一種細胞色素p450酶的特異性探針底物組合物及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種細胞色素P450(CYP450)酶的特異性探針底物組合物及其在細胞色素P450酶亞型酶活檢測中的應用，所述組合物由非那西丁、香豆素、安非他酮、右美沙芬、雙氯酚酸和睪酮中的至少兩種組成，通過所述特異性探針底物組合物和液相色譜-質譜聯用技術可以同時檢測多離子通道的特性，同時間測定6種CYP450酶的抑制情況，極大地提高了實驗通量效率，降低了實驗成本。
【專利說明】一種細胞色素 P450酶的特異性探針底物組合物及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及酶學和生物分析【技術領域】，具體涉及一種特異性探針底物組合物及其 應用，尤其涉及一種細胞色素 P450酶的特異性探針底物組合物及其在細胞色素 P450酶亞 型酶活檢測中的應用。
【背景技術】
[0002] 細胞色素 P450(CYP450)酶分布于肝臟、小腸和腎臟，其中CYP1A2、2A6、2B6、2C8、 2C9、2C19、2D6、2E1和3A4等亞型與外源性物質（如藥物）代謝清除密切相關，參與90%的 藥物代謝。在新藥研發過程中，可以通過這些CYP450酶的探針底物在體外代謝體系（如人 肝微粒體等）生成特異性代謝產物的速率，判斷藥物是否會抑制特定的CYP酶亞型，進而推 斷該藥物是否會引起體內藥物間相互作用，降低藥效或增加毒性。
[0003] 近年來，對高通量藥物篩選的需求日益增加，目前，用于研究CYP活性的方法主要 中，"cocktail"探針藥物法較為常見，但其仍有很多不足之處，如構成該cocktail的幾種 藥物在共同孵育時可能存在著相互作用，而且對分析方法的靈敏度和特異性要求較高，這 樣就會提高分析成本。
[0004] 隨著組合化學和高通量篩選手段的采用，需要進行CYP450酶抑制作用篩選的化 合物急劇增多，而目前由于分析方法（如高效液相、紫外或熒光）的靈敏度限制，每次分析 僅能預測化合物對單個酶的抑制作用，耗時低效。
[0005] 因此，尋找一種可靠的混合探針底物和高靈敏度的分析方法是目前亟待解決的問 題。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供一種特異性探針底物組合物及其應用，特別是一種細胞色 素 P450酶的特異性探針底物組合物及其在細胞色素 P450酶亞型酶活檢測中的應用。
[0007] 為達到此發明目的，本發明采用以下技術方案：
[0008] 第一方面，本發明提供了一種細胞色素 P450(CYP450)酶的特異性探針底物組合 物由非那西丁、香豆素、安非他酮、右美沙芬、雙氯酚酸和睪酮中的至少兩種組成。本發明的 特異性探針底物組合物例如可以是：非那西丁與香豆素、安非他酮、右美沙芬、雙氯酚酸或 睪酮中任意一種或至少兩種的組合，或者，香豆素與非那西丁、安非他酮、右美沙芬、雙氯酚 酸或睪酮中任意一種或至少兩種的組合等等，優選為非那西丁、香豆素、安非他酮、右美沙 芬、雙氯酚酸和睪酮的組合物。
[0009] 其中，所述非那西丁的濃度為7. 5-30 μ M，例如可以是：7. 5 μ M、8. 5 μ M、10. 5 μ M、 12. 5 μ Μ、15 μ Μ、18 μ Μ、20 μ Μ、23 μ Μ、25 μ Μ、30 μ Μ，優選為 15-25 μ Μ，更優選為 15 μ Μ。
[0010] 所述香豆素的濃度為1.25-5以]?，例如可以是1.25以]\1、1.5以]\1、2.(^]\1、2.25 4]\1、 2·5μΜ、2·75μΜ、3μΜ、3·5μΜ、4μΜ、4·5μΜ、5μΜ，優選為 1·25-3·5μΜ，更優選為 2· 5 μ Μ。
[0011] 所述安非他酮的濃度為2. 5-10μΜ，例如可以是2. 5μΜ、3μΜ、3. 5μΜ、4μΜ、 4· 75μΜ、5μΜ、5· 25μΜ、6· 5μΜ、7μΜ、7· 5μΜ、8μΜ、8· 25μΜ、8· 5μΜ、9μΜ、9· 5μΜ、 10 μ Μ，優選為3. 5-8 μ Μ，更優選為5 μ Μ。
[0012] 所述右美沙芬的濃度為2. 5-10μΜ，例如可以是2. 5μΜ、3μΜ、3. 5μΜ、4μΜ、 4· 5 μ Μ、5 μ Μ、5· 25 μ Μ、6· 5 μ Μ、7 μ Μ、7· 5 μ Μ、8 μ Μ、8· 25 μ Μ、8· 5 μ Μ、9 μ Μ、9· 5 μ Μ、10 μ Μ, 優選為3. 5-8 μ Μ，更優選為5 μ Μ。
[0013] 所述雙氯酚酸的濃度為2. 5-10μΜ，例如可以是2. 5μΜ、3μΜ、3. 5μΜ、4μΜ、 4· 5 μ Μ、5 μ Μ、5· 25 μ Μ、6· 5 μ Μ、7 μ Μ、7· 5 μ Μ、8 μ Μ、8· 25 μ Μ、8· 5 μ Μ、9 μ Μ、9· 5 μ Μ、10 μ Μ, 優選為3. 5-8 μ Μ，更優選為5 μ Μ。
[0014] 所述睪酮的濃度為5-20μΜ，例如可以是5μΜ、6· 5μΜ、8μΜ、10μΜ、12μΜ、 15 μ Μ、16 μ Μ、17 μ Μ、18 μ Μ、20 μ Μ，優選為 8-18 μ Μ，更優選為 10 μ Μ。
[0015] 第二方面，本發明還提供了如本發明第一方面所述的特異性探針底物組合物在檢 測細胞色素 Ρ450酶6種亞型酶活性的應用。
[0016] 本發明的細胞色素 Ρ450酶可以是來源于肝、腎和胃腸道等含有Ρ450酶的細胞和 亞細胞器，如肝細胞、微粒體和S9等。
[0017] 作為優選技術方案，本發明的應用包括利用如本發明第一方面所述的特異性探針 底物組合物檢測細胞色素 Ρ450酶6種亞型的抑制作用。
[0018] 在進行檢測時，可以結合液相色譜-質譜聯用技術同時進行，或者采用高效液相 色譜等檢測手段，都可以實現對細胞色素 Ρ450酶6種亞型的抑制作用。
[0019] 作為優選技術方案，本發明的檢測方法包括以下步驟：
[0020] (1)將所述的特異性探針底物組合物同時與肝微粒體在體外進行孵化反應；
[0021] (2)采用液相色譜-質譜分析方法同時測定所述的特異性探針底物組合物及其生 成的對應的6種代謝產物；
[0022] (3)選擇6種細胞色素 Ρ450酶的特異性抑制劑加入到其所對應酶的單個探針底物 及混合探針底物的反應體系中，測定生成的代謝物，計算相應IC50值。
[0023] 優選地，所述孵化時間為5_20min，例如可以是5min、6min、7min、8min、9min、 lOmin、12min、14min、15min、16min、18min、20min,優選為 7_15min,更優選為 10min〇 優選 地，步驟（2)所述的代謝產物為對乙酰氨基酚、羥基香豆素、羥基安非他酮、右羥嗎喃、4-羥 基雙氯酚酸和6 β -羥基睪酮。
[0024] 本發明的肝微粒體包括但不限于人源性的，還包括大鼠、小鼠、狗、猴、樹駒等靈長 類動物，優選為人肝微粒體。
[0025] 第三方面，本發明還提供了如本發明第一方面所述的特異性探針底物組合物制成 藥學上可接受的制劑。
[0026] 作為優選技術方案，所述的制劑為溶液劑。
[0027] 第四方面，本發明還提供了如本發明第一方面所述的特異性探針底物組合物在制 備測定肝藥酶活性藥物的應用。
[0028] 第五方面，本發明還提供了如本發明第三方面所述的制劑在制備測定肝藥酶活性 藥物的應用。
[0029] 與現有技術相比，本發明至少具有以下有益效果：
[0030] 本發明采用的6種混合CYP450酶探針底物，特異性強，任一探針底物均可被目標 細胞色素 P450高特異性地代謝成為相應的單羥化產物；相互間的干擾低，實現了在一個樣 品中多個反應互不干擾，可用于檢測待測物對多個酶的抑制情況；
[0031] 此外，本發明采用液相色譜-質譜聯用技術進行定量分析，提高了實驗通量效率， 大大節約了檢測的成本和時間，而且更接近肝組織代謝過程，更好地模擬了肝酶代謝環境。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0032] 圖1是本發明的特異性探針底物組合物與單獨底物1A2對各CYP450酶的產物-時 間曲線圖。
[0033] 圖2是本發明的特異性探針底物組合物與單獨底物2A6對各CYP450酶的產物-時 間曲線圖。
[0034] 圖3是本發明的特異性探針底物組合物與單獨底物2B6對各CYP450酶的產物-時 間曲線圖。
[0035] 圖4是本發明的特異性探針底物組合物與單獨底物3A4對各CYP450酶的產物-時 間曲線圖。
[0036] 圖5是本發明的特異性探針底物組合物與單獨底物2D6對各CYP450酶的產物-時 間曲線圖。
[0037] 圖6是本發明的特異性探針底物組合物與單獨底物2C9對各CYP450酶的產物-時 間曲線圖。
【具體實施方式】
[0038] 下面通過【具體實施方式】來進一步說明本發明的技術方案。本領域技術人員應該明 了，所述實施例僅僅是幫助理解本發明，不應視為對本發明的具體限制。
[0039] 實施例1篩詵特異件強的CYP450酶探針底物
[0040] (1)分別測定CYP450酶和其常用的探針底物間的酶動力學參數，結果如表1所示， 作為挑選探針底物的參考和依據。
[0041] 表 1
[0042]
【權利要求】
1. 一種細胞色素 P450(CYP450)酶的特異性探針底物組合物，其特征在于，所述組合物 由非那西丁、香豆素、安非他酮、右美沙芬、雙氯酚酸和睪酮中的至少兩種組成；其中，非那 西丁的濃度為7. 5-30 μ M，香豆素的濃度為1. 25-5 μ M，安非他酮的濃度為2. 5-10 μ M，右美 沙芬的濃度為2. 5-10 μ Μ，雙氯酚酸的濃度為2. 5-10 μ Μ，睪酮的濃度為5-20 μ Μ。
2. 根據權利要求1所述的特異性探針底物組合物在檢測細胞色素 Ρ450酶6種亞型酶 活性中的應用。
3. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述的應用包括采用權利要求1所述的特 異性探針底物組合物檢測細胞色素 Ρ450酶6種亞型的抑制作用； 優選地，采用權利要求1所述的特異性探針底物結合液相色譜-質譜聯用技術或高效 液相色譜技術檢測細胞色素 Ρ450酶6種亞型的抑制作用。
4. 根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述的檢測方法包括以下步驟： (1) 將所述的特異性探針底物組合物同時與肝微粒體在體外進行孵化反應； (2) 采用液相色譜-質譜分析方法同時測定所述的特異性探針底物組合物及其生成的 對應的6種代謝產物； (3) 選擇6種細胞色素 Ρ450酶的特異性抑制劑加入到其所對應酶的單個探針底物及混 合探針底物的反應體系中，測定生成的代謝物，計算相應IC50值； 優選地，所述孵化時間為5-20min，優選為lOmin。
5. 根據權利要求4所述的應用，其特征在于，步驟（2)所述的代謝產物為對乙酰氨基 酚、7-羥基香豆素、羥基安非他酮、去甲右美沙芬、4-羥基雙氯酚酸和6 β -羥基睪酮。
6. 根據權利要求1所述的特異性探針底物組合物制成藥學上可接受的制劑。
7. 根據權利要求6所述的制劑，其特征在于，所述的制劑為溶液劑。
8. 根據權利要求1所述的特異性探針底物組合物在制備測定肝藥酶活性藥物的應用。
9. 根據權利要求6所述的制劑在制備測定肝藥酶活性藥物的應用。
【文檔編號】C12Q1/26GK104195218SQ201410446334
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月3日 優先權日:2014年9月3日
【發明者】張素行, 張飛鵬, 葉沛珍, 陳濤, 龍娜, 張科之, 黃曉勇 申請人:廣東中西達一新藥開發有限公司