 濾紙酶活為0. 785?0. 932IU/mL ;里氏木霉RUT C30生產的纖維素酶β -葡萄糖苷酶活為 1. 205?1. 652U/mL，濾紙酶活為5. 931?6. 212IU/mL ;經超濾濃縮儀濃縮后，β -葡萄糖苷 酶活為 9. 379 ?12. 662U/mL，濾紙酶活為 43. 335 ?48. 912IU/mL。
6. 根據權利要求1或2所述的稀磷酸結合汽爆預處理改進木質纖維酶解糖化的方 法，其特征在于，Mandels微量元素濃縮液配方為：FeS0 4 · 7H20 5g/L，MnS04 · H20 1. 6g/L， ZnS04 · 7H20 1. 4g/L，CoCl2 · 6H20 3. 7g/L，加水配制成 1L ; lmol/L檸檬酸緩沖液的配方為：檸檬酸（C6H807，H20)210g，H 20 750ml，加 NaOH 78g，冷 卻后測pH為4· 2,加水至1000ml，pH 4· 5。
7. 根據權利要求1或2所述的稀磷酸結合汽爆預處理改進木質纖維酶解糖化的方法， 其特征在于，所述的稀酸為質量濃度范圍為0. 05% -5%的稀磷酸；木質纖維原料與稀磷酸 固液質量比為1:1-1:10的范圍浸漬，浸漬時間為固液混合均勻后l_24h ;蒸汽爆破壓強為 0· 5-3Mpa，保壓時間為：60-240s。
8. 根據權利要求7所述的稀磷酸結合汽爆預處理改進木質纖維酶解糖化的方法，其特 征在于，蒸汽爆破后采用氨水中和脫毒，具體的工藝為：先加入檸檬酸緩沖液后，再用氨水 調節 pH 至 4. 5-6. 0。
9. 根據權利要求8所述的稀磷酸結合汽爆預處理改進木質纖維酶解糖化的方法，其 特征在于，收集含水率為82±3%的爆破物，按絕對干重的爆破物與容器總裝載量體積比為 0. 05:1-0. 2:1加入，再加入占容器裝載量體積百分比15-30 %的0. 05mol/L檸檬酸緩沖液， 總裝載量占容器體積的2/5-4/5,余量為水，然后加入氨水調節pH值至5. 5±0. 5,以濾紙酶 活FPU為15-30IU/g底物加入所述的高活性復合纖維素酶，50±5°C下酶解24-96h。
10. 根據權利要求8所述的稀磷酸結合汽爆預處理改進木質纖維酶解糖化的方法， 其特征在于，收集含水率82±3%的爆破物，按絕對干重的爆破物與容器總裝載量體積比 為0. 05:1-0. 2:1加入2. 5-1000L發酵罐中，再加入占發酵罐裝載量體積百分比15-30% 的0. 05mol/L的檸檬酸緩沖液，總裝載量占容器體積的2/5-4/5,余量為水，再用l-2mol/ L 氨水中和脫毒調節 pH 值至 5· 5±0· 5,加入 ΚΗ2Ρ040· 25-lg/L，CaCl2 · H20 0· 0· 2-0. 8g/L， MgS04 ·7Η20 0. 2-0. 8g/L，以濾紙酶活FPU為15-30IU/g底物加入所述的高活性復合纖維素 酶，50±5°C下酶解4-12h后，降溫至37±3°C，加入發酵菌種混合酶解發酵24-96h。
【文檔編號】C12R1/885GK104293861SQ201410457462
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月10日 優先權日:2014年9月10日
【發明者】陳介南, 張 林, 劉娜, 王揮, 詹鵬, 喻傳明 申請人:中南林業科技大學, 常德聯合生物能源研究所