一種檢測或輔助檢測疫霉屬菌的方法
【專利摘要】本發明提供一種檢測或輔助檢測疫霉屬菌的方法，涉及生物【技術領域】。本發明方法包括如下步驟：將疫霉菌屬各菌的DNA條形碼序列進行多重序列比對，找出每個種的特異性堿基位點，同時得到一致性序列；所述每個種的特異性堿基位點包括差異性堿基位點、SNP位點；將待測菌的DNA條形碼序列與一致性序列進行比對，調整長度得到定位序列；將定位序列與每個種的特異性堿基位點進行比對，對待測菌與各種的堿基相似度進行打分，取最大值，待測菌隸屬于最大值對應的種。本發能夠鑒定疫霉屬菌各菌，操作簡單、準確性高、耗時短、特異性好。
【專利說明】一種檢測或輔助檢測疫霉屬菌的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，具體涉及一種檢測或輔助檢測疫霉屬菌的方法。
【背景技術】
[0002]後霉舊iPhytophthora de Bary)是一類世界性分布的重要植物病原菌，其屬 、良霉MiiPhytophthora)，Phytophthora 來自于希臘語，Phyto 意思為植物(plant),
phthora意思為破壞者(destroyer ),該屬的大多數種確實都對其寄主植物具有嚴重的危害性和破壞性。由于疫霉菌對寄主植物的破壞性強，危害性大，往往導致農業生產的嚴重損失和森林生態的破壞，因而由疫霉菌所致的植物病害通常稱為“疫病”。全世界，每年由疫病造成的農業損失高達數百億美元，僅澳大利亞每年因疫病造成的損失就達20多億美元。19世紀中葉，由致病疫霉引起的馬鈴薯晚疫病在歐洲愛爾蘭地區暴發性流行，導致馬鈴薯幾乎絕產，造成了愛爾蘭近百萬人餓死，約150萬人逃荒或移居他鄉，成為人類史舉世聞名的“愛爾蘭大饑荒”。至今，由致病疫霉引起的馬鈴薯和番茄的晚疫病仍然是世界范圍內流行的一類重要病害，每年造成的損失高達30億美元；由大豆疫霉iPhytophthora soJae)引起的大豆疫霉根腐病是大豆上極具毀滅性的病害之一。該病1948年首次發現于美國印第安納州和俄亥俄州，隨后在許多大豆生產國相繼發生。目前，大豆疫霉根腐病在亞洲、非洲、歐洲、南北美洲和大洋洲的二十多個國家的大豆主產區均有發生，每年給全球大豆生產造成的損失已達近10億美元，是世界性重要植物檢疫對象。櫟樹疫霉是近年來新發現的一種為害林木和觀賞植物的毀滅性真菌病害，可在短期內造成寄主植物大量死亡，美國西海岸硬葉闊葉林中成千上萬的櫟樹、石櫟枯死，是近年來發生歐美地區的一種毀滅性林木病害，其對美國及歐洲的許多國家在林產品貿易上造成了巨大的經濟損失，該病害在我國沒有發生，也是禁止進境的檢疫性有害生物。雪松疫霉則會導致樹木的針葉枯黃、極易脫落，根末端呈雞爪狀，根部樹皮易剝離，樹干形成層變褐色，此病干旱季節很少發生，但在多雨季節，樹木一旦表現出發病癥狀，病情發展就會非常迅速。丁香疫霉寄主范圍廣，主要為害柑橘、蘋果、桃、梨、火棘、丁香、歐洲板栗、橡樹等14個科29個屬的植物，引起寄主根、莖、葉、果實多種病害，是重要的植物病原菌。另外，惡疫霉0°.cactorum Schroter)、樟備霉 iP.cinnamomi Rands)、芒麻疫霉(/I boehmeriae Sawada)和辣椒疫霉 0°.capsiciLeonian)等都是重要的植物病原菌，可引起許多重要經濟作物的嚴重病害。在我國國家質檢總局2007年發布實施的《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》中，一共有435種有害生物，其中僅疫霉病菌就列有10種。因此，無論在歷史上，還是在當今社會，無論從經濟上，還是從生態環境上來看，疫霉菌及其所引起的病害對人類都具有十分重要的影響。
[0003]對于疫霉菌的檢測，目前除大豆疫病菌采用實時熒光PCR檢測和土壤誘集外，其他主要采用形態學鑒定方法。但是，形態學鑒定方法耗時長、準確性不高、對培養環境要求較聞。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種檢測或輔助檢測疫霉屬菌的方法，該方法能夠鑒定疫霉屬菌各菌，操作簡單、準確性高、耗時短、特異性好。
[0005]本發明的目的采用如下技術方案實現。
[0006]一種檢測或輔助檢測疫霉屬菌的方法，包括如下步驟:
(1)下載已經公開的疫霉菌屬菌的DNA條形碼序列；
(2)將疫霉菌屬各菌的DNA條形碼序列進行多重序列比對，找出每個種的特異性堿基位點，同時得到一致性序列；所述每個種的特異性堿基位點包括差異性堿基位點、SNP位點，所述差異性堿基位點是指DNA條形碼序列在種內相同、種間不同的堿基位點，所述SNP位點為種內各菌株DNA條形碼序列分別與屬內除自身菌株外其他菌株DNA條形碼序列均不同的喊基位點；
(3)將待測菌的DNA條形碼序列與一致性序列進行比對，在缺失位點插入調整待測菌的DNA條形碼序列長度等同于一致性序列，調整長度后的序列為定位序列；
(4)將定位序列與每個種的特異性堿基位點進行比對，按照函數
【權利要求】
1.一種檢測或輔助檢測疫霉屬菌的方法，包括如下步驟: (O下載已經公開的疫霉菌屬菌的DNA條形碼序列； (2)將疫霉菌屬各菌的DNA條形碼序列進行多重序列比對，找出每個種的特異性堿基位點，同時得到一致性序列；所述每個種的特異性堿基位點包括差異性堿基位點、SNP位點，所述差異性堿基位點是指DNA條形碼序列在種內相同、種間不同的堿基位點，所述SNP位點為種內各菌株DNA條形碼序列分別與屬內除自身菌株外其他菌株DNA條形碼序列均不同的喊基位點； (3)將待測菌的DNA條形碼序列與一致性序列進行比對，在缺失位點插入調整待測菌的DNA條形碼序列長度等同于一致性序列，調整長度后的序列為定位序列； (4)將定位序列與每個種的特異性堿基位點進行比對，按照函數
對待測菌與各種的堿基相似度進行打分，其中score (i)表示定位序列與i種的特異性堿基位點比對得分值，i表示疫霉菌屬的某個種，j表示定位序列中的堿基位點，Pij表示定位序列在堿基位點j處的分值，當j為SNP位點時,如果定位序列在j處堿基與SNP位點堿基相同，則pij為3，否則pij為-3 ;當j為差異性堿基位點時，如果定位序列在j處堿基與差異性堿基位點堿基相同時，Pij為1，否則Pij為-1 ;當j為其他位點時，Pij為O ;所述:1py為所有堿基位點的pij分值之和； (5)取score(i)最大值,待測菌隸屬于score (i)最大值對應的種。
2.根據權利要求1所述檢測或輔助檢測疫霉屬菌的方法，其特征在于所述DNA條形碼序列選自cox2編碼基因或ITS編碼基因；所述DNA條形碼序列為28s rRNA、60S RibosomalProtein編碼基因中的一種和cox2編碼基因；所述DNA條形碼序列為28s rRNA,60SRibosomal Protein編碼基因中的一種和ITS編碼基因。
3.根據權利要求1或2所述檢測或輔助檢測疫霉屬菌的方法，其特征在于步驟(2)中所述多重序列比對采用MEGA軟件。
4.根據權利要求3所述檢測或輔助檢測疫霉屬菌的方法，其特征在于步驟(3)將待測菌的DNA條形碼序列與一致性序列進行比對采用Blast軟件。
【文檔編號】C12R1/645GK104178576SQ201410447844
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年9月4日 優先權日:2014年9月4日
【發明者】粟寒, 張勇, 王振華, 楊靜, 繆愛斌, 李彬, 吳翠萍 申請人:江蘇出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心, 中華人民共和國南京出入境檢驗檢疫局, 湖北出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心