基于ABCC3基因的小菜蛾對(duì)Bt殺蟲蛋白Cry1Ac抗性的檢測(cè)方法及其試劑盒的制作方法

基于ABCC3基因的小菜蛾對(duì)Bt殺蟲蛋白Cry1Ac抗性的檢測(cè)方法及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于ABCC3基因的小菜蛾對(duì)Bt殺蟲蛋白Cry1Ac抗性的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法及其試劑盒，所述試劑盒包含以下靶標(biāo)基因特異引物序列：正向引物如SEQIDNO.2所示，反向引物如SEQIDNO.3所示。本發(fā)明方法，需人力及樣品量少，檢測(cè)數(shù)量大，而且靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速簡(jiǎn)便和準(zhǔn)確可靠，因而能有效的檢測(cè)小菜蛾對(duì)Bt殺蟲蛋白Cry1Ac的抗性水平，適合于小菜蛾對(duì)Bt殺蟲蛋白Cry1Ac抗性的早期快速診斷，同時(shí)可用于田間小菜蛾Bt殺蟲蛋白Cry1Ac抗性的實(shí)時(shí)監(jiān)控和預(yù)警預(yù)報(bào)，應(yīng)用前景廣泛。
【專利說明】基于ABCC3基因的小菜蛾對(duì)Bt殺蟲蛋白CryIAc抗性的檢測(cè)方法及其試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，尤其涉及小菜蛾對(duì)Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法及其試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002]小菜蛾P(guān)lutella xylostella (L.),屬鱗翅目(Lepidoptera)菜蛾科(Plutellidae)，是一種世界性危害的重要蔬菜害蟲，寄主多達(dá)40種以上，現(xiàn)已成為世界范圍內(nèi)十字花科蔬菜生產(chǎn)的重大障礙。小菜蛾主要以幼蟲在十字花科蔬菜的整個(gè)生長(zhǎng)期危害葉片，大大降低了蔬菜的產(chǎn)量和質(zhì)量，個(gè)別田塊嚴(yán)重發(fā)生時(shí)能減產(chǎn)90%以上，甚至絕產(chǎn)。小菜蛾之所以危害如此嚴(yán)重主要是因?yàn)閷?duì)化學(xué)農(nóng)藥具有超強(qiáng)的適應(yīng)性。目前，它幾乎對(duì)用于防治其危害的各類殺蟲劑都產(chǎn)生了不同程度的抗藥性，這主要包括有機(jī)磷類、有機(jī)氯類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類、昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)劑以及生物源農(nóng)藥阿維菌素、多殺菌素和蘇云金芽孢桿菌Bt等五十多種殺蟲劑(唐振華和周成理，1992)。
[0003]蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，窗取奴C)是一種可產(chǎn)生殺蟲晶體蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,簡(jiǎn)稱ICPs,又被稱為δ-內(nèi)毒素)的革蘭氏陽性細(xì)菌。Bt很早即作為生物殺蟲劑被廣泛用于田間害蟲防治，Bt制劑現(xiàn)已成為世界上應(yīng)用最廣的一類微生物殺蟲劑。但是Bt制劑大量及不合理的使用最終造成了害蟲產(chǎn)生Bt抗性。目前在世界范圍內(nèi)至少已有7種害蟲被報(bào)道已經(jīng)在田間產(chǎn)生Bt抗性，這其中包括2種害蟲對(duì)Bt制劑產(chǎn)生抗性以及5種害蟲對(duì)Bt作物產(chǎn)生抗性(Tabashnik et al., 2011; Tabashniket al., 2013)。由此可知，小菜蛾的Bt抗性問題已非常突出，因此為了更有效的使用Bt生物農(nóng)藥防治小菜蛾，開發(fā)有效地小菜蛾Bt抗性早期快速分子診斷技術(shù)就顯得尤為重要。目前，盡管一些基于PCR方法的分子標(biāo)記技術(shù)如RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA,隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA)、AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性)已經(jīng)用于小菜蛾抗性相關(guān)基因的尋找上，但這些標(biāo)記并未直接用于小菜蛾抗性檢測(cè)，小菜蛾Bt抗性檢測(cè)仍局限于生物測(cè)定方法。然而，傳統(tǒng)的生物測(cè)定方法有一些缺點(diǎn):
(I)靈敏度低:生物測(cè)定很難檢測(cè)早期抗性或低頻率抗性；(2)周期長(zhǎng):小菜蛾的Bt生物測(cè)定結(jié)果一般需要2天(48小時(shí))以上；(3)對(duì)試蟲數(shù)量要求很大:測(cè)定一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線完成一次生測(cè)至少需要約200頭試蟲，且對(duì)昆蟲飼養(yǎng)的要求也很高。(4)操作麻煩且標(biāo)準(zhǔn)性不強(qiáng):方法比較繁瑣，操作起來比較復(fù)雜，從蟲源、飼養(yǎng)到測(cè)定難以做到真正的標(biāo)準(zhǔn)化，尤其要求試蟲的大小一致，不僅導(dǎo)致生測(cè)的工作量加大，而且諸多人為因素也會(huì)影響生測(cè)結(jié)果；
(5)傳統(tǒng)的方法從軟件繪出的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出的LC5tl和LC9tl值的重復(fù)性和精確性較低；(6)傳統(tǒng)的生物測(cè)定方法對(duì)供試?yán)ハx測(cè)得的抗性水平往往具有滯后性。
[0004]隨著分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)一步的飛速發(fā)展，人們已經(jīng)將實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Real Time-quantitative Polymerase Chain React1n, RT-qPCR)廣泛應(yīng)用于多種病毒、細(xì)菌的抗藥性檢測(cè)，并開始應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄水平上昆蟲Bt抗藥性靶標(biāo)基因的表達(dá)量檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR就是在PCR擴(kuò)增過程中，通過熒光信號(hào)，對(duì)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的Ct值(每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。相對(duì)于生測(cè)等常規(guī)Bt抗性檢測(cè)手段，實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，因而已開始成為昆蟲抗藥性靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量檢測(cè)的首選方法，在抗藥性檢測(cè)上日益顯示出強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)。
[0005]目前，利用PCR技術(shù)對(duì)Bt殺蟲蛋白受體基因類鈣粘蛋白基因(cadherin-1 ikegene)在對(duì)Bt殺蟲蛋白抗性的棉紅鈴蟲(Pectinophora gossypiella)及煙芽夜蛾Qiel1this virescens)中缺失突變位點(diǎn)來檢測(cè)這兩種害蟲對(duì)Bt殺蟲蛋白抗性情況已經(jīng)被報(bào)道，但是田間害蟲種群檢測(cè)效果并不理想(Morin et al., 2004; Gahan et al.,2007)。而且，研究表明，形成Bt殺蟲蛋白抗性小菜蛾的類鈣粘蛋白基因并未發(fā)生突變，小菜蛾Bt殺蟲蛋白抗性與該基因無關(guān)(Baxter et al.，2005)。最近，卻有研究表明，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette transporter, ABC transporter)超家族中 ABCC 亞家族的ABCC2基因發(fā)生突變并導(dǎo)致小菜蛾對(duì)Bt殺蟲蛋白CrylAc產(chǎn)生抗性(Baxter et al.，2011)，而且，該實(shí)驗(yàn)中所用的小菜蛾種群是田間進(jìn)化的Bt殺蟲蛋白CrylAc高抗種群，這說明ABCC2基因發(fā)生突變的小菜蛾可以在田間存活，這就為田間小菜蛾Bt殺蟲蛋白CryIAc抗性檢測(cè)提供了很好的靶標(biāo)基因。然而，我們隨后的實(shí)驗(yàn)并未發(fā)現(xiàn)ABCC2基因突變與Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性相關(guān)，然而，我們最近利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族中ABCC亞家族的ABCC3基因表達(dá)量顯著上調(diào)與小菜蛾Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性密切相關(guān)，那么，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)ABCC3表達(dá)量的下降水平是一種有效檢測(cè)田間害蟲Bt Cry類殺蟲毒素抗性的好方法。毫無疑問，小菜蛾早期抗藥性分子檢測(cè)與診斷技術(shù)的開發(fā)將為其抗性治理措施的評(píng)價(jià)以及抗藥性風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警提供技術(shù)手段，在減少害蟲危害損失、減少農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的污染、保障蔬菜產(chǎn)品的質(zhì)量和保障人民身體健康等方面具有重要的意義。因此，建立一種準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速、可靠的小菜蛾Bt抗性檢測(cè)手段尤為迫切。所以為了更好的檢測(cè)小菜蛾Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性，開發(fā)出更有效地小菜蛾Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性檢測(cè)手段，我們開展了該研究?jī)?nèi)容。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有小菜蛾Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性檢測(cè)技術(shù)中存在的靈敏度低、周期長(zhǎng)、重復(fù)性差及材料要求高等問題，擬通過特異性熒光定量PCR引物篩選及其反應(yīng)體系的優(yōu)化等步驟，建立一種快速準(zhǔn)確的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分子檢測(cè)方法及快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、高效的檢測(cè)小菜蛾Bt抗性的檢測(cè)試劑盒，為小菜蛾Bt抗性有效檢測(cè)提供有效工具。
[0007] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供了一種用于檢測(cè)小菜蛾對(duì)Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性的PCR引物對(duì)，所述引物對(duì)的序列:正向引物如SEQ ID N0.2所示，反向引物如SEQ ID N0.3所示。
[0008]所述特異性引物對(duì)包括以小菜蛾中腸ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族中ABCC亞家族ABCC3基因的保守片段區(qū)為靶目標(biāo)序列設(shè)計(jì)得到的靶標(biāo)基因特異性引物對(duì)以及已報(bào)道的小菜蛾持家基因核糖體蛋白L32基因的保守片段區(qū)為靶目標(biāo)序列設(shè)計(jì)得到的內(nèi)參基因L32特異性引物序列。
[0009]本發(fā)明還提供一種用于檢測(cè)小菜蛾對(duì)Bt殺蟲蛋白CryIAc抗性的PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述試劑盒包含所述的引物對(duì)。進(jìn)一步的，本試劑盒中還包括本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表的(Fu et al., 2013)以小菜蛾持家基因核糖體蛋白L32基因的保守片段區(qū)為靶目標(biāo)序列設(shè)計(jì)得到的內(nèi)參基因L32特異性引物序列(正向引物:5' -CCAATTTACCGCCCTACC-3';反向引物:5' -TACCCTGTTGTCAATACCTCT-3')，用于校正樣品間實(shí)驗(yàn)誤差。本試劑盒中含有的逆轉(zhuǎn)錄酶，DNase, RNase抑制劑，dNTP混合物，特異性引物，MgCl2溶液，熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶，突光定量反應(yīng)液，Buffer緩沖液，RNase-free水等實(shí)驗(yàn)組分對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說屬于公知常識(shí)，可根據(jù)自身需要選用。此外，本試劑盒還包括符合該試劑盒要求的陽性對(duì)照及陰性對(duì)照樣品。
[0010]本發(fā)明進(jìn)而提供一種檢測(cè)小菜蛾對(duì)Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性的PCR檢測(cè)方法，其特征在于:其采用如所述的引物對(duì)或所述的試劑盒進(jìn)行PCR。
[0011] 具體包括以下步驟:
(1)提取待測(cè)小菜蛾的RNA樣品，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA模板；
(2)將所述cDNA模板加入到含有所述引物對(duì)的PCR反應(yīng)液中得到PCR反應(yīng)體系；
(3)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)；
其中優(yōu)選地，所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的擴(kuò)增程序?yàn)?94°C預(yù)變性15 min，94°C變性
15sec，55°C退火 30 sec，72°C延伸 32 sec，40 個(gè)循環(huán)。
[0012]PCR過程完成后，按0.rc.S-1的升溫速率從72°C升至95°C進(jìn)行融解曲線的分析驗(yàn)證，具體過程為:95°C進(jìn)行15 S，然后60°C進(jìn)行I min，接著95°C進(jìn)行30 S，最后再在60°C進(jìn)行15 S。
[0013]優(yōu)選地，所述待測(cè)小菜蛾的RNA樣品為小菜蛾4齡幼蟲中腸的RNA樣品。
[0014]優(yōu)選的，本發(fā)明使用ABI Prism 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。
[0015]本發(fā)明使用ABI Prism 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。
[0016]ABI Prism 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行結(jié)果分析時(shí)，基線設(shè)置取3_15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)。為便于比較，樣品、陰性及陽性對(duì)照的所有擴(kuò)增曲線的閾值均設(shè)定為0.50153(位于擴(kuò)增曲線對(duì)數(shù)期中間位置，其它儀器基線和閾值設(shè)定可根據(jù)儀器作相應(yīng)調(diào)整)。
[0017]對(duì)上述步驟中熒光定量PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，在特定的波長(zhǎng)條件下，根據(jù)熒光檢測(cè)的抗敏樣品間各自靶標(biāo)基因ABCC3與內(nèi)參基因L32之間的Ct值差值(即Δ Ct值)判斷結(jié)果，若所述待測(cè)小菜蛾樣品產(chǎn)生典型的“S”型擴(kuò)增曲線及單峰融解曲線，且Λ Ct值> 7，則說明所述小菜蛾待測(cè)樣品對(duì)Bt殺蟲蛋白CrylAc產(chǎn)生抗性；若八Ct值< 6，則說明待測(cè)小菜蛾樣品未對(duì)Bt殺蟲蛋白CrylAc產(chǎn)生抗性。若Λ Ct值位于兩者中間，則建議重做，樣品對(duì)Bt殺蟲蛋白抗性產(chǎn)生與否視重做結(jié)果而定。
[0018]所述待測(cè)小菜蛾的RNA樣品為小菜蛾4齡幼蟲中腸的RNA樣品。
[0019]本發(fā)明系選擇小菜蛾中腸ABCC3基因的保守片段區(qū)為靶目標(biāo)序列，根據(jù)該基因特點(diǎn)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物的設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，再配合已發(fā)表的內(nèi)參基因L32特異性引物，建立了一種用于小菜蛾Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒及其檢測(cè)方法。較之現(xiàn)有生物測(cè)定技術(shù)而言，本發(fā)明所提供的小菜蛾Bt殺蟲蛋白抗性檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及其使用方法，具有如下效果及優(yōu)點(diǎn):
(I)特異性更強(qiáng)。本發(fā)明是利用小菜蛾中腸ABCC3基因的保守片段區(qū)為靶目標(biāo)序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，從而在PCR過程中可以對(duì)靶目標(biāo)序列進(jìn)行特異性擴(kuò)增，通過將未知樣品和陽性對(duì)照間的ABCCl基因表達(dá)量差異進(jìn)行比對(duì)即可測(cè)定未知樣品是否產(chǎn)生抗性；而傳統(tǒng)的生測(cè)方法是通過觀察判斷試蟲在不同Bt殺蟲蛋白CrylAc濃度下死亡情況來粗略判斷小菜蛾是否對(duì)Bt殺蟲蛋白CrylAc產(chǎn)生抗性，其判斷較之基因檢測(cè)特異性差得多。
[0020](2)靈敏度和準(zhǔn)確度更高。本發(fā)明中涉及的小菜蛾Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性檢測(cè)方法是通過檢測(cè)PCR實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度確定抗性相關(guān)基因表達(dá)量來判斷小菜蛾是否產(chǎn)生抗性，而實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度的儀器檢測(cè)，相對(duì)于傳統(tǒng)的通過人為觀察判斷試蟲在不同Bt殺蟲蛋白CrylAc濃度下死亡情況來粗略判斷小菜蛾是否對(duì)Bt殺蟲蛋白CrylAc產(chǎn)生抗性這種誤判率及重復(fù)性較差的生測(cè)方法，抗性檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度大大提高。
[0021](3)檢測(cè)周期短。生測(cè)過程至少需要48小時(shí)的時(shí)間，而本發(fā)明方法僅需3小時(shí)即可完成判斷，一次可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品，特別適合于大批量樣品的快速檢測(cè)。
[0022](4)材料要求少。小菜蛾毒力生物測(cè)定中測(cè)定一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線至少需要約200頭標(biāo)準(zhǔn)試蟲,這些試蟲的飼養(yǎng)及挑取需要花費(fèi)一定的人力、物力和財(cái)力。而本發(fā)明對(duì)一個(gè)種群的檢測(cè)只需要幾十頭左右的4齡試蟲，甚至可以檢測(cè)單頭4齡試蟲。
[0023]綜上所述，本發(fā)明的方法可替代傳統(tǒng)的生物測(cè)定方法，它可以準(zhǔn)確、快速、特異、方便的檢出供試小菜蛾是否具有Bt抗性，對(duì)田間小菜蛾Bt抗性的監(jiān)測(cè)監(jiān)控具有重要意義。
[0024]尤其需要指出的是，本發(fā)明人之前研究認(rèn)為利用PCR技術(shù)檢測(cè)小菜蛾中腸膜結(jié)合形式的堿性磷酸酶基因(mALP)表達(dá)量變化可作為小菜蛾Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性的好方法(已申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專利，專利號(hào)201210273591.0)，然而，與mALP相比，ABCC3基因表達(dá)量變化與小菜蛾Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性性狀的連鎖程度更高，那么在不同抗性倍數(shù)小菜蛾中ABCC3基因表達(dá)量變化要比mALP表達(dá)量變化更為靈敏，因此，與該發(fā)明專利內(nèi)容相比，本發(fā)明專利所利用的檢測(cè)ABCC3基因表達(dá)量變化的方法更能反應(yīng)不同抗性基因頻率水平與抗性倍數(shù)之間的關(guān)系，從而能更好的檢測(cè)形成不同程度抗性的田間小菜蛾種群。
[0025]本發(fā)明所提供的小菜蛾對(duì)Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性的PCR檢測(cè)方法，需人力及樣品量少，檢測(cè)數(shù)量大的特點(diǎn)，而且靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速簡(jiǎn)便和準(zhǔn)確可靠，因而能有效的檢測(cè)小菜蛾對(duì)Bt殺蟲蛋白的抗性，適合于小菜蛾對(duì)Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性的早期快速診斷，同時(shí)可用于田間小菜蛾Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性的實(shí)時(shí)監(jiān)控和預(yù)警預(yù)報(bào)，應(yīng)用前景廣泛。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為本發(fā)明中所用特異性引物對(duì)擴(kuò)增小菜蛾中腸ABCC3基因cDNA片段序列。
[0027]圖2為圖1中目的基因ABCC3和內(nèi)參基因L32在Bt殺蟲蛋白CryIAc敏感的4齡小菜蛾幼蟲中腸cDNA樣品PCR擴(kuò)增片段的2%瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，1:目的基因ABCC3的PCR擴(kuò)增片段(Illbp) ;2:內(nèi)參基因L32的PCR擴(kuò)增片段(120bp) ；M =Marker I。
[0028]圖3為標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR所得到的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線。其中，橫坐標(biāo)代表循環(huán)數(shù)(Cycle)，縱坐標(biāo)代表第η次PCR循環(huán)時(shí)的熒光信號(hào)強(qiáng)度(Rn)，圖中平行且遠(yuǎn)離橫坐標(biāo)的直線代表熒光閾值，字母代表樣品cDNA的5個(gè)2X梯度稀釋濃度。
[0029]圖4是根據(jù)圖3中得出的數(shù)據(jù)繪制的熒光定量PCR所得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中，橫坐標(biāo)代表標(biāo)準(zhǔn)樣品cDNA濃度的對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)代表循環(huán)閾值即Ct值。
[0030]圖5為實(shí)施例1的檢測(cè)小菜蛾Bt殺蟲蛋白抗性的熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果。其中，A:對(duì)Bt殺蟲蛋白CrylAc敏感小菜蛾種群DBMlAc-S的4齡幼蟲中腸cDNA樣品；B:對(duì)Bt殺蟲蛋白CrylAc產(chǎn)生抗性小菜蛾種群SZ-R的4齡幼蟲中腸cDNA的樣品。
[0031]圖6為實(shí)施例2的檢測(cè)小菜蛾Bt抗性的熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果。其中，A:實(shí)施例1中對(duì)Bt敏感的小菜蛾種群DBMlAc-S的4齡幼蟲中腸cDNA陰性對(duì)照樣品；B:實(shí)施例1中對(duì)Bt殺蟲蛋白CrylAc產(chǎn)生抗性的小菜蛾種群SZ-R的4齡幼蟲中腸cDNA陽性對(duì)照樣品；C:對(duì)Btk制劑產(chǎn)生抗性的小菜蛾種群SH-R的4齡幼蟲中腸cDNA待測(cè)樣品；D:對(duì)Bt殺蟲蛋白CrylAc產(chǎn)生抗性的近等基因系小菜蛾種群DBMlAc-R的4齡幼蟲中腸cDNA待測(cè)樣品；E:對(duì)Bt殺蟲蛋白CrylAc產(chǎn)生抗性的小菜蛾種群NIL-R的4齡幼蟲中腸cDNA待測(cè)樣品。
[0032]

【具體實(shí)施方式】
[0033]以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述與說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。
[0034]實(shí)驗(yàn)前材料樣品準(zhǔn)備:
(1)小菜蛾Bt殺蟲蛋白敏感種群(DBMlAc-S):該小菜蛾種群在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所昆蟲組昆蟲飼養(yǎng)室內(nèi)用無蟲甘藍(lán)苗進(jìn)行繼代飼養(yǎng)，期間未接觸任何有毒殺蟲劑，對(duì)Bt制劑及其產(chǎn)生的毒素敏感；記載過小菜蛾Bt敏感種群(DBMlAc-S)的非專利文獻(xiàn)是:Yang, Z.X., ffu, Q.J., Wang, S.L., Chang, X.L., Wang, J.H., Guo, Z.J., Lei,Y.Y., Xu, B.Y., Zhang, Y.J.(2012) Express1n of cadherin, aminopeptidase N andalkaline phosphatase genes in CrylAc-susceptible and CryIAc~resistant strainsof Plutella xylostella (L.).Journal of Applied Entomology, 136, 539 - 548.(2)小菜蛾Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性種群(DBMlAc-R):該種群在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花丼研究所昆蟲組昆蟲飼養(yǎng)室內(nèi)用Bt殺蟲蛋白CrylAc (提取方法參考Luo, K.，Banks,D., Adang, M.J.(1999) Toxicity, binding, and permeability analyses of fourBacillus thuringiensis Cryl δ-endotoxins using brush border membrane vesiclesof Spodoptera exigua and Spodoptera frugiper da.Applied and EnvironmentalMicrob1logy, 65，457 - 464.)進(jìn)行抗性汰選,連續(xù)飼養(yǎng)至今；記載過小菜蛾Bt殺蟲蛋白 CrylAc 抗性種群(DBMlAc-R)的非專利文獻(xiàn)是:Yang，Z.X.，ffu, Q.J.，Wang, S.L.，Chang, X.L., Wang, J.H., Guo, Z.J., Lei, Y.Y., Xu, B.Y., Zhang, Y.J.(2012)Express1n of cadherin, aminopeptidase N and alkaline phosphatase genes inCrylAc-susceptible and CryIAc~resistant strains of Plutella xylostella (L.).Journal of Applied Entomology，136, 539 - 548.(3)小菜蛾Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性近等基因系種群(NIL-R):該種群在敏感種群DBMlAc-S和抗性種群DBMlAc-R經(jīng)過多達(dá)7次的多組單對(duì)雜交、回交及汰選后建立的與DBMlAc-S敏感種群遺傳背景高度相似的近等基因系CrylAc抗性種群。該種群建成后在本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用Bt殺蟲蛋白CrylAc進(jìn)行持續(xù)抗性汰選，連續(xù)飼養(yǎng)至今；記載過該小菜蛾Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性近等基因系種群(NIL-R)的非專利文獻(xiàn)是:Zhu，X.，Lei, Y., Yang,Y., Baxter, S.ff., Li, J., ffu, Q., Wang, S., Xie, ff., Guo, Z., Fu, ff., Zhang, Y.(2014) Construct1n and characterisat1n of near-1sogenic Plutella xylostella(Lepidoptera: Plutellidae) strains resistant to CrylAc toxin.Pest ManagementScience, DO1: 10.1002/ps.3785.(4)深圳汰選種群(SZ-R，又叫T2-R):該種群是2003年在廣東省深圳田間采集的小菜蛾種群，在本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用Bt CrylAc殺蟲蛋白浸葉汰選至今；
(5)上海汰選種群(SH-R):該種群是2005年在上海田間采集的小菜蛾種群，在本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用Btk制劑(購(gòu)自湖北省農(nóng)科院Bt研究開發(fā)中心)浸葉進(jìn)行抗性選育至今。
[0035]以上所用的5個(gè)種群:小菜蛾Bt殺蟲蛋白敏感種群(DBMlAc-S)、小菜蛾Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性種群(DBMlAc-R)、小菜蛾Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性近等基因系種群(NIL-R)、深圳汰選種群(SZ-R)和上海汰選種群(SH-R)，本實(shí)驗(yàn)室均有保存，可向公眾發(fā)放用于實(shí)驗(yàn)研究。
[0036]上述五個(gè)小菜蛾種群均在室內(nèi)進(jìn)行隔離飼養(yǎng)，將蛹放入成蟲飼養(yǎng)籠中(R=10 cm,L=40 cm)，籠四周以80目的紗網(wǎng)包圍，成蟲羽化后，籠內(nèi)掛浸過10%蜂蜜糖水的脫脂棉球一個(gè)，為成蟲補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，讓其在甘藍(lán)苗上產(chǎn)卵，卵孵化后再轉(zhuǎn)入新鮮的甘藍(lán)苗上飼養(yǎng)。飼養(yǎng)溫度是25±1°C，相對(duì)濕度為60%-70%，光周期為光照:黑暗=16h:8h。
[0037]實(shí)施例1
利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)DBMlAc-S及SZ-R的4齡幼蟲中腸cDNA樣品的檢測(cè)及本檢測(cè)試劑盒和其使用方法的建立。
[0038]1.以小菜蛾中腸ABCC3基因的保守片段區(qū)為靶目標(biāo)序列(SEQ ID N0.1)，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)特異性熒光定量引物序列如下:
正向引物(qCC3-F):5/ -TCAACCGCTTCACCAAGGACAT-3' (SEQ ID N0.2)；
反向引物(qCC3-R):5/ -CGGCGTTCAGCACCAGGAT-3' (SEQ ID N0.3)；
該特異性引物擴(kuò)增片段序列如圖1所示，其擴(kuò)增特異性如圖2(其中，1:目的基因ABCC3的PCR擴(kuò)增片段；2:內(nèi)參基因L32的PCR擴(kuò)增片段；M =Marker I。)所示，從圖中可看出該引物擴(kuò)增特異性高，擴(kuò)增條帶單一，大小為lllbp，符合實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)要求。此外，從圖中也可看出本實(shí)驗(yàn)中使用的內(nèi)參基因L32的引物擴(kuò)增特異性也很高，擴(kuò)增條帶單一，大小為120bp，也符合實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)要求。
[0039]2.提取兩種群4齡小菜蛾中腸RNA樣品，然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA模板，在包括步驟I所述特異性引物的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行反應(yīng)；
(I)小菜蛾中腸RNA的提取步驟如下:
①取敏感、抗性種群小菜蛾4齡幼蟲，使用解剖鑷冰上取出中腸組織，并使用0.7%NaCl溶液漂洗干凈；
②將中腸組織放入玻璃勻漿器內(nèi)，并向勻漿器中加入Iml的Trizol試劑充分勻漿，勻漿后將液體倒入1.5ml離心管內(nèi)，室溫放置5min ；
③向離心管中加入0.2 ml的氯仿,劇烈振蕩15 s,然后室溫放置3 min ；
④在4°C條件下12，000rpm離心15 min ；
⑤吸取上清液轉(zhuǎn)入到一個(gè)新的離心管中，加入0.5 ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10 min ；
⑥在4°C條件下12，000rpm離心10 min ；⑦棄上清，然后加入Iml 75%的乙醇,輕輕洗漆沉淀，4°C,7, 500 rpm離心5 min,棄上清；
⑧RNA沉淀自然干燥后，加入約50μ1DEPC水溶解，冰上保存，測(cè)OD26(l/OD28(l值，電泳檢測(cè)條帶，選擇符合條件的RNA樣品進(jìn)行以下反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)或_80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0040](2)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板:
下面以日本TaKaRa公司去基因組的PrimeScript? RT試劑盒為例，實(shí)驗(yàn)過程如下:
①使用前將試劑盒各組分解凍并離心混勻；
②基因組DNA的去除反應(yīng):

【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測(cè)小菜蛾對(duì)Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性的PCR引物對(duì)，其特征在于: 所述引物對(duì)的序列為:正向引物如SEQ ID N0.2所示，反向引物如SEQ ID N0.3所示。
2.一種用于檢測(cè)小菜蛾對(duì)Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性的PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于: 所述試劑盒包含權(quán)利要求1所述的引物對(duì)。
3.一種檢測(cè)小菜蛾對(duì)Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性的PCR檢測(cè)方法，其特征在于: 其采用如權(quán)利要求1所述的引物對(duì)或權(quán)利要求2所述的試劑盒進(jìn)行PCR。
4.如權(quán)利要求3所述的檢測(cè)小菜蛾對(duì)Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性的PCR檢測(cè)方法，具體包括以下步驟: (1)提取待測(cè)小菜蛾的RNA樣品，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA模板； (2)將所述cDNA模板加入到含有所述引物對(duì)的PCR反應(yīng)液中得到PCR反應(yīng)體系； (3)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。
5.如權(quán)利要求4所述的檢測(cè)小菜蛾對(duì)Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性的PCR檢測(cè)方法，其中，所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的擴(kuò)增程序?yàn)?94°C預(yù)變性15 min，94°C變性15 sec，55°C退火30 sec，72°C延伸 32 sec，40 個(gè)循環(huán)。
6.如權(quán)利要求4 所述的檢測(cè)小菜蛾對(duì)Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性的PCR檢測(cè)方法，其中，PCR過程完成后，按0.rc-s-1的升溫速率從72°C升至95°C進(jìn)行融解曲線的分析驗(yàn)證，具體過程為:95°C進(jìn)行15 S，然后60°C進(jìn)行I min，接著95°C進(jìn)行30 S，最后再在60°C進(jìn)行15s ； 若所述待測(cè)小菜蛾的樣品產(chǎn)生典型的“S”型擴(kuò)增曲線及單峰融解曲線，且Λ Ct值[Ct(目的基因ABCC3—內(nèi)參基因L32) ] 7，則說明所述小菜蛾待測(cè)的樣品對(duì)Bt殺蟲蛋白CrylAc產(chǎn)生抗性；若厶Ct值[Ct值(@ Μ?Η ABCC3-rt#*HL32)] ( 6，則說明待測(cè)小菜蛾的樣品未對(duì)Bt殺蟲蛋白CrylAc產(chǎn)生抗性。
7.根據(jù)權(quán)利要求4至6任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:所述待測(cè)小菜蛾的RNA樣品為小菜蛾4齡幼蟲中腸的RNA樣品。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104178578SQ201410455046
【公開日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2014年9月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月9日
【發(fā)明者】張友軍, 郭兆將, 康師, 朱勛, 吳青君, 王少麗, 徐寶云, 謝文 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所