提高胚胎耐熱性的培養(yǎng)液及其使用方法
【專利摘要】根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)在解決胚胎耐熱性方面的難題，本發(fā)明提供了一種提高胚胎耐熱性的培養(yǎng)液。培養(yǎng)液以常規(guī)培養(yǎng)液為基質(zhì)，所述常規(guī)培養(yǎng)液為用于胚胎培養(yǎng)的培養(yǎng)液。所述培養(yǎng)液中還包括黃芩苷和谷氨酰胺；所述黃芩苷的濃度為2.0-10.0μg/mL，所述谷氨酰胺的濃度為1.17-1.75mg/ml。通過在胚胎培養(yǎng)液中添加適當(dāng)濃度的黃芩苷和谷氨酰胺制備得到耐熱培養(yǎng)液，不僅降低了經(jīng)濟成本、配制方法簡單，而且大幅度提高了胚胎在熱應(yīng)激時的發(fā)育率和囊胚孵出率。此外，黃芩苷和谷氨酰胺之間存在協(xié)同作用，都可以調(diào)節(jié)HSP70的表達。因此，與單獨的黃芩苷或者谷氨酰胺相比，本發(fā)明制備的耐熱培養(yǎng)液的效果突出，產(chǎn)生了意想不到的技術(shù)效果。
【專利說明】提高胚胎耐熱性的培養(yǎng)液及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于胚胎工程與發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種胚胎的培養(yǎng)液，尤其涉及 一種提高早期胚胎耐熱性的培養(yǎng)液及使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著全球變暖，溫度升高，高溫對人類和動物的影響越發(fā)明顯，夏季高溫以及某些 熱性（使體溫升高的）疾病，都會使動物產(chǎn)生熱應(yīng)激，導(dǎo)致孕畜胚胎死亡，導(dǎo)致其繁殖力降 低甚至不孕，給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成極大的經(jīng)濟損失。
[0003] 傳統(tǒng)的培養(yǎng)液是模擬胚胎在輸卵管中發(fā)育時的環(huán)境配制的，其主要成分包括：水、 離子、能量物質(zhì)、氨基酸、維生素、核酸前體、蛋白質(zhì)、生長因子激素、緩沖系統(tǒng)及氣體，適用 于正常溫度下的胚胎培養(yǎng)。胚胎正常的培養(yǎng)溫度為：牛胚胎38-39°C、小鼠胚胎37°C。在正 常培養(yǎng)溫度下牛胚胎發(fā)育至囊胚的百分率是30. 4±1. 11，孵出率是4. 32±3. 48 ;小鼠胚胎 發(fā)育至囊胚的百分率是81. 35±1. 07,孵出率是61. 88±0. 72。但熱應(yīng)激條件下，用傳統(tǒng)的 培養(yǎng)液培養(yǎng)胚胎，其發(fā)育率會隨著培養(yǎng)溫度升高而顯著降低。這是因為，當(dāng)溫度升高時，培 養(yǎng)液中的某些成分會發(fā)生變化，從而影響胚胎的生長；另外，當(dāng)培養(yǎng)的溫度升高時，胚胎本 身代謝與正常溫度不同，對營養(yǎng)成分的需求也會增加。
[0004] 目前，提高小鼠胚胎耐熱性的培養(yǎng)液有TCZB，其優(yōu)點是可以提高小鼠早期胚胎 在41°C熱應(yīng)激條件下的發(fā)育率。用TCZB培養(yǎng)液培養(yǎng)的小鼠胚胎，其囊胚發(fā)育率及孵出率 (81. 3±4. 5 和 76. 5±7. 6)顯著高于 CZB 對照組（80. 2±5. 4 和 73. 4±6. 2)，說明 TCZB 提 高了小鼠胚胎的熱耐受性。但是，TCZB培養(yǎng)液并不能提高39°C培養(yǎng)小鼠胚胎發(fā)育至囊胚率 及囊胚孵出率。此外，TCZB培養(yǎng)液需要利用原核表達法得到TAT蛋白和小鼠 Hsp70的串聯(lián) 表達體--Tat-Hsp70。然而，這種方法操作復(fù)雜，對技術(shù)的要求很高，成功率低，不具有普 遍適用性。
[0005] 黃苳苷（Baicalin)是從黃苳根中提取分離出來的一種黃酮類化合物，具有顯著 的生物活性（抑菌、利尿、抗炎、抗變態(tài)及解痙作用）和較強的抗癌反應(yīng)等生理效能，其安 胎、解熱作用顯著。黃芩苷的提取方法和藥物用途已經(jīng)公知。發(fā)明專利申請200810167545. 6 公開了"黃芩苷的一種抗中暑用途"，該申請給出了黃芩苷在制備增強人或動物對抗經(jīng)典型 熱損傷能力的藥物和制劑方面的應(yīng)用。黃芩苷在經(jīng)口給藥的條件下，可降低高溫環(huán)境下導(dǎo) 致血液的炎癥反應(yīng)，能夠明顯延長大鼠進入熱倉后中暑發(fā)生時間，并推遲大鼠在熱環(huán)境中 的死亡時間。
[0006] 早期胚胎培養(yǎng)應(yīng)用的是細胞增殖和分化的原理，其發(fā)育對環(huán)境條件極為嚴格。選 擇添加到胚胎培養(yǎng)液中的中藥成分首選不能對胚胎有毒性作用；其次還要能穿過胚胎屏 障--胚胎的透明帶包被。因此，用于動物體上的中藥有很大一部分不能用于胚胎培養(yǎng)或 者即使可以用于胚胎培養(yǎng)液也難以產(chǎn)生相同的功效。例如：川芎嗪分子質(zhì)量小，水溶性和 脂溶性強，文獻報道川芎嗪具有調(diào)節(jié)HSP70表達的作用，但是川芎嗪用在胚胎培養(yǎng)液中可 阻滯胚胎發(fā)育，不利于胚胎進一步發(fā)育，并且可導(dǎo)致小鼠胚胎心肌畸形。黃芪多糖由己糖 醛酸、葡萄糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等組成，具有調(diào)節(jié)HSP70 表達的作用；但黃芪多糖試驗組的胚胎發(fā)育率比對照組還低，其對胚胎的作用還有待于進 一步的深入探討。小檗堿具備清熱解毒的功效，其作用實質(zhì)是對細菌和病毒等致病原的抑 制或殺滅作用；小檗堿能明顯的促進胚胎2-細胞發(fā)育及細胞增值，但沒有研究表明其能 HSP70的表達具有調(diào)節(jié)作用。
[0007] 此外，妊娠禁忌藥物也有很多，主要包括兩大類：第一，具有毒性的藥物，服用后可 直接對胎兒造成毒害，甚至死胎，如斑蝥、蜈蚣、全蝎、半夏、南星、附子等；第二，不具有毒 性、但藥性猛烈或藥性下行滑利而易損胎元的藥物，這類藥主要是指大辛大熱、行氣化瘀及 攻逐利水類中藥，如青皮、檳榔、細辛、桃仁、沉香等70余種。基于上述種種因素，目前有關(guān) 中藥及其有效成分運用于胚胎體外培養(yǎng)的研究很少。關(guān)于黃芩苷，其藥理作用更是集中在 細胞、組織和活體上，在胚胎體外培養(yǎng)上只有其抗氧化作用的相關(guān)文獻（孫玉成，2006,中 國獸醫(yī)學(xué)報）。該研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷的抗氧化作用可以減少自由基對小鼠胚胎體外發(fā)育的損 傷。
[0008] 谷氨酰胺（Gin)是動物血液中最豐富的特殊游離氨基酸之一。近年來，越來越多 的研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺除了能維持機體酸堿平衡并為組織和細胞的物質(zhì)和能量代謝提供原 料外，還可以誘導(dǎo)動物的熱休克反應(yīng)，提高小鼠胚胎HSP70的表達，并且可促進胚胎發(fā)育， 提高囊胚孵出率。目前，用于胚胎培養(yǎng)液的谷氨酰胺濃度一般為lmm〇l/L，這是由于谷氨酰 胺作為胚胎可吸收的氨基酸是早期胚胎細胞功能的重要調(diào)節(jié)者，通過調(diào)節(jié)胚胎能量產(chǎn)生方 式來促進培養(yǎng)過程中胚胎的發(fā)育，克服胚胎發(fā)育阻滯。對于胚胎的耐熱，則沒有明顯的效 果。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0009] 根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)在解決胚胎耐熱性方面的難題，本發(fā)明提供了一種提高胚胎耐熱性 的培養(yǎng)液。該培養(yǎng)液不僅可以提高高溫條件下培養(yǎng)胚胎的發(fā)育率，而且為生產(chǎn)中預(yù)防因熱 應(yīng)激造成的妊娠動物早期胚胎死亡提供解決思路。
[0010] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案：
[0011] 提高胚胎耐熱性的培養(yǎng)液，所述培養(yǎng)液以常規(guī)培養(yǎng)液為基質(zhì)，所述常規(guī)培養(yǎng)液為 用于胚胎培養(yǎng)的培養(yǎng)液。所述培養(yǎng)液中還包括黃苳苷和谷氨酰胺；所述黃苳苷的濃度為 2. 0-10. 0μ g/mL，所述谷氨酰胺的濃度為1. 17-1. 75mg/ml。黃芩苷和谷氨酰胺均可以在胚 胎上調(diào)節(jié)HSP70的表達，發(fā)揮其胚胎的抗熱作用。此外，黃芩苷和谷氨酰胺在調(diào)節(jié)HSP70 的表達方面具有協(xié)同作用，大大提高了單獨用其中一種組分所產(chǎn)生的耐熱效果。所述黃 芩苷由中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心提供，純度為99%，所述谷氨酰胺購自 sigma公司。所述常規(guī)培養(yǎng)液為常用于胚胎培養(yǎng)的培養(yǎng)液，本發(fā)明中選用人工合成輸卵管液 (synthetic oviduct fluid，S0F)作為牛胚胎培養(yǎng)液、CZB作為小鼠胚胎培養(yǎng)液。所述牛胚 胎由奶牛卵母細胞體外成熟培養(yǎng)、體外受精獲得，所述的小鼠胚胎來自昆明系小鼠輸卵管 沖取的胚胎。
[0012] 所述提高胚胎耐熱性的培養(yǎng)液的配制方法，包括以下幾個步驟：①準(zhǔn)確稱取 2. 0-10. Omg黃芩苷，將其溶于10mL常規(guī)培養(yǎng)液；②取lml步驟①得到的溶液，采用常規(guī)培 養(yǎng)液定容至l〇〇ml ;③向步驟②得到的培養(yǎng)液中加入1. 17-1. 75mg的谷氨酰胺，攪拌均勻， 經(jīng)0. 22 μ m濾器過濾除菌，即得到提高胚胎耐熱性的培養(yǎng)液；4°C溫度條件下儲存，備用。
[0013] 所述提高牛胚胎耐熱性的培養(yǎng)液的使用方法，包括以下幾個步驟：（1)預(yù)平衡：根 據(jù)牛發(fā)育早期胚胎數(shù)量的多少，在60mm培養(yǎng)皿中，將耐熱培養(yǎng)液做成60 μ L的培養(yǎng)微滴（8 個/培養(yǎng)皿），覆蓋礦物油以防止液滴的揮發(fā)，然后置于含5 % C02飽和濕度、溫度條件為 41°C的C02培養(yǎng)箱中平衡不少于2小時，使培養(yǎng)液的氧含量、二氧化碳含量和溫度接近胚胎 在體內(nèi)的液體壞境；否則胚胎在離體環(huán)境不容易養(yǎng)活。（2)胚胎移入：取耐熱培養(yǎng)液200 μ L 于1. 5ml離心管中，將牛胚胎移入其中，震蕩45s去除顆粒細胞；（3)胚胎培養(yǎng)：將步驟（2) 得到的胚胎采用耐熱培養(yǎng)液充分洗滌2次，然后移入步驟（1)得到的培養(yǎng)微滴中，每個培養(yǎng) 微滴移入25個早期胚胎；并將培養(yǎng)微滴置于含5% C02飽和濕度、溫度條件為41°C的C02培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔48小時半量更換培養(yǎng)液。
[0014] 所述的提高小鼠胚胎耐熱性的培養(yǎng)液的使用方法，包括以下幾個步驟：（1)預(yù)平 衡：將耐熱培養(yǎng)液制作成多個體積為60 μ L的培養(yǎng)微滴，覆蓋礦物油以防止液滴的揮發(fā)，然 后置于含5% C02飽和濕度、溫度條件為39°C的C02培養(yǎng)箱中平衡不少于4小時，使培養(yǎng)液 的氧含量、二氧化碳含量和溫度接近胚胎在體內(nèi)的液體壞境；(2)胚胎移入：取耐熱培養(yǎng)液 200 μ L于離心管中，將小鼠胚胎移入其中，震蕩去除顆粒細胞；（3)胚胎培養(yǎng)：將步驟②得 到的胚胎采用耐熱培養(yǎng)液充分洗滌，然后移入步驟①得到的培養(yǎng)微滴中；并將培養(yǎng)微滴置 于含5% C02飽和濕度、溫度條件為39°C的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待胚胎發(fā)育至4細胞時移入 含有1 %葡萄糖的耐熱培養(yǎng)液中，每24h換液一次，直至胚胎發(fā)育至囊胚期。
[0015] 現(xiàn)已證明，多種體外培養(yǎng)的細胞和胚胎受熱后均能產(chǎn)生熱休克蛋白70(HSP70)， HSP70是一種非常重要的非特異性細胞保護蛋白，尤其對體外培養(yǎng)的細胞均有顯著的抗熱 保護作用，而黃芩苷通過在胚胎上調(diào)節(jié)HSP70的表達，發(fā)揮其胚胎的抗熱作用。此外，黃芩 苷和谷氨酰胺都可以調(diào)節(jié)HSP70的表達，而且具有協(xié)同作用。研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎培養(yǎng)液中添 加適當(dāng)比例的黃芩苷和谷氨酰胺能夠在一定程度上對抗熱環(huán)境損傷，提高胚胎耐熱性。單 獨添加黃芩苷（8 μ g/mL)在39°C時小鼠胚胎囊胚率和孵出率是65. 12%和53. 73%，單獨添 加谷氨酰胺（10mm〇l/L)在39°C時小鼠胚胎囊胚率和孵出率是67. 26%和54. 41%。
[0016] 本發(fā)明的有益效果：
[0017] (1)本發(fā)明通過在胚胎培養(yǎng)液中添加適當(dāng)濃度的黃芩苷和谷氨酰胺制備得到耐熱 培養(yǎng)液，不僅大大降低了經(jīng)濟成本、配制方法簡單，而且大幅度提高了胚胎在熱應(yīng)激時的發(fā) 育率和囊胚孵出率；
[0018] ⑵本發(fā)明采用的黃芩苷和谷氨酰胺之間存在協(xié)同作用，都可以調(diào)節(jié)HSP70的表 達。因此，與單獨的黃芩苷或者谷氨酰胺相比，本發(fā)明制備的耐熱培養(yǎng)液的效果突出，產(chǎn)生 了意想不到的技術(shù)效果。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019] 圖1是實施例1中Western Blot方法檢測的牛胚胎中HSP70蛋白的表達；
[0020] 圖2是實施例1中牛胚胎的HSP70蛋白相對表達量統(tǒng)計結(jié)果；
[0021] 圖3是實施例4中Western Blot方法檢測的小鼠胚胎中HSP70蛋白的表達；
[0022] 圖4是實施例4中小鼠胚胎的HSP70蛋白相對表達量統(tǒng)計結(jié)果。
【具體實施方式】
[0023] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的說明。
[0024] 實施例1 :牛胚胎的耐熱培養(yǎng)實驗
[0025] (1)制備適用于牛胚胎的耐熱培養(yǎng)液
[0026] 表1牛胚胎常規(guī)S0F培養(yǎng)液組成成分
[0027]
【權(quán)利要求】
1. 提高胚胎耐熱性的培養(yǎng)液，所述耐熱培養(yǎng)液以常規(guī)培養(yǎng)液為基質(zhì)，所述常規(guī)培養(yǎng)液 為用于胚胎培養(yǎng)的培養(yǎng)液，其特征在于：所述耐熱培養(yǎng)液中還包括黃芩苷和谷氨酰胺；所 述黃芩苷的濃度為2. 0-10. 〇μ g/mL，所述谷氨酰胺的濃度為1. 17-1. 75mg/ml。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高胚胎耐熱性的培養(yǎng)液，其特征在于：所述胚胎為牛胚胎 或小鼠胚胎；所述牛胚胎由奶牛卵母細胞體外成熟培養(yǎng)、體外受精獲得，所述小鼠胚胎由昆 明系小鼠輸卵管沖取獲得；所述牛胚胎的常規(guī)培養(yǎng)液為人工合成輸卵管液（SOF培養(yǎng)液）， 所述小鼠胚胎的常規(guī)培養(yǎng)液為CZB培養(yǎng)液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高胚胎耐熱性的培養(yǎng)液的配制方法，其特征在于：包括以 下幾個步驟：①準(zhǔn)確稱取2. 0-10. Omg黃芩苷，將其溶于10mL常規(guī)培養(yǎng)液；②取lml步驟① 得到的溶液，采用常規(guī)培養(yǎng)液定容至l〇〇ml ;③向步驟②得到的培養(yǎng)液中加入1. 17-1. 75mg 的谷氨酰胺，攪拌均勻，經(jīng)〇. 22 μ m濾器過濾除菌，即得到提高胚胎耐熱性的培養(yǎng)液；4°C溫 度條件下儲存，備用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高胚胎耐熱性的培養(yǎng)液的使用方法，其特征在于：包括以 下幾個步驟： ① 預(yù)平衡：將耐熱培養(yǎng)液制作成多個體積為60 μ L的培養(yǎng)微滴，覆蓋礦物油，然后置于 含5% C02飽和濕度、溫度條件為41 °C的C02培養(yǎng)箱中平衡不少于2小時，使耐熱培養(yǎng)液的 氧含量、二氧化碳含量和溫度接近胚胎在體內(nèi)的液體壞境； ② 胚胎移入：取常規(guī)S0F培養(yǎng)液200 μ L于離心管中，將牛胚胎移入其中，震蕩去除顆粒 細胞； ③ 胚胎培養(yǎng)：將步驟②得到的胚胎采用常規(guī)S0F培養(yǎng)液充分洗滌，然后移入步驟①得 到的耐熱培養(yǎng)微滴中；并將耐熱培養(yǎng)微滴置于含5% C02飽和濕度、溫度條件為41°C的C02 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔48小時半量更換培養(yǎng)液。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的提高胚胎耐熱性的培養(yǎng)液的使用方法，其特征在于：所述牛 胚胎由奶牛卵母細胞體外成熟培養(yǎng)、體外受精獲得。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高胚胎耐熱性的培養(yǎng)液的使用方法，其特征在于：包括以 下幾個步驟： ① 預(yù)平衡：將耐熱培養(yǎng)液制作成多個體積為60 μ L的培養(yǎng)微滴，覆蓋礦物油，然后置于 含5% C02飽和濕度、溫度條件為39°C的C02培養(yǎng)箱中平衡不少于4小時，使培養(yǎng)液的氧含 量、二氧化碳含量和溫度接近胚胎在體內(nèi)的液體壞境； ② 胚胎移入：將小鼠胚胎移入含透明質(zhì)酸酶的Η印es-CZB培養(yǎng)液中去除顆粒細胞； ③ 胚胎培養(yǎng)：將步驟②得到的胚胎采用Hepes-CZB培養(yǎng)液充分洗滌，然后移入步驟① 得到的耐熱培養(yǎng)微滴中；并將耐熱培養(yǎng)微滴置于含5% C02飽和濕度、溫度條件為39°C的 C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待胚胎發(fā)育至4細胞時移入含有1 %葡萄糖的耐熱培養(yǎng)液中，每24h換 液一次，直至胚胎發(fā)育至囊胚期。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的提高胚胎耐熱性的培養(yǎng)液的使用方法，其特征在于：所述小 鼠胚胎由昆明系小鼠輸卵管沖取獲得。
【文檔編號】C12N5/073GK104152404SQ201410446860
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年9月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月4日
【發(fā)明者】田文儒, 趙園, 叢霞, 曹榮峰, 李華濤, 姜忠玲, 崔凱, 齊曉楠 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)