基于ABCC1基因的小菜蛾對Bt殺蟲蛋白Cry1Ac抗性的檢測方法及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于ABCC1基因的小菜蛾對Bt殺蟲蛋白Cry1Ac抗性的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法及其試劑盒，所述試劑盒包含以下靶標(biāo)基因特異引物序列：正向引物如SEQIDNO.2所示，反向引物如SEQIDNO.3所示。本發(fā)明方法，需人力及樣品量少，檢測數(shù)量大，而且靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速簡便和準(zhǔn)確可靠，因而能有效的檢測小菜蛾對Bt殺蟲蛋白Cry1Ac的抗性水平，適合于小菜蛾對Bt殺蟲蛋白Cry1Ac抗性的早期快速診斷，同時(shí)可用于田間小菜蛾Bt殺蟲蛋白Cry1Ac抗性的實(shí)時(shí)監(jiān)控和預(yù)警預(yù)報(bào)，應(yīng)用前景廣泛。
【專利說明】基于ABCC1基因的小菜蛾對Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性的檢 測方法及其試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，尤其涉及小菜蛾對Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性的實(shí)時(shí)熒 光定量PCR檢測方法及其試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 1 像 Plutella xylostella (L.)，屬鱗翅目（Lepidoptera)菜蛾科 (Plutellidae)，是一種世界性危害的十字花科蔬菜重要害蟲。在我國，上世紀(jì)70年代以 來，小菜蛾逐漸上升為華南和長江中下游地區(qū)十字花科蔬菜的主要害蟲。目前，在我國廣大 的華北、東北、西北地區(qū)該蟲的危害也已日趨嚴(yán)重。小菜蛾主要以幼蟲在十字花科蔬菜的整 個(gè)生長期危害葉片，大大降低了蔬菜的產(chǎn)量和質(zhì)量，個(gè)別田塊嚴(yán)重發(fā)生時(shí)能減產(chǎn)90%以上， 甚至絕產(chǎn)。小菜蛾之所以危害如此嚴(yán)重主要是因?yàn)樗芎芸鞂Χ喾N化學(xué)藥劑產(chǎn)生抗藥性， 對農(nóng)藥具有超強(qiáng)的適應(yīng)性。它幾乎對用于防治其危害的各類殺蟲劑都產(chǎn)生了不同程度的抗 藥性，這其中就包括生物源農(nóng)藥蘇云金芽孢桿菌Bt (唐振華和周成理，1992)。
[0003] 蘇云金芽孢桿菌（ZfeciBm 簡稱Bt)是一種在芽孢形成期間可 產(chǎn)生殺蟲晶體蛋白（Insecticidal Crystal Proteins,簡稱ICPs，又被稱為δ-內(nèi)毒素） 的革蘭氏陽性細(xì)菌。由于其殺蟲譜廣，專一性強(qiáng)，對人畜無害，對環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，Bt制劑現(xiàn) 已成為世界上應(yīng)用最廣的一類微生物殺蟲劑。而且，目前編碼Bt殺蟲蛋白的多種基因也已 被成功轉(zhuǎn)入到了多種重要的糧棉作物中，用于田間害蟲防治。多年來，它在害蟲防治中發(fā)揮 了重要作用。但是Bt制劑大量及不合理的使用最終造成了害蟲產(chǎn)生Bt抗性。小菜蛾的Bt 抗性問題已非常突出，因此為了更有效的使用Bt生物農(nóng)藥防治小菜蛾，開發(fā)有效地小菜蛾 Bt抗性早期快速分子診斷技術(shù)就顯得尤為重要。目前，盡管一些基于PCR方法的分子標(biāo)記 技術(shù)如RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)、AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism,擴(kuò)增片段長度多態(tài)性）已經(jīng)用于小菜蛾抗性相關(guān)基因的 尋找上，但這些標(biāo)記并未直接用于小菜蛾抗性檢測，小菜蛾Bt抗性檢測仍局限于生物測定 方法。然而，傳統(tǒng)的生物測定方法有一些缺點(diǎn)：（1)靈敏度低：生物測定很難檢測早期抗性 或低頻率抗性；（2)周期長：小菜蛾的Bt生物測定結(jié)果一般需要2天（48小時(shí)）以上；（3) 對試蟲數(shù)量要求很大：測定一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線完成一次生測至少需要約200頭試蟲，且對昆蟲 飼養(yǎng)的要求也很高。（4)操作麻煩且標(biāo)準(zhǔn)性不強(qiáng)：方法比較繁瑣，操作起來比較復(fù)雜，從蟲 源、飼養(yǎng)到測定難以做到真正的標(biāo)準(zhǔn)化，尤其要求試蟲的大小一致，不僅導(dǎo)致生測的工作量 加大，而且諸多人為因素也會影響生測結(jié)果；(5)傳統(tǒng)的方法從軟件繪出的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出 的LC 5(I和LC9(I值的重復(fù)性和精確性較低；(6)傳統(tǒng)的生物測定方法對供試?yán)ハx測得的抗性 水平往往具有滯后性。
[0004] 隨著分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)一步的飛速發(fā)展，人們已經(jīng)將實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù) (Real Time-quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-qPCR)廣泛應(yīng)用于多種病 毒、細(xì)菌的抗藥性檢測，并開始應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄水平上昆蟲Bt抗藥性靶標(biāo)基因的表達(dá)量檢測。 實(shí)時(shí)熒光定量PCR就是在PCR擴(kuò)增過程中，通過熒光信號，對PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測。由于 在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的Ct值（每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷 的循環(huán)數(shù)）和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。相對于生測等常 規(guī)Bt抗性檢測手段，實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有操作簡單，靈敏度高，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，因而已 開始成為昆蟲抗藥性靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量檢測的首選方法，在抗藥性檢測上日益顯示 出強(qiáng)大的優(yōu)勢。
[0005] 目前，利用PCR技術(shù)對Bt殺蟲蛋白受體基因類鈣粘蛋白基因（cadherin-like gene)在對Bt殺蟲蛋白抗性的棉紅鈴蟲（/?^及煙芽夜蛾 rirescefls)中缺失突變位點(diǎn)來檢測這兩種害蟲對Bt殺蟲蛋白抗性情況已 經(jīng)被報(bào)道，但是田間害蟲種群檢測效果并不理想（Morin et al·，2004; Gahan et al·， 2007)。而且，研究表明，形成Bt殺蟲蛋白抗性小菜蛾的類鈣粘蛋白基因并未發(fā)生突變，小 菜蛾Bt殺蟲蛋白抗性與該基因無關(guān)（Baxter et al.，2005)。最近，卻有研究表明，ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ATP-binding cassette transporter, ABC transporter)超家族中 ABCC 亞家 族的ABCC2基因發(fā)生突變并導(dǎo)致小菜蛾對Bt殺蟲蛋白CrylAc產(chǎn)生抗性（Baxter et al.， 2011)，而且，該實(shí)驗(yàn)中所用的小菜蛾種群是田間進(jìn)化的Bt殺蟲蛋白CrylAc高抗種群，這說 明ABCC2基因發(fā)生突變的小菜蛾可以在田間存活，這就為田間小菜蛾Bt殺蟲蛋白CrylAc 抗性檢測提供了很好的靶標(biāo)基因。然而，我們隨后的實(shí)驗(yàn)并未發(fā)現(xiàn)ABCC2基因突變與Bt殺 蟲蛋白CrylAc抗性相關(guān)，然而，我們最近利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋 白超家族中ABCC亞家族的ABCC1基因表達(dá)量在抗性種群中顯著上調(diào)，那么，利用實(shí)時(shí)熒光 定量PCR技術(shù)檢測ABCC1表達(dá)量的升高水平是一種有效檢測田間害蟲Bt Cry類殺蟲毒素 抗性的好方法。毫無疑問，小菜蛾早期抗藥性分子檢測與診斷技術(shù)的開發(fā)將為其抗性治理 措施的評價(jià)以及抗藥性風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警提供技術(shù)手段，在減少害蟲危害損失、減少農(nóng)藥對環(huán)境的 污染、保障蔬菜產(chǎn)品的質(zhì)量和保障人民身體健康等方面具有重要的意義。因此，建立一種準(zhǔn) 確、簡便、快速、可靠的小菜蛾Bt抗性檢測手段尤為迫切。所以為了更好的檢測小菜蛾Bt 殺蟲蛋白CrylAc抗性，開發(fā)出更有效地小菜蛾Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性檢測手段，我們開 展了該研究內(nèi)容。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明針對現(xiàn)有小菜蛾Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性檢測技術(shù)中存在的靈敏度低、周 期長、重復(fù)性差及材料要求高等問題，擬通過特異性熒光定量PCR引物篩選及其反應(yīng)體系 的優(yōu)化等步驟，建立一種快速準(zhǔn)確的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分子檢測方法及快速、簡便、準(zhǔn)確、 高效的檢測小菜蛾Bt抗性的檢測試劑盒，為小菜蛾Bt抗性有效檢測提供有效工具。
[0007] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供了一種用于檢測小菜蛾對Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性的 PCR引物對，所述引物對的序列：正向引物如SEQ ID N0. 2所示，反向引物如SEQ ID N0. 3 所示。
[0008] 所述特異性引物對包括以小菜蛾中腸 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族中ABCC亞家族ABCC1 基因的保守片段區(qū)為靶目標(biāo)序列設(shè)計(jì)得到的靶標(biāo)基因特異性引物對以及已報(bào)道的小菜蛾 持家基因核糖體蛋白L32基因的保守片段區(qū)為靶目標(biāo)序列設(shè)計(jì)得到的內(nèi)參基因 L32特異性 引物序列。
[0009] 本發(fā)明還提供一種用于檢測小菜蛾對Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性的PCR檢測試劑盒， 其特征在于：所述試劑盒包含所述的引物對。進(jìn)一步的，本試劑盒中還包括本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表 的（Fuetal.，2013)以小菜蛾持家基因核糖體蛋白L32基因的保守片段區(qū)為靶目標(biāo)序 列設(shè)計(jì)得到的內(nèi)參基因 L32特異性引物序列（正向引物：5' -CCAATTTACCGCCCTACC-3';反 向引物：5' -TACCCTGTTGTCAATACCTCT-3')，用于校正樣品間實(shí)驗(yàn)誤差。本試劑盒中含有 的逆轉(zhuǎn)錄酶，DNase，RNase抑制劑，dNTP混合物，特異性引物，MgCl 2溶液，熱啟動(dòng)Taq DNA 聚合酶，突光定量反應(yīng)液，Buffer緩沖液，RNase-free水等實(shí)驗(yàn)組分對于本領(lǐng)域技術(shù)人員 來說屬于公知常識，可根據(jù)自身需要選用。此外，本試劑盒還包括符合該試劑盒要求的陽性 對照及陰性對照樣品。
[0010] 本發(fā)明進(jìn)而提供一種檢測小菜蛾對Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性的PCR檢測方法，其 特征在于：其采用如所述的引物對或所述的試劑盒進(jìn)行PCR。
[0011] 具體包括以下步驟： (1) 提取待測小菜蛾的RNA樣品，并反轉(zhuǎn)錄為CDNA模板； (2) 將所述cDNA模板加入到含有所述引物對的PCR反應(yīng)液中得到PCR反應(yīng)體系； (3) 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測； 其中優(yōu)選地，所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性15 min，94°C變性 15 sec，55?退火 30 sec，72?延伸 32 sec，40 個(gè)循環(huán)。
[0012] 進(jìn)一步的，PCR過程完成后，按0. 1°C · f的升溫速率從72°C升至95°C進(jìn)行融解 曲線的分析驗(yàn)證，具體過程為：95°C進(jìn)行15 s，然后60°C進(jìn)行1 min，接著95°C進(jìn)行30 s， 最后再在60°C進(jìn)行15 s ; 若所述待測小菜蛾的樣品產(chǎn)生典型的"S"型擴(kuò)增曲線及單峰融解曲線，且Λ Ct值[Ct 值（目_--α-__?32)]彡9,則說明所述小菜蛾待測的樣品對Bt殺蟲蛋白CrylAc產(chǎn)生抗 性；若ACt值收值 （目__。?！竉基_2)] > 10,則說明待測小菜蛾的樣品未對Bt殺蟲蛋 白CrylAc產(chǎn)生抗性。
[0013] 優(yōu)選地，所述待測小菜蛾的RNA樣品為小菜蛾4齡幼蟲中腸的RNA樣品。
[0014] 優(yōu)選的，本發(fā)明使用ABI Prism 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測。
[0015] ABI Prism 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行結(jié)果分析時(shí)，基線設(shè)置取3-15個(gè)循環(huán) 的熒光信號。為便于比較，樣品、陰性及陽性對照的所有擴(kuò)增曲線的閾值均設(shè)定為〇. 50153 (位于擴(kuò)增曲線對數(shù)期中間位置，其它儀器基線和閾值設(shè)定可根據(jù)儀器作相應(yīng)調(diào)整）。
[0016] 對上述步驟中熒光定量PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量檢測，在特定的波長條件下， 根據(jù)熒光檢測的抗敏樣品間各自靶標(biāo)基因 ABCC1與內(nèi)參基因 L32之間的Ct值差值(即Λ Ct 值）判斷結(jié)果，若所述待測小菜蛾樣品產(chǎn)生典型的"S"型擴(kuò)增曲線及單峰融解曲線，且ACt 值彡9,則說明所述小菜蛾待測樣品對Bt殺蟲蛋白CrylAc產(chǎn)生抗性；若Λ Ct值彡10,則說 明待測小菜蛾樣品未對Bt殺蟲蛋白CrylAc產(chǎn)生抗性。若Λ Ct值位于兩者中間，則建議重 做，樣品對Bt殺蟲蛋白抗性產(chǎn)生與否視重做結(jié)果而定。
[0017] 本發(fā)明系選擇小菜蛾中腸 ABCC1基因的保守片段區(qū)為靶目標(biāo)序列，根據(jù)該基因特 點(diǎn)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物的設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)了一對特異性引物，再配合已發(fā)表的內(nèi)參基 因 L32特異性引物，建立了一種用于小菜蛾Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性檢測的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR試劑盒及其檢測方法。較之現(xiàn)有生物測定技術(shù)而言，本發(fā)明所提供的小菜蛾Bt殺蟲蛋 白抗性檢測的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒及其使用方法，具有如下效果及優(yōu)點(diǎn)： (1)特異性更強(qiáng)。本發(fā)明是利用小菜蛾中腸 ABCC1基因的保守片段區(qū)為靶目標(biāo)序列，設(shè) 計(jì)了一對特異性引物，從而在PCR過程中可以對靶目標(biāo)序列進(jìn)行特異性擴(kuò)增，通過將未知 樣品和陽性對照間的ABCC1基因表達(dá)量差異進(jìn)行比對即可測定未知樣品是否產(chǎn)生抗性；而 傳統(tǒng)的生測方法是通過觀察判斷試蟲在不同Bt殺蟲蛋白CrylAc濃度下死亡情況來粗略判 斷小菜蛾是否對Bt殺蟲蛋白CrylAc產(chǎn)生抗性，其判斷較之基因檢測特異性差得多。
[0018] (2)靈敏度和準(zhǔn)確度更高。本發(fā)明中涉及的小菜蛾Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性檢 測方法是通過檢測PCR實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度確定抗性相關(guān)基因表達(dá)量來判斷小菜蛾是否產(chǎn)生抗 性，而實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度的儀器檢測，相對于傳統(tǒng)的通過人為觀察判斷試蟲在不同Bt殺蟲蛋白 CrylAc濃度下死亡情況來粗略判斷小菜蛾是否對Bt殺蟲蛋白CrylAc產(chǎn)生抗性這種誤判率 及重復(fù)性較差的生測方法，抗性檢測的靈敏度和準(zhǔn)確度大大提高。
[0019] (3)檢測周期短。生測過程至少需要48小時(shí)的時(shí)間，而本發(fā)明方法僅需3小時(shí)即 可完成判斷，一次可以同時(shí)檢測多個(gè)樣品，特別適合于大批量樣品的快速檢測。
[0020] (4)材料要求少。小菜蛾毒力生物測定中測定一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線至少需要約200頭標(biāo) 準(zhǔn)試蟲，這些試蟲的飼養(yǎng)及挑取需要花費(fèi)一定的人力、物力和財(cái)力。而本發(fā)明對一個(gè)種群的 檢測只需要幾十頭左右的4齡試蟲，甚至可以檢測單頭4齡試蟲。
[0021] 綜上所述，本發(fā)明的方法可替代傳統(tǒng)的生物測定方法，它可以準(zhǔn)確、快速、特異、方 便的檢出供試小菜蛾是否具有Bt抗性，對田間小菜蛾Bt抗性的監(jiān)測監(jiān)控具有重要意義。
[0022] 尤其需要指出的是，本發(fā)明人之前研究認(rèn)為利用PCR技術(shù)檢測小菜蛾中腸膜結(jié)合 形式的堿性磷酸酶基因（mALP)表達(dá)量變化可作為小菜蛾Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性的好方 法（已申請國家發(fā)明專利，專利號201210273591.0)，盡管與mALP相比，ABCC1基因表達(dá)量 變化并不與小菜蛾Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性性狀連鎖，但是抗性小菜蛾卻需要ABCC1基因 表達(dá)量變化來補(bǔ)充適合度代價(jià)，那么在不同抗性倍數(shù)小菜蛾中ABCC1基因表達(dá)量變化卻比 mALP表達(dá)量變化更為靈敏，因此，與該發(fā)明專利內(nèi)容相比，本發(fā)明專利所利用的檢測ABCC1 基因表達(dá)量變化的方法更能反應(yīng)不同抗性基因頻率水平與抗性倍數(shù)之間的關(guān)系，從而能更 好的檢測形成不同程度抗性的田間小菜蛾種群。
[0023] 本發(fā)明所提供的小菜蛾對Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性的PCR檢測方法，需人力及樣 品量少，檢測數(shù)量大的特點(diǎn)，而且靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速簡便和準(zhǔn)確可靠，因而能有效的 檢測小菜蛾對Bt殺蟲蛋白的抗性，適合于小菜蛾對Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性的早期快速診 斷，同時(shí)可用于田間小菜蛾Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性的實(shí)時(shí)監(jiān)控和預(yù)警預(yù)報(bào)，應(yīng)用前景廣 泛。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024] 圖1為本發(fā)明中所用特異性引物對擴(kuò)增小菜蛾中腸 ABCC1基因 cDNA片段序列。
[0025] 圖2為圖1中目的基因 ABCC1和內(nèi)參基因 L32在Bt殺蟲蛋白CrylAc敏感的4齡 小菜蛾幼蟲中腸 cDNA樣品PCR擴(kuò)增片段的2%瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，1 :目的基因 ABCC1 的PCR擴(kuò)增片段（165bp) ;2:內(nèi)參基因 L32的PCR擴(kuò)增片段（120bp) ;M:Marker I。
[0026] 圖3為標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR所得到的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線。其中，橫 坐標(biāo)代表循環(huán)數(shù)（Cycle)，縱坐標(biāo)代表第η次PCR循環(huán)時(shí)的熒光信號強(qiáng)度（Rn)，圖中平行 且遠(yuǎn)離橫坐標(biāo)的直線代表熒光閾值，字母代表樣品cDNA的5個(gè)2X梯度稀釋濃度。
[0027] 圖4是根據(jù)圖3中得出的數(shù)據(jù)繪制的熒光定量PCR所得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中，橫 坐標(biāo)代表標(biāo)準(zhǔn)樣品cDNA濃度的對數(shù)值，縱坐標(biāo)代表循環(huán)閾值即Ct值。
[0028] 圖5為實(shí)施例1的檢測小菜蛾Bt殺蟲蛋白抗性的熒光定量PCR檢測結(jié)果。其中， A :對Bt殺蟲蛋白CrylAc敏感小菜蛾種群DBMIAc-S的4齡幼蟲中腸 cDNA樣品；B :對Bt殺 蟲蛋白CrylAc產(chǎn)生抗性小菜蛾種群SZ-R的4齡幼蟲中腸 cDNA的樣品。
[0029] 圖6為實(shí)施例2的檢測小菜蛾Bt抗性的熒光定量PCR檢測結(jié)果。其中，A :實(shí)施例 1中對Bt敏感的小菜蛾種群DBMIAc-S的4齡幼蟲中腸 cDNA陰性對照樣品；B :實(shí)施例1中 對Bt殺蟲蛋白CrylAc產(chǎn)生抗性的小菜蛾種群SZ-R的4齡幼蟲中腸 cDNA陽性對照樣品； C :對Btk制劑產(chǎn)生抗性的小菜蛾種群SH-R的4齡幼蟲中腸 cDNA待測樣品；D :對Bt殺蟲 蛋白CrylAc產(chǎn)生抗性的近等基因系小菜蛾種群DBMIAc-R的4齡幼蟲中腸 cDNA待測樣品； E :對Bt殺蟲蛋白CrylAc產(chǎn)生抗性的小菜蛾種群NIL-R的4齡幼蟲中腸 cDNA待測樣品。
[0030]
【具體實(shí)施方式】
[0031] 以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述與說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此。
[0032] 實(shí)驗(yàn)前材料樣品準(zhǔn)備： (1) 小菜蛾Bt殺蟲蛋白敏感種群（DBMIAc-S):該小菜蛾種群在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜 花卉研究所昆蟲組昆蟲飼養(yǎng)室內(nèi)用無蟲甘藍(lán)苗進(jìn)行繼代飼養(yǎng)，期間未接觸任何有毒殺蟲 齊U，對Bt制劑及其產(chǎn)生的毒素敏感；記載過小菜蛾Bt敏感種群（DBMIAc-S)的非專利文獻(xiàn) 是：Yang, Z. X. , ffu, Q. J. , Wang, S. L. , Chang, X. L. , Wang, J. H. , Guo, Z. J. , Lei, Y. Y. , Xu, B. Y. , Zhang, Y. J. (2012) Expression of cadherin, aminopeptidase N and alkaline phosphatase genes in CrylAc-susceptible and Cry1Ac~resistant strains of Plutella xylostella (L.). Journal of Applied Entomology, 136, 539 - 548. (2) 小菜蛾Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性種群（DBMIAc-R):該種群在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜 花舟研究所昆蟲組昆蟲飼養(yǎng)室內(nèi)用Bt殺蟲蛋白CrylAc (提取方法參考Luo, K. , Banks, D. , Adang, M. J. (1999) Toxicity, binding, and permeability analyses of four Bacillus thuringiensis Cryl δ-endotoxins using brush border membrane vesicles of Spodoptera exigua and Spodop tera frugiper da. Applied and Environmental 65, 457 - 464.)進(jìn)行抗性汰選，連續(xù)飼養(yǎng)至今；記載過小菜蛾Bt殺蟲蛋 白 CrylAc 抗性種群（DBMIAc-R)的非專利文獻(xiàn)是：Yang, Ζ· X.，Wu，Q. J.，Wang, S. L.， Chang, X. L. , Wang, J. H. , Guo, Z. J. , Lei, Y. Y. , Xu, B. Y. , Zhang, Y. J. (2012) Expression of cadherin, aminopeptidase N and alkaline phosphatase genes in CrylAc-susceptible and CrylAc-resistant strains of Plutella xylostella (L.). Journal of Applied Entomology, 136, 539 - 548. (3) 小菜蛾Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性近等基因系種群（NIL-R):該種群在敏感種群 DBMIAc-S和抗性種群DBMIAc-R經(jīng)過多達(dá)7次的多組單對雜交、回交及汰選后建立的與 DBMIAc-S敏感種群遺傳背景高度相似的近等基因系CrylAc抗性種群。該種群建成后在本 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用Bt殺蟲蛋白CrylAc進(jìn)行持續(xù)抗性汰選，連續(xù)飼養(yǎng)至今；記載過該小菜蛾Bt殺 蟲蛋白CrylAc抗性近等基因系種群（NIL-R)的非專利文獻(xiàn)是：Zhu，X.，Lei，Y.，Yang， Υ·，Baxter，S. W.，Li，J.，Wu，Q.，Wang，S.，Xie，W.，Guo，Ζ·，F(xiàn)u，W.，Zhang，Υ· (2014) Construction and characterisation of near-isogenic Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) strains resistant to CrylAc toxin. Pest Management Science, DOI: 10. 1002/ps. 3785. (4) 深圳汰選種群（SZ-R，又叫T2-R):該種群是2003年在廣東省深圳田間采集的小 菜蛾種群，在本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用Bt殺蟲蛋白CrylAc浸葉汰選至今； (5) 上海汰選種群（SH-R):該種群是2005年在上海田間采集的小菜蛾種群，在本實(shí)驗(yàn) 室內(nèi)用Btk制劑（購自湖北省農(nóng)科院Bt研究開發(fā)中心）浸葉進(jìn)行抗性選育至今。
[0033] 以上所用的5個(gè)種群：小菜蛾Bt殺蟲蛋白敏感種群（DBMIAc-S)、小菜蛾Bt殺蟲蛋 白CrylAc抗性種群（DBMIAc-R)、小菜蛾Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性近等基因系種群（NIL-R)、 深圳汰選種群（SZ-R)和上海汰選種群（SH-R)。
[0034] 上述五個(gè)小菜蛾種群均在室內(nèi)進(jìn)行隔離飼養(yǎng)，將蛹放入成蟲飼養(yǎng)籠中（R=10 cm， L=40 cm)，籠四周以80目的紗網(wǎng)包圍，成蟲羽化后，籠內(nèi)掛浸過10%蜂蜜糖水的脫脂棉球一 個(gè)，為成蟲補(bǔ)充營養(yǎng)，讓其在甘藍(lán)苗上產(chǎn)卵，卵孵化后再轉(zhuǎn)入新鮮的甘藍(lán)苗上飼養(yǎng)。飼養(yǎng)溫 度是25±1°C，相對濕度為60%-70%，光周期為光照：黑暗=16h :8h。
[0035] 實(shí)施例1 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對DBMIAc-S及SZ-R的4齡幼蟲中腸 cDNA樣品的檢測及 本檢測試劑盒和其使用方法的建立。
[0036] 1.以小菜蛾中腸 ABCC1基因的保守片段區(qū)為靶目標(biāo)序列（SEQ ID N0. 1)，根據(jù)實(shí) 時(shí)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)特異性熒光定量引物序列如下： 正向引物（qCCl-F) :5' -GGTGGTGCTCATCTGCTACCTCAT-3' (SEQ ID NO. 2)； 反向引物（qCCl-R) :5' -ATCCTGACACGCTCATCGGTTTT-3' (SEQ ID NO. 3)； 該特異性引物擴(kuò)增片段序列如圖1所示，其擴(kuò)增特異性如圖2(其中，1 :目的基因 ABCC1 的PCR擴(kuò)增片段；2 :內(nèi)參基因 L32的PCR擴(kuò)增片段;M :Marker I。）所示，從圖中可看出該 引物擴(kuò)增特異性高，擴(kuò)增條帶單一，大小為165bp，符合實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)要求。此外， 從圖中也可看出本實(shí)驗(yàn)中使用的內(nèi)參基因 L32的引物擴(kuò)增特異性也很高，擴(kuò)增條帶單一， 大小為120bp，也符合實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)要求。
[0037] 2.提取兩種群4齡小菜蛾中腸 RNA樣品，然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA模板，在包括步驟1 所述特異性引物的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行反應(yīng)； (1)小菜蛾中腸 RNA的提取步驟如下： ① 取敏感、抗性種群小菜蛾4齡幼蟲，使用解剖鑷冰上取出中腸組織，并使用0. 7% NaCl溶液漂洗干凈； ② 將中腸組織放入玻璃勻漿器內(nèi)，并向勻漿器中加入1 ml的Trizol試劑充分勻漿，勻 漿后將液體倒入1. 5ml離心管內(nèi)，室溫放置5min ; ③ 向離心管中加入0. 2 ml的氯仿，劇烈振蕩15 s，然后室溫放置3 min ; ④ 在4°C條件下12, 000 rpm離心15 min ; ⑤ 吸取上清液轉(zhuǎn)入到一個(gè)新的離心管中，加入0. 5 ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室 溫靜置10 min ; ⑥ 在4°C條件下12, 000 rpm離心10 min ; ⑦ 棄上清，然后加入1 ml 75%的乙醇，輕輕洗漆沉淀，4? ,7,500 rpm離心5 min,棄上 清； ⑧ RNA沉淀自然干燥后，加入約5〇μ1 DEPC水溶解，冰上保存，測OD26(l/OD28(l值，電泳檢 測條帶，選擇符合條件的RNA樣品進(jìn)行以下反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)或-80°C保存?zhèn)溆谩?br>
[0038] (2)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板： 下面以日本TaKaRa公司去基因組的PrimeScript? RT試劑盒為例，實(shí)驗(yàn)過程如下： ① 使用前將試劑盒各組分解凍并離心混勻； ② 基因組DNA的去除反應(yīng)：
【權(quán)利要求】
1. 一種用于檢測小菜蛾對Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性的PCR引物對，其特征在于： 所述引物對的序列為：正向引物如SEQ ID NO. 2所示，反向引物如SEQ ID NO. 3所示。
2. -種用于檢測小菜蛾對Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性的PCR檢測試劑盒，其特征在于： 所述試劑盒包含權(quán)利要求1所述的引物對。
3. -種檢測小菜蛾對Bt殺蟲蛋白Cry lAc抗性的PCR檢測方法，其特征在于： 其采用如權(quán)利要求1所述的引物對或權(quán)利要求2所述的試劑盒進(jìn)行PCR。
4. 如權(quán)利要求3所述的檢測小菜蛾對Bt殺蟲蛋白Cry lAc抗性的PCR檢測方法，具體 包括以下步驟： (1) 提取待測小菜蛾的RNA樣品，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA模板； (2) 將所述cDNA模板加入到含有所述引物對的PCR反應(yīng)液中得到PCR反應(yīng)體系； (3) 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。
5. 如權(quán)利要求4所述的檢測小菜蛾對Bt殺蟲蛋白Cry lAc抗性的PCR檢測方法，其中， 所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性15 min，94°C變性15 sec，55°C退火 30 sec，72°C延伸 32 sec，40 個(gè)循環(huán)。
6. 如權(quán)利要求4所述的檢測小菜蛾對Bt殺蟲蛋白Cry lAc抗性的PCR檢測方法，其中， PCR過程完成后，按0. ΓΟ?Γ1的升溫速率從72°C升至95°C進(jìn)行融解曲線的分析驗(yàn)證，具體 過程為：95°C進(jìn)行15 s，然后60°C進(jìn)行1 min，接著95°C進(jìn)行30 s，最后再在60°C進(jìn)行15 s ； 若所述待測小菜蛾的樣品產(chǎn)生典型的"S"型擴(kuò)增曲線及單峰融解曲線，且Λ Ct值[Ct 值（目_Β?α-__?32)]彡9,則說明所述小菜蛾待測的樣品對Bt殺蟲蛋白CrylAc產(chǎn)生抗 性；若ACt值收值 （目__。?！竉基_2)] > 10,則說明待測小菜蛾的樣品未對Bt殺蟲蛋 白Cry 1 Ac產(chǎn)生抗性。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4至6任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：所述待測小菜蛾的RNA樣品 為小菜蛾4齡幼蟲中腸的RNA樣品。
【文檔編號】C12N15/11GK104195253SQ201410455061
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月9日
【發(fā)明者】張友軍, 郭兆將, 康師, 朱勛, 吳青君, 王少麗, 徐寶云, 謝文 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所