包含葡萄糖啟動子的載體、宿主菌以及重組牛源胰蛋白酶的制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種在畢赤酵母中通過基因重組的手段異源表達牛源胰蛋白酶原基因的方法，該重組牛胰蛋白酶原通過采用新型啟動子在畢赤酵母中表達并分泌到培養基中，酶原通過自激活、腸激酶或胰蛋白酶等處理可制備活性牛胰蛋白酶，由此制備的活性牛胰蛋白酶可用于生產重組人胰島素及人胰島素類似物。此方法可避免組成型啟動子三磷酸甘油醛脫氫酶(GAP)啟動子和誘導型啟動子醇氧化酶(AOX1)啟動子的缺點。
【專利說明】包含葡萄糖啟動子的載體、宿主菌以及重組牛源胰蛋白酶 的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種重組表達牛源胰蛋白酶的基因工程菌及其構建方法與應用。具體 地，涉及一種采用新型啟動子啟動牛源胰蛋白酶表達的基因工程菌的構建方法與應用。
【背景技術】
[0002] 胰蛋白酶（TRYPSIN，EC 3. 4. 21. 4)在脊椎動物中，作為消化酶而起作用。胰蛋白 酶是由胰腺分泌的一種內肽酶，最初分泌物為胰蛋白酶原，受腸激酶或胰蛋白酶的限制分 解成為活化胰蛋白酶，是肽鏈內切酶。主要作用于精氨酸或賴氨酸羧基端的肽鍵。它不僅起 消化酶的作用，而且還能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前體，起活 化作用。是特異性最強的蛋白酶，在決定蛋白質的氨基酸排列中，它成為不可缺少的工具。 其中牛胰臟來源的胰蛋白酶氨基酸殘基223個，分子量為23. 3kDa，活性部位的絲氨酸殘基 是不可缺少的絲氨酸蛋白酶。
[0003] 胰蛋白酶在臨床上用于膿胸、血胸、外科炎癥、潰瘍、創傷性損傷、瘺管等所產生的 局部水腫、血腫及膿腫等。噴霧吸入，用于呼吸道疾病。也可用于治療毒蛇咬傷。還常用于 動物細胞培養前對組織的處理。在基因工程領域，胰蛋白酶也獲得了越來越廣泛的應用，特 別在重組人胰島素及人胰島素類似物的生產過程中，胰蛋白酶為不可或缺的酶，其比活性 的高低及穩定性是影響胰島素原活化收率的一個至關重要的參數。牛源胰蛋白酶作為切割 第三代胰島素的有效工具酶被廣泛研究。
[0004] 目前制備胰蛋白酶的方法主要有兩類：一是提取自動物如豬、牛的胰臟，因其方法 相對簡單，被廣泛采用，但是該方法因不能完全除去其他蛋白質，且產品中的動物源病毒如 口蹄疫病毒、瘋牛病病毒等不能完全除去，因此其應用存在一定的局限性及風險性；二是生 產重組胰蛋白酶，多以豬源性胰蛋白酶為多，牛源性幾乎沒有，僅見美國禮來和江蘇萬邦以 大腸桿菌表達的包涵體復性的牛胰蛋白酶和印度拜康以畢赤酵母發酵的雜合牛胰蛋白酶 的專利。
[0005] 本方法以酵母為宿主制備牛源胰蛋白酶，優勢在于：酵母的真核表達系統所產生 的胰蛋白酶結構正確，產量較高，且是以分泌表達的方式存在于培養基中，培養基的成分有 利于胰蛋白酶的穩定性，且有利于純化；本方法采用新型啟動子通過加入葡萄糖誘導牛源 胰蛋白酶的表達，由于胰蛋白酶的表達具有毒性，此方法避免了組成型啟動子三磷酸甘油 醛脫氫酶（GAP)啟動子不需要誘導就可直接表達對細胞的傷害作用，也避免了醇氧化酶啟 動子（A0X1)誘導需要甲醇，甲醇易燃易爆及對健康有害的缺點。
【發明內容】
[0006] 為克服現有技術表達表達牛源胰蛋白酶所用的GAP啟動子和A0X1啟動子的缺陷， 本發明涉及一種表達牛源胰蛋白酶的新型啟動子，所述啟動子為葡萄糖啟動子。
[0007] 本發明的另一目的是提供一種酵母表達載體，所述酵母表達載體包括啟動子及目 的基因，所述啟動子為葡萄糖啟動子，所述目的基因為編碼牛胰蛋白酶的核苷酸序列，所述 葡萄糖啟動子與所述目的基因構成一個表達盒，所述的表達盒可以通過體外構建或抗生素 濃度及遺傳霉素濃度篩選多拷貝。
[0008] 本發明中，所述葡糖糖啟動子，可以是選自PG1或PG6葡萄糖啟動子，優選為PG6 葡萄糖啟動子，所述PG6葡萄糖啟動子具有SEQ ID NO. 1所述的部分或全部核苷酸序列，所 述編碼牛胰蛋白酶的核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示，其編碼的牛源胰蛋白酶的氨基酸序 列如SEQ ID N0. 3所示。
[0009] 為了在后續純化牛源胰蛋白酶是更為簡化，本發明中，在所述編碼牛胰蛋白酶的 核苷酸序列的C端加入6個組氨酸作為純化標簽。
[0010] 本發明中，所述酵母表達載體為能夠用以表達外源蛋白的穿梭載體，這些能夠用 以表達外源蛋白的穿梭載體均含有表達外源蛋白所必需的元件，優選以pPIC9K、pPIC3. 5K、 pPICZ a A、pPICZ α B、pPICZ a C、pPICZA、pPICZB、pPICZC 或 pA0815 為基礎改造的載體，所 述改造的酵母表達載體包含所述葡萄糖啟動子和編碼牛胰蛋白酶的核苷酸序列。
[0011] 進一步地，所述酵母表達載體為具有篩選標記的酵母表達載體，優選地，所述酵母 表達載體的篩選標記為zeocin、geneticin或his。
[0012] 本發明的另一目的，在于提供一種含有本發明所述酵母表達載體的宿主菌，其中 所述宿主為酵母菌，優選畢赤酵母，更優選為畢赤酵母GS115。含有本發明所述表達載體的 宿主菌，其可以是至少含有一種改造的酵母表達載體，如在一個宿主菌中，可以是只包括含 有一種篩選標記并含有編碼牛源胰蛋白酶的基因，此時的宿主菌，為含有一種改造的酵母 表達載體；或者，在所述宿主菌中，也可以是包括兩種篩選標記并含有編碼牛源胰蛋白酶的 基因，此時的宿主菌，為含有兩種改造的酵母表達載體。
[0013] 本發明的還一目的，在于提供一種制備重組牛胰蛋白酶的方法，所述方法包括： (1)以葡萄糖作為唯一碳源，誘導本發明用以所述宿主菌表達C端帶有組氨酸標簽的牛胰 蛋白酶原；（2)通過自激活、腸激酶或胰蛋白酶處理上述牛胰蛋白酶原，生成牛胰蛋白酶； (3)以鎳柱親和一步純化法純化所得牛胰蛋白酶，純化中洗脫液通過梯度為20mM至250mM 的咪唑溶液洗脫目的蛋白。
[0014] 具體地，以酵母作為宿主并采用葡萄糖啟動子制備重組牛胰蛋白酶的方法，該方 法包括：
[0015] 1、提供編碼葡萄糖啟動子的核苷酸序列；
[0016] 2、提供編碼牛胰蛋白酶原的核苷酸序列；
[0017] 3、將上述啟動子和目的基因構建成表達盒，代替其他啟動子表達盒克隆到不同篩 選標記的酵母表達載體中；
[0018] 4、將上述載體轉化至同一酵母宿主；
[0019] 5、誘導上述酵母宿主表達C端帶有組氨酸標簽（His tag)的牛胰蛋白酶原；
[0020] 6、通過自激活、腸激酶或胰蛋白酶處理上述牛胰蛋白酶原，生成牛胰蛋白酶；
[0021] 7、純化上述牛胰蛋白酶。
[0022] 優選地，步驟1中所述的葡萄糖啟動子的序列來源于畢赤酵母菌；
[0023] 步驟2中所述編碼牛胰蛋白酶原的核苷酸序列可以根據所用宿主的密碼子偏好 性來確定，以增加宿主的表達效率。該方法為本領域技術人員所公知的技術，具體地密碼子 優化由基因合成公司確定（本專利中核苷酸序列由金唯智公司按畢赤酵母密碼子偏好優 化并合成）。
[0024] 步驟3中的所述酵母表達載體框架可以為任意一種具有篩選標記的酵母表達載 體框架，優選地，所述酵母表達載體的篩選標記為zeocin、geneticin、his等。
[0025] 步驟4中的所述酵母宿主作為一種真核表達系統，能夠直接表達構象正確的目的 蛋白，無需后續的變性和復性過程。因此本發明的方法對酵母宿主的種類沒有任何限制，優 選的酵母菌株可為漢遜酵母、畢赤酵母、假絲酵母、光滑球擬酵母等，更優選的酵母菌株為 畢赤酵母。
[0026] 步驟5中的誘導酵母宿主表達蛋白的方法采用葡萄糖作為唯一碳源誘導目的蛋 白的表達。優選地，葡萄糖的誘導終濃度達到〇. 002g_10g/L，更優選的，葡萄糖的誘導終濃 度達到lg/L。
[0027] 步驟6中的自激活、腸激酶或胰蛋白酶切方法是本領域技術人員所公知的，
[0028] 步驟7中的純化帶有組氨酸標簽的蛋白質的技術和方法是本領域技術人員所公 知的。本發明的純化方法優選采用鎳柱親和一步純化法進行，并通過梯度為20mM至250mM 的咪唑溶液來洗脫目的蛋白。
[0029] 步驟6中的所述酶切和步驟7中的所述純化過程可以順序進行，也可以同時進行。
[0030] 本發明制備牛胰蛋白酶的方法具有以下優點：
[0031] 1.采用新型啟動子啟動目的基因牛源胰蛋白酶的表達，避免組成型啟動子不需要 誘導就可表達牛源胰蛋白酶進而對細胞具有毒性和醇氧化酶啟動子利用甲醇誘導存在易 燃易爆并對健康有害的缺點。
[0032] 2、在酵母真核表達系統中進行重組表達，表達產物牛胰蛋白酶原無需經過變性和 復性，在直接酶切去除前肽后即可得到有活性的牛胰蛋白酶。
[0033] 3、表達生成C端帶有組氨酸標簽（His tag)的牛胰蛋白酶原，使得在后續的酶切 和親和純化過程中，能夠使純化產物（牛胰蛋白酶）保留在洗脫液中，純化產物體積小，不 需后續濃縮步驟。
[0034] 4.純化簡單，利用his標簽一步純化即可得到產品。
[0035] 5.如根據酵母偏好密碼子提供編碼牛胰蛋白酶原的核苷酸序列，還可以進一步提 高表達量。
[0036] 6.如在誘導表達過程中使葡萄糖的終濃度達到lg/L，能夠更高效的表達牛胰蛋 白酶原。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0037] 圖1 :重組BT的Western Blot檢測圖，圖中A泳道為牛胰蛋白酶活化后純化 SDS-PAGE，B泳道為培養液上清牛胰蛋白酶原純化，經活化后牛胰蛋白酶分子量明顯小于酶 原。
[0038] 圖2 :重組BT的SDS-PAGE電泳檢測圖，A泳道為20度誘導分泌上清，B泳道為28 度誘導分泌上清，從WB圖可以看出20度誘導較28度誘導可以獲得更多的目標產物。
【具體實施方式】
[0039] 材料:
[0040] 菌株和質粒：克隆菌種Escherichia coli (T0P10)是基因工程常用菌種；巴斯德 畢赤酵母（Pichia pastoris)GS-115、KM-71、KM-71H、X-33、SMD-1168、SMD-1168-H ;質粒 pPIC9K、pPIC3. 5K、pPICZ a A、pPICZ α B、pPICZ a C、pPICZA、pPICZB、pPICZC、pA0815 購于 invitrogen 公司。
[0041] 酶和試劑：
[0042] 實施例中涉及分子生物學操作所用的限制性內切酶均購于NEB公司，所用的基因 擴增酶購自北京全式金公司，連接酶購自寶生物公司，相應的操作步驟完全按照相關的產 品說明書進行。
[0043] 瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自OMEGA公司、酵母DNA提取試劑盒購 自北京天根公司，相應的操作步驟完全按照相關的產品說明書進行。
[0044] 實施例中所涉及的編碼牛胰蛋白酶原的核苷酸序列的合成、引物的合成和DNA的 測序由金唯智公司完成。
[0045] TAME 購于 sigma 公司。
[0046] Zeocin 購于 invitrogen 公司。
[0047] Anti-trypsin (Rabbit)購自 Abeam 公司。
[0048] Donkey anti Rabbit二抗購自北京博奧森公司
[0049] 培養基：
[0050] LB、YPD、MD、YPDS、BMGY、BMMY
[0051] 抗性培養基為相應培養基加相應抗生素或遺傳霉素，如：Ampicillin、Zeocin、 G418。
[0052] 以上培養基是基因工程領域常用培養基，各培養基的配方可參見分子克隆第三版 下冊附錄2以及invitrogen公司的畢赤酵母操作手冊（Multi-Copy Pichia Expression Kit)第 64 頁-第 70 頁；及 pPICZ a A、B and C 第 17-第 18 頁。
[0053] 方法:
[0054] 聚合酶鏈反應，PCR產物純化，基因和質粒的酶切、回收、連接和轉化，以及大 腸桿菌轉化子的篩選，鑒定，這些基因工程常規操作方法，可參見Sambrook J，Fristsh EF, Maniatis T. MolecularCloning ；A Laboiatory Manual 2nd ed.NY:Cold Spring Harbor Laboratory Piess, 1989, pp. 16-340。重組酵母表達載體質粒的線性化，酵母轉 化，轉化子的篩選、誘導表達以及表達鑒定，可參見invitrogen公司的畢赤酵母操作手冊 (Multi-Copy Pichia Expression Kit)第 32 頁-第 63 頁。及pPICZ aA、B and C第 9-第 14頁。
[0055] 實施例1巴斯德畢赤酵母基因組的提取及PG6啟動子的擴增
[0056] 1.將Pichia pastoris X33劃線到YPD固體培養基上，30°C培養2天后挑單菌落 接種到Yro液體培養基，培養1天后，按天根公司酵母基因組試劑盒說明書提取基因組。
[0057] 2.以步驟1中提取的基因組為模板，以設計的兩條引物為上下游引物，擴增PG6啟 動子。
[0058] PG6-F ：CGAAGATCTAGACCAGCAGTTTAACTACG(劃線處為 BglII 限制性內切酶）
[0059] PG6-R :CCTGCCTTCGAACTTTTCTTTGGGCAAGGAAA (劃線處為 BstBI 限制性內切酶）
[0060] PCR反應體系：
[0061]
【權利要求】
1. 一種酵母表達載體，所述酵母表達載體包括啟動子及目的基因，所述啟動子為葡萄 糖啟動子，所述目的基因為編碼牛胰蛋白酶的核苷酸序列。
2. 根據權利要求1所述的表達載體，其中所述啟動子與所述目的基因構成一個表達 盒。
3. 根據權利要求1所述的酵母表達載體，其中所述葡萄糖啟動子為PG6啟動子。
4. 根據權利要求3所述的酵母表達載體，其中所述PG6啟動子的核苷酸序列為SEQ ID No. 1的部分或全部核苷酸序列。
5. 根據權利要求1所述的酵母表達載體，所述編碼牛胰蛋白酶的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
6. 根據權利要求5所述的酵母表達載體，其中所述編碼牛胰蛋白酶的核苷酸序列進一 步在C端加入6個組氨酸作為純化標簽。
7. 根據權利要求1-6中任一權利要求所述的酵母表達載體，其中所述酵母表達載體 為能夠用以表達外源蛋白的穿梭載體，這些酵母表達載體均含有表達外源蛋白所必需的元 件，優選以 PPIC9K、pPIC3. 5K、pPICZ a A、pPICZ α B、pPICZ a C、pPICZA、pPICZB、pPICZC 或 pA0815為基礎改造的載體，所述改造的酵母表達載體包含所述葡萄糖啟動子和編碼牛胰蛋 白酶的核苷酸序列。
8. 根據權利要求7所述酵母表達載體，所述酵母表達載體為具有篩選標記的酵母表達 載體，優選地，所述酵母表達載體的篩選標記為zeocin、geneticin或his。
9. 含有權利要求1至8中任一權利要求所述的宿主菌。
10. 根據權利要求8所述的宿主菌，其中所述宿主為酵母菌，優選畢赤酵母，更優選為 畢赤酵母GS115,所述宿主包含至少一種所述表達載體。
11. 制備重組牛胰蛋白酶的方法，所述方法包括：（1)以葡萄糖作為唯一碳源，誘導權 利要求10所述宿主菌表達C端帶有組氨酸標簽的牛胰蛋白酶原；（2)通過自激活、腸激酶 或胰蛋白酶處理上述牛胰蛋白酶原，生成牛胰蛋白酶；（3)以鎳柱親和一步純化法純化所 得牛胰蛋白酶，純化中洗脫液通過梯度為20mM至250mM的咪唑溶液洗脫目的蛋白。
12. 權利要求11所述方法，所述的葡萄糖終濃度為0. 002g-10g/L，優選的為lg/L ;誘 導溫度<30°C，優選的為20°C。
13. 權利要求11所述方法，步驟（2)的酶切和步驟（3)的純化過程可以順序進行，也可 以同時進行。
【文檔編號】C12R1/84GK104195165SQ201410440706
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月1日 優先權日:2014年9月1日
【發明者】王曉霞, 彭毅 申請人:北京愛必信生物技術有限公司