一種廣譜抑菌酵母菌及提高其抑菌效果的方法
【專利摘要】一種廣譜抑菌酵母菌及提高其抑菌效果的方法。它涉及一種酵母菌及提高其抑菌效果的方法。其為德爾布有孢圓酵母(Torulaspora delbrueckii)M8，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NO：M 2013277。提高抑菌效果的方法：德爾布有孢圓酵母(Torulaspora delbrueckii)M8用YEPD液體培養基發酵培養，發酵培養分為兩階段，發酵第一階段發酵培養時間為12h，發酵培養溫度為28℃；發酵第二階段發酵培養時間為0.5～1h，發酵培養溫度為60±2℃，并向YEPD液體培養基中投加蛋白酶，蛋白酶選自胰蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶。本發明應用于微生物領域。CCTCC NO：M 20132772013.06.23
【專利說明】一種廣譜抑菌酵母菌及提高其抑菌效果的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種酵母菌及提高其抑菌效果的方法。
【背景技術】
[0002] 酵母是一種單細胞微生物，屬于高等微生物的真菌類，在有氧和無氧環境下都能 生存，屬于兼性厭氧菌。酵母是人類直接食用量最大的一種微生物。
[0003] 人工合成防腐劑（或農藥）仍是我國對果蔬采摘后病害防治最常用的方法，如抑 霉唑、TBZ等常在糧食栽種及后期處理過程中使用。雖然這類藥劑抑菌效果顯著，但會對環 境造成污染且對人體組織造成嚴重損傷，對人畜無毒無害，并且具有廣譜抑菌效果的綠色 防腐劑的研發迫在眉睫。
【發明內容】
[0004] 本發明是為了解決人工合成防腐劑污染環境、對人體組織造成嚴重損傷等問題， 而提供一種廣譜抑菌酵母菌及提高其抑菌效果的方法。
[0005] 本發明廣譜抑菌酵母菌為德爾布有孢圓酵母（Torulasporadelbrueckii)M8,保 藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCCNO:M2013277。
[0006] 提高上述廣譜抑菌酵母菌抑菌效果的方法：德爾布有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii)M8用YEH)液體培養基發酵培養，發酵培養分為兩階段，發酵第一階段發酵培 養時間為12h，發酵培養溫度為28°C;發酵第二階段發酵培養時間為0. 5?lh，發酵培養溫 度為60±2°C，并向YEH)液體培養基中投加蛋白酶，蛋白酶選自胰蛋白酶、堿性蛋白酶和中 性蛋白酶；
[0007] 其中YEH)液體培養基按比例由Ig酵母膏、2g蛋白胨、2g葡萄糖和IOOmL蒸餾水 組成，YEH)液體培養基pH值為7 ;發酵第二階段投加中性蛋白酶YEH)液體培養基pH值調 節為7,發酵第二階段投加胰蛋白酶YEH)液體培養基pH值調節為8,發酵第二階段投加堿 性蛋白酶YEro液體培養基pH值調節為9。
[0008] 德爾布有孢圓酵母（Torulasporadelbrueckii)M8為圓丘形、單邊芽殖，菌體直徑 為3. 25μm;菌落為圓丘狀、表面光滑、邊緣整齊，白色、不透明、濕潤。
[0009] 德爾布有孢圓酵母（Torulasporadelbrueckii)M8對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、 白色念珠球菌、志賀氏菌、沙門氏菌和枯草芽孢桿菌均具有穩定、優異的抑菌效果。
[0010] 酵母菌生存營養需求簡單，繁殖速度快，不會產生威脅人類和環境安全的有害物 質，而且被人或動物食用后可以促進消化，因此是天然、安全的食品防腐劑和抑菌劑。
[0011] 德爾布有孢圓酵母（Torulasporadelbrueckii)M8能夠在較干燥的果蔬表面生 存，并與病菌競爭營養與空間，對其它抗菌劑影響小；而且所產生抑菌物質多是水果、蔬菜 上的正常菌落成分，對人體安全。
[0012] 德爾布有孢圓酵母（Torulasporadelbrueckii)M8中的抑菌物質可做為天然防腐 劑添加到果汁、牛奶等飲品中，利用其抑菌形成延長產品的保質期
[0013] 德爾布有孢圓酵母（Torulasporadelbrueckii)M8中的可以制成發酵劑，其發酵 產品可以抑制腸道常見致病菌。
[0014] 與用YEro液體培養基發酵培養、發酵培養溫度為28°C，發酵培養時間為13h的德 爾布有孢圓酵母（Torulasporadelbrueckii)M8相比，本發明方法可以提高德爾布有孢圓 酵母（Torulasporadelbrueckii)M8的抑菌效果（抑菌圈直徑）達2倍以上，具有顯著提 尚。
[0015] 廣譜抑菌酵母菌德爾布有孢圓酵母（Torulasporadelbrueckii)M8為德爾布有 抱圓酵母（Torulasporadelbrueckii)，屬于球抱酵母屬（Torulaspora);保藏于中國典型 培養物保藏中心（CCTCC)，保藏地址是武漢大學，保藏日期為2013年6月23日，保藏號為 CCTCCNO：M2013277〇
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016] 圖1是實施例1中對志賀氏菌的抑菌效果圖，圖1中A中加入的是德爾布有孢圓 酵母（Torulasporadelbrueckii)M8,B中加入的是效價為 5IU的Nisin。
[0017] 圖2是實施例1中對大腸桿菌的抑菌效果圖，圖2中A中加入的是德爾布有孢圓 酵母（Torulasporadelbrueckii)M8,B中加入的是效價為 5IU的Nisin。
[0018] 圖3是實施例1中對白色念珠菌的抑菌效果圖，圖3中A中加入的是德爾布有孢 圓酵母（Torulasporadelbrueckii)M8,B中加入的是效價為 5IU的Nisin。
[0019] 圖4是實施例1中對沙門氏菌的抑菌效果圖，圖4中A中加入的是德爾布有孢圓 酵母（Torulasporadelbrueckii)M8,B中加入的是效價為 5IU的Nisin。
[0020] 圖5是實施例1中對枯草芽孢桿菌的抑菌效果圖，圖5中A中加入的是德爾布有 抱圓酵母（Torulasporadelbrueckii)M8,B中加入的是效價為5IU的Nisin。
[0021] 圖6是實施例1中對金黃色葡萄球菌的抑菌效果圖，圖6中A中加入的是德爾布 有抱圓酵母（Torulasporadelbrueckii)M8,B中加入的是效價為5IU的Nisin。
[0022] 圖7是實施例2①中第二階段不同發酵溫度條件下德爾布有孢圓酵母 (Torulasporadelbrueckii)M8對志賀氏菌的抑菌效果圖，圖7中A中德爾布有孢圓酵母 (Torulasporadelbrueckii)M8發酵第二階段溫度為28*€，圖7中B中德爾布有孢圓酵母 (Torulasporadelbrueckii)M8發酵第二階段溫度為6(TC，圖7中C中德爾布有孢圓酵母 (Torulasporadelbrueckii)M8 發酵第二階段溫度為 8〇DC。
[0023] 圖8是實施例2①中第二階段不同發酵溫度條件下德爾布有孢圓酵母 (Torulasporadelbrueckii)M8對志賀氏菌的抑菌效果圖，圖8中B1中德爾布有孢圓酵母 (Torulasporadelbrueckii)M8發酵第二階段溫度為10(TC，圖8中C1中德爾布有孢圓酵 母（Torulasporadelbrueckii)M8 發酵第二階段溫度為 120°C。
[0024] 圖9是實施例2①中第二階段不同發酵溫度條件下德爾布有孢圓酵母 (Torulasporadelbrueckii)M8對大腸桿菌的抑菌效果圖，圖9中A中德爾布有抱圓酵母 (Torulasporadelbrueckii)M8發酵第二階段溫度為28*€，圖9中B中德爾布有孢圓酵母 (Torulasporadelbrueckii)M8發酵第二階段溫度為6(TC，圖9中C中德爾布有孢圓酵母 (Torulasporadelbrueckii)M8發酵第二階段溫度為8(TC，圖9中D中德爾布有孢圓酵母 (Torulasporadelbrueckii)M8 發酵第二階段溫度為 10〇DC。
[0025] 圖10是實施例2①中第二階段不同發酵溫度條件下德爾布有孢圓酵母 (Torulasporadelbrueckii)M8對大腸桿菌的抑菌效果圖，圖10中A中德爾布有抱圓酵母 (Torulasporadelbrueckii)M8發酵第二階段溫度為28*€，圖10中E中德爾布有孢圓酵母 (Torulasporadelbrueckii)M8發酵第二階段溫度為10(TC，圖10中F中德爾布有孢圓酵 母（Torulasporadelbrueckii)M8 發酵第二階段溫度為 120°C。
[0026] 圖11是實施例2②中第二階段不同發酵pH條件下德爾布有孢圓酵母 (Torulasporadelbrueckii)M8對志賀氏菌的抑菌效果圖，圖11中A中德爾布有孢圓酵 母（Torulasporadelbrueckii)M8發酵第二階段pH值為7,圖11中B中德爾布有孢圓酵 母（Torulasporadelbrueckii)M8發酵第二階段pH值為4,圖11中C中德爾布有孢圓酵 母（Torulasporadelbrueckii)M8發酵第二階段pH值為6,圖11中D中德爾布有孢圓酵母 (Torulasporadelbrueckii)M8 發酵第二階段pH值為 8。
[0027] 圖12是實施例2②中第二階段不同發酵pH條件下德爾布有孢圓酵母 (Torulasporadelbrueckii)M8對志賀氏菌的抑菌效果圖，圖11中A中德爾布有孢圓酵母 (Torulasporadelbrueckii)M8發酵第二階段pH值為7,圖11中E中德爾布有孢圓酵母 (Torulasporadelbrueckii)M8發酵第二階段pH值為10,圖11中F中德爾布有孢圓酵母 (Torulasporadelbrueckii)M8 發酵第二階段pH值為 12。
[0028] 圖13是實施例2②中第二階段不同發酵pH條件下德爾布有孢圓酵母 (Torulasporadelbrueckii)M8對大腸桿菌的抑菌效果圖，圖13中A中德爾布有孢圓酵 母（Torulasporadelbrueckii)M8發酵第二階段pH值為7,圖13中B中德爾布有孢圓酵 母（Torulasporadelbrueckii)M8發酵第二階段pH值為4,圖13中C中德爾布有孢圓酵 母（Torulasporadelbrueckii)M8發酵第二階段pH值為6,圖13中D中德爾布有孢圓酵母 (Torulasporadelbrueckii)M8 發酵第二階段pH值為 8。
[0029] 圖14是實施例2②中第二階段不同發酵pH條件下德爾布有孢圓酵母 (Torulasporadelbrueckii)M8對大腸桿菌的抑菌效果圖，圖14中A中德爾布有抱圓酵母 (Torulasporadelbrueckii)M8發酵第二階段pH值為7,圖14中E中德爾布有孢圓酵母 (Torulasporadelbrueckii)M8發酵第二階段pH值為10,圖14中F中德爾布有孢圓酵母 (Torulasporadelbrueckii)M8 發酵第二階段pH值為 12。
[0030] 圖15是實施例2③中第二階段投加不同蛋白酶條件下德爾布有孢圓酵母 (Torulasporadelbrueckii)M8對志賀氏菌的抑菌效果圖，圖15中A中德爾布有抱圓酵母 (Torulasporadelbrueckii)M8發酵第二階段未加入蛋白酶，圖15中B中德爾布有孢圓酵 母（Torulasporadelbrueckii)M8發酵第二階段加入胰蛋白酶，圖15中C中德爾布有孢圓 酵母（Torulasporadelbrueckii)M8發酵第二階段加入中性蛋白酶，圖15中D中德爾布有 孢圓酵母（Torulasporadelbrueckii)M8發酵第二階段加入堿性蛋白酶。
[0031] 圖16是實施例2③中第二階段投加不同蛋白酶條件下德爾布有孢圓酵母 (Torulasporadelbrueckii)M8對大腸桿菌的抑菌效果圖，圖16中A中德爾布有抱圓酵母 (Torulasporadelbrueckii)M8發酵第二階段未加入蛋白酶，圖16中B中德爾布有孢圓酵 母（Torulasporadelbrueckii)M8發酵第二階段加入胰蛋白酶，圖16中C中德爾布有孢圓 酵母（Torulasporadelbrueckii)M8發酵第二階段加入中性蛋白酶，圖16中D中德爾布有 孢圓酵母（Torulasporadelbrueckii)M8發酵第二階段加入堿性蛋白酶。
[0032] 圖17為德爾布有孢圓酵母（Torulasporadelbrueckii)M8和相近菌株進行同源 性比對構建的系統發育樹圖。
【具體實施方式】
[0033] 本發明技術方案不局限于以下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的 任意組合。
【具體實施方式】 [0034] 一：本實施方式廣譜抑菌酵母菌為德爾布有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii)M8,保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCCNO:M2013277。
[0035] 德爾布有孢圓酵母（Torulasporadelbrueckii)M8米集自西藏，從我國傳統發酵 乳制品西藏靈菇中分離獲得。將西藏靈菇置于10%的脫脂乳中傳代培養，活化后將其發 酵液涂于含氯霉素的YEro固體培養基中劃線分離得到德爾布有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii)M8〇
[0036]德爾布有抱圓酵母（Torulasporadelbrueckii)M8 的 26srDNAD1/D2 區喊基長 度為566bp，堿基序列如SEQIDNO:1所示，18SrDNA長度為1192bp，堿基序列如SEQID NO:2所示；經26SrDNAD1/D2區序列和18SrDNA序列比對，并通過微生物形態和生理 生化指標鑒定，確認廣譜抑菌酵母菌M8為球孢酵母屬（Torulaspora)德爾布有孢圓酵母 (Torulasporadelbrueckii)，與TorulasporadelbrueckiiCBS1146 同源性最為接近。
[0037]TorulasporadelbrueckiiCBS1146 的生化試驗結果如表 1 所不，Torulaspora delbrueckiiCBS1146菌落為黃色或紫色。
[0038]表1
[0039]
【權利要求】
1. 一種廣譜抑菌酵母菌，其為德爾布有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii)M8,保藏 于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NO :M 2013277。
2. 提高權利要求1所述廣譜抑菌酵母菌抑菌效果的方法，德爾布有孢圓酵母 (Torulaspora delbrueckii)M8用YEH)液體培養基發酵培養，其特征在于發酵培養分為兩 階段，發酵第一階段發酵培養時間為12h，發酵培養溫度為28°C ;發酵第二階段發酵培養時 間為0. 5?lh，發酵培養溫度為60 ± 2°C，并向YEH)液體培養基中投加蛋白酶，蛋白酶選自 胰蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶； 其中YEH)液體培養基按比例由lg酵母膏、2g蛋白胨、2g葡萄糖和100mL蒸餾水組成， YEH)液體培養基pH值為7 ;發酵第二階段投加中性蛋白酶YEH)液體培養基pH值調節為7， 發酵第二階段投加胰蛋白酶YEro液體培養基pH值調節為8,發酵第二階段投加堿性蛋白酶 YEH)液體培養基pH值調節為9。
3. 根據權利要求2所述的提高廣譜抑菌酵母菌抑菌效果的方法，所述發酵第二階段每 升YEH)液體培養基中投加1. 5mg蛋白酶，胰蛋白酶的酶活力為250U/mg、堿性蛋白酶的酶活 力為200U/mg、中性蛋白酶的酶活力為60U/mg。
【文檔編號】C12R1/645GK104263662SQ201410449239
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月5日 優先權日:2014年4月1日
【發明者】孟利, 劉峰, 平文祥, 郝悅, 雷虹, 孫萌萌, 魏微 申請人:黑龍江大學