一種嗜鐵解磷細(xì)菌的分離篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種嗜鐵解磷細(xì)菌的分離篩選方法，包括以下步驟：(1)采集作物根圍土壤，去雜，接種于滅菌水中，25-35℃條件下培養(yǎng)2-3小時(shí)，分離上清液；(2)制備CAS-P檢測平板，將CaCl2溶液、MgSO4·7H2O溶液、質(zhì)量濃度為8-12％的酸水解酪蛋白溶液混合均勻，向其中加入Ca3(PO4)2，調(diào)節(jié)pH為6.8-7.0，用水定容；加入瓊脂粉，滅菌，滅菌后待溫度降至50-60℃時(shí)，再加入CAS藍(lán)色檢測液，混勻后倒平板，即得；(3)將步驟(1)的上清液接種于CAS-P檢測平板上，接種量為100-200uL/平板，25-35℃條件下培養(yǎng)3-5天，在該檢測平板上生長的菌株即為嗜鐵解磷細(xì)菌。采用本發(fā)明的篩選方法，簡化了分離篩選步驟，大大縮短篩選時(shí)間，提高了嗜鐵解磷細(xì)菌的分離篩選效率。
【專利說明】一種嗜鐵解磷細(xì)菌的分離篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種嗜鐵解磷細(xì)菌的分離篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002]鐵是大多數(shù)生物必需的微量元素之一，雖然在地殼中鐵元素的含量占第四位，但大部分不能被植物直接利用，需要一套高效的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制獲取它們所需的鐵離子。在低鐵環(huán)境下，大多數(shù)細(xì)菌能夠合成并分泌嗜鐵素，供其自身和植物利用，促進(jìn)植物生長；并通過與病原微生物爭奪有限的鐵營養(yǎng)，抑制病原微生物的生長繁殖，起到生物防治的作用。
[0003]磷是植物生長不可缺少的營養(yǎng)元素之一，盡管每年都向土壤中施入大量可溶性磷肥，然而，磷酸鹽在土壤中常以磷酸三鈣為主，這類磷酸鹽溶解性差，難于被植物吸收利用，作物對磷肥的當(dāng)季利用率一般只有5%~10%，加上作物的后效，利用率不超過25%。分離篩選出具有高效解磷作用的微生物菌株并制成微肥，是解決磷肥利用率低，控制濫用肥料帶來的環(huán)境污染問題的有效方法。
[0004]對于具有嗜鐵或/和解磷能力的植物根際促生菌(Plant Growth-PromotingRhizobacteria,簡稱PGPR)的篩選，并用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中解決植物缺鐵黃化以及磷肥利用率低等問題，已有一些相關(guān)報(bào)道。然而現(xiàn)有的技術(shù)中，嗜鐵細(xì)菌和解磷細(xì)菌是分開篩選的，即使有些菌株具有嗜鐵和解磷等多種防病促生機(jī)制，其嗜鐵能力或解磷能力是分別檢測的，步驟復(fù)雜，篩選效率低，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的是提供一種嗜鐵解磷細(xì)菌的分離篩選方法，在一種培養(yǎng)基上即可短時(shí)間內(nèi)篩選獲得同時(shí)具有嗜鐵和解磷能力的細(xì)菌菌株，簡化了分離篩選步驟，大大縮短篩選時(shí)間，提高了嗜鐵解磷細(xì)菌的分離篩選效率。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案:
[0007]一種嗜鐵解磷細(xì)菌的分離篩選方法，包括以下步驟:
[0008](I)采集作物根圍土壤，去雜，接種于滅菌水中，接種量為0.5-1.5g/100mL水，25-35°C條件下培養(yǎng)2-3小時(shí)，靜置，分離上清液，備用；
[0009](2)制備CAS-P檢測平板，將CaCl2溶液、MgSO4.7H20溶液、質(zhì)量濃度為8_12%的酸水解酪蛋白溶液混合均勻，向其中加入Ca3(PO4)2,調(diào)節(jié)pH為6.8-7.0，用水定容，每10mL定容溶液中含有CaCl2溶液0.1-0.3mL, MgSO4.7H20溶液0.1-0.3mL,酸水解酪蛋白溶液4-8mL，Ca3(PO4)20.3-0.8g ;加入瓊脂粉，瓊脂粉的加入量為l_3g/100mL定容溶液，滅菌，滅菌后待溫度降至50-60°C時(shí)，再加入CAS藍(lán)色檢測液，CAS藍(lán)色檢測液的加入量為3-8mL/100mL定容溶液,混勻后倒平板，即得；
[0010] (3)將步驟(1)的上清液接種于CAS-P檢測平板上，接種量為100-200uL/平板，25-35°C條件下培養(yǎng)3-5天，在該檢測平板上生長的菌株即為嗜鐵解磷細(xì)菌。
[0011]步驟(1)中，培養(yǎng)時(shí)，以150-200r/min進(jìn)行振蕩培養(yǎng)；
[0012]步驟(2)中，所述CaCl2溶液和MgSO4.7H20溶液的濃度均為lmmol/L ；
[0013]步驟⑵中，所述CAS藍(lán)色檢測液的制備方法為:將0.07g的鉻天青(Chromeazurol S, CAS)溶于50mL去離子水中，再加入10mT, lmmol/L的FeCl3溶液(含有1mmol/L的HCL),為溶液A ;將0.06g的溴化十六烷基三甲銨(Hexadecyltrimethylammoniumbromide, HDTMA)溶于40mL去離子水中，為溶液B ;將溶液A緩緩加入到B溶液中，輕輕晃動，使得溶液A與溶液B混合均勻，即得到CAS藍(lán)色檢測液。
[0014]步驟(2)中，調(diào)節(jié)pH所用的試劑為生物緩沖液1，4-哌嗪二乙磺酸。
[0015]步驟(2)中，所述定容用的水為去離子水、純化水或蒸餾水。
[0016]步驟(2)中，所述滅菌的溫度為121°C，滅菌時(shí)間為15分鐘。
[0017]優(yōu)選的，步驟(1)中，接種量為1.0g/100mL。
[0018]優(yōu)選的，步驟⑵中,所述CAS-P檢測平板的制備方法為:將lmmol/L的CaCl2溶液
0.2mL、lmmol/L的MgSO4.7H20溶液0.2mL、質(zhì)量濃度為10%的酸水解酪蛋白溶液6mL混合均勻，向其中加入Ca3(PO4)20.5g，調(diào)節(jié)pH為6.8-7.0，用去離子水定容至10mL,加入2g瓊脂粉，滅菌，滅菌后待溫度降至50-60°C時(shí)，再加入3-8mL CAS藍(lán)色檢測液，混勻后倒平板，即得。
[0019]本發(fā)明的有益效果:
[0020]本發(fā)明的嗜鐵解磷細(xì)菌的分離篩選方法，在一種培養(yǎng)基上即可短時(shí)間內(nèi)篩選獲得同時(shí)具有嗜鐵和解磷能力的細(xì)菌菌株，簡化了分離篩選步驟，大大縮短篩選時(shí)間，提高了嗜鐵解磷細(xì)菌的分離篩選效率。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1為本發(fā)明所采用的CAS-P檢測平板的篩選結(jié)果；
[0022]圖2為細(xì)菌嗜鐵能力的檢測結(jié)果，圖中a為菌株在CAS檢測平板上產(chǎn)生的嗜鐵圈子；b為陰性對照，即無嗜鐵能力的菌株在CAS檢測平板上的生長情況；c為空白CAS檢測平板；
[0023]圖3為固體平板細(xì)菌解磷能力的檢測結(jié)果；
[0024]圖4為液體培養(yǎng)條件下細(xì)菌解磷能力的檢測結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面通過具體實(shí)例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的闡述，應(yīng)該說明的是，下述說明僅是為了解釋本發(fā)明，并不對其內(nèi)容進(jìn)行限定。
[0026]實(shí)施例中所用到的的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0027]實(shí)施例1
[0028]一種嗜鐵解磷細(xì)菌的分離篩選方法，包括以下步驟:
[0029](I)采集作物根圍土壤，去雜，接種于滅菌水中，接種量為1.0g/100mL，30°C條件下培養(yǎng)2.5小時(shí)，靜置，分離上清液，備用；
[0030](2)制備 CAS-P 檢測平板，先配制好 lmmol/L 的 CaCl2 溶液、lmmol/L 的 MgSO4.7Η20溶液、質(zhì)量濃度為10%的酸水解酪蛋白溶液(121°C，15分鐘單獨(dú)滅菌)；再分別取0.2mL的CaCl2溶液、0.2mL的MgSO4.7H20溶液、6mL的10 %的酸水解酪蛋白溶液，向其中加入Ca3 (PO4) 20.5g,用生物緩沖液 1，4-哌嗪二乙橫酸[piperazine-N, N-bis (2-ethanesulfonic acid)，Pipes]，調(diào)ρΗ6.8~7.0。去離子水定容到100mL。加入2g瓊脂粉，121°C，15分鐘滅菌。滅完菌后，當(dāng)溫度降低到60°C時(shí)，以5mL CAS藍(lán)色檢測液/每10mL培養(yǎng)基的量沿著三角瓶壁加入，混合均勻后倒平板，即得，注意不要產(chǎn)生氣泡，影響平板檢測實(shí)驗(yàn)；
[0031](3)將步驟⑴的上清液接種于CAS-P檢測平板上，接種量為150uL/平板，30°C條件下培養(yǎng)5天，觀察平板上菌落的生長情況，結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示:在CAS-P檢測平板上長出少數(shù)幾個(gè)細(xì)菌菌落，沒有明顯的暈圈
[0032]步驟(2)中,CAS藍(lán)色檢測液的制備方法為:將0.07g的鉻天青(Chrome azurol S，CAS)溶于50mL去離子水中，再加入1mL lmmol/L的FeCl3溶液(含有10mmol/L的HCL)，為溶液 A ;將 0.06g 的溴化十六烷基三甲銨(Hexadecyltrimethylammonium bromide, HDTMA)溶于40mL去離子水中，為溶液B ;將溶液A緩緩加入到B溶液中，輕輕晃動，使得溶液A與溶液B混合均勻，即得到CAS藍(lán)色檢測液。
[0033]實(shí)施例1篩選出的菌株的性能試驗(yàn):
[0034]無機(jī)磷細(xì)菌液體培養(yǎng)基:葡萄糖10g, (NH4)2SO40.5g, NaCl 0.3g, KCl 0.3g,MgSO4.7Η200.3g, Ca3 (PO4) 25.0g, FeSO4.7Η20 0.03g, MnSO4.4Η20 0.03g，定容至 100mL,ρΗ7.0~7.5。分裝后121°C，15分鐘滅菌。
[0035]無機(jī)磷細(xì)菌固體培養(yǎng)基:葡萄糖10g, (NH4)2SO40.5g, NaCl 0.3g, KCl 0.3g,MgSO4.7Η200.3g, Ca3 (PO4)21g, FeSO4.7Η20 0.03g, MnSO4.4Η20 0.03g，瓊脂粉 18 ~20g,定容至100mL, ρΗ7.0~7.5。分裝后121。。，15分鐘滅菌。
[0036] CAS檢測平板:I) CAS藍(lán)色檢測液的制作:將0.07g的鉻天青(Chrome azurol S,CAS)溶于50mL去離子水中，再加入1mL lmmol/L的FeCl3溶液(含有10mmol/L的HCL)，為溶液 A ;將 0.06g 的溴化十六烷基三甲銨(Hexadecyltrimethylammonium bromide, HDTMA)溶于40mL去離子水中，為溶液B ;將溶液A沿著燒杯的壁緩緩加入到B溶液中，輕輕晃動，使得溶液A與溶液B混合均勻，即得到溶液C =CAS藍(lán)色檢測液。121°C，15分鐘滅菌。2)CAS檢測平板的制作:先配制好lmmol/L的CaCl2溶液、lmmol/L的MgSO4.7H20溶液、10%的酸水解酪蛋白溶液(121°C，15分鐘單獨(dú)滅菌);再分別取0.2mL的CaCl2溶液、0.2mL的MgSO4.7H20溶液、6mL的10%的酸水解酪蛋白溶液，用生物緩沖液1，4-哌嗪二乙磺酸[piperazine-N, N~bis (2-ethanesulfonic acid), Pipes],調(diào) ρΗ6.8 ~7.0。去離子水定容到100mL。加入2g瓊脂粉，121°C，15分鐘滅菌。當(dāng)以上的固體培養(yǎng)基滅完菌后，溫度降低到60°C時(shí)，以5mL CAS藍(lán)色檢測液/每10mL培養(yǎng)基的量沿著三角瓶壁加入，混合均勻后倒平板。注意不要產(chǎn)生氣泡，以免影響平板檢測實(shí)驗(yàn)。
[0037]缺鐵培養(yǎng)基(g/L)=K2HPO40.1 ；KH2P043.0 ；MgS04.7Η20，0.2 ； (NH4)2SO4, 1.0 ;琥珀酸4.0，分裝后121°C，15分鐘滅菌。
[0038]1.固體平板上細(xì)菌嗜鐵能力的檢測
[0039]將CAS-P平板上長出的菌落接種于CAS檢測平板上，將無嗜鐵能力的菌株接種于CAS檢測平板上作為陰性對照，未接種菌種的CAS平板作為空白對照，30°C條件下培養(yǎng)3天，觀察菌落生長狀況及橘黃色暈圈的產(chǎn)生，并測定菌落和橘黃色暈圈的直徑。
[0040]結(jié)果顯示，橘黃色暈圈/菌落直徑比值為3.58 (圖2)，說明該菌株具有較強(qiáng)的嗜鐵能力。
[0041]2.固體平板上細(xì)菌解磷能力的檢測
[0042]將CAS-P平板上長出的菌落同時(shí)接種于無機(jī)磷固體培養(yǎng)基平板上，30°C條件下培養(yǎng)3天，觀察菌落生長狀況及解磷圈的產(chǎn)生，并測定菌落和解磷圈的直徑。
[0043]結(jié)果顯示，解磷圈/菌落直徑比值為2.92(圖3)，說明該菌株具有較強(qiáng)的解磷能力。
[0044]3.液體培養(yǎng)條件下細(xì)菌嗜鐵能力的檢測
[0045]將CAS-P平板上長出的菌落接種于缺鐵培養(yǎng)基中，30°C、150r/min條件下振蕩培養(yǎng)48小時(shí)，室溫靜置2小時(shí)，取上清液5mL，加入等量CAS藍(lán)色檢測液，混勻，于630nm處測定吸光值。以不接種菌株的缺鐵培養(yǎng)基為對照，重復(fù)3次。溶液中嗜鐵素產(chǎn)量通過以下公式計(jì)算:
[0046]嗜鐵素產(chǎn)量(％) = (Ar - As) /ArX 100%
[0047]其中，Ar為缺鐵培養(yǎng)基和等量CAS藍(lán)色檢測液的吸光值，As為上清液和等量CAS藍(lán)色檢測液混合液的吸光值。
[0048]結(jié)果顯示,本發(fā)明實(shí)施例1篩選出的菌株嗜鐵素產(chǎn)量為89.65%。
[0049]4.液體培養(yǎng)條件下細(xì)菌解磷能力的檢測
[0050]將CAS-P平板上長出的菌落接種于裝有10mL以Ca3(PO4)2為唯一磷源的無機(jī)磷細(xì)菌液體培養(yǎng)基(PH7.0)的250mL三角瓶中，30°C，160r/min條件下振蕩培養(yǎng)，接種后每天取5.0mL培養(yǎng)液，4000r/min離心10分鐘，并經(jīng)0.45 μ m微孔濾膜過濾，采用鑰藍(lán)比色法測定培養(yǎng)液中可溶性磷含量，并測定PH值。以不接種菌株的PVK液體培養(yǎng)基為空白對照，重復(fù)3次。
[0051]結(jié)果顯示，接種上述菌株的培養(yǎng)液中，可溶性磷含量為58-456 μ g/mL,第5天最高(456 μ g/mL)，之后，可溶性磷含量下降；培養(yǎng)液中pH值的變化趨勢與可溶性磷含量成反t匕，隨著可溶性磷含量的增加，培養(yǎng)液的PH值降低，第5天，pH值降到最低，之后，隨著可溶性磷含量的減少，培養(yǎng)液的PH值回升(圖4)。
[0052]由此可見，采用本發(fā)明篩選方法獲得的菌株同時(shí)具有嗜鐵和解磷能力。
【權(quán)利要求】
1.一種嗜鐵解磷細(xì)菌的分離篩選方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)采集作物根圍土壤，去雜，接種于滅菌水中，接種量為0.5-1.5g/100mL水，25-35°C條件下培養(yǎng)2-3小時(shí)，靜置，分離上清液，備用； (2)制備CAS-P檢測平板，將CaCl2溶液、MgSO4.7H20溶液、質(zhì)量濃度為8-12%的酸水解酪蛋白溶液混合均勻，向其中加入Ca3 (PO4) 2，調(diào)節(jié)pH為6.8-7.0，用水定容，每10mL定容溶液中含有CaCl2溶液0.1-0.3mL, MgSO4.7H20溶液0.1-0.3mL,酸水解酪蛋白溶液4_8mL，Ca3(PO4)20.3-0.8g ;加入瓊脂粉，瓊脂粉的加入量為l_3g/100mL定容溶液，滅菌，滅菌后待溫度降至50-60°C時(shí)，再加入CAS藍(lán)色檢測液，CAS藍(lán)色檢測液的加入量為3-8mL/100mL定容溶液，混勻后倒平板，即得； (3)將步驟(1)的上清液接種于CAS-P檢測平板上，接種量為100-200UL/平板，.25-35°C條件下培養(yǎng)3-5天，在該檢測平板上生長的菌株即為嗜鐵解磷細(xì)菌。
2.如權(quán)利要求1所述的一種嗜鐵解磷細(xì)菌的分離篩選方法，其特征在于，步驟(1)中，培養(yǎng)時(shí)，以150-200r/min進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。
3.如權(quán)利要求1所述的一種嗜鐵解磷細(xì)菌的分離篩選方法，其特征在于，步驟(1)中，接種量為1.0g/100mL水。
4.如權(quán)利要求1所述的一種嗜鐵解磷細(xì)菌的分離篩選方法，其特征在于，步驟(2)中，所述CaCl2溶液和MgSO4.7H20溶液的濃度均為lmmol/L。
5.如權(quán)利要求1所述的一種嗜鐵解磷細(xì)菌的分離篩選方法，其特征在于，步驟(2)中，所述CAS藍(lán)色檢測 液的制備方法為:將0.07g的鉻天青溶于50mL去離子水中，再加入1mLImmoI/L的FeCl3溶液，為溶液A ;將0.06g的溴化十六烷基三甲銨溶于40mL去離子水中，為溶液B ;將溶液A加入到B溶液中，混合均勻，即得到CAS藍(lán)色檢測液。
6.如權(quán)利要求1所述的一種嗜鐵解磷細(xì)菌的分離篩選方法，其特征在于，步驟(2)中，調(diào)節(jié)PH所用的試劑為生物緩沖液1，4-哌嗪二乙磺酸。
7.如權(quán)利要求1所述的一種嗜鐵解磷細(xì)菌的分離篩選方法，其特征在于，步驟(2)中，所述定容用的水為去離子水、純化水或蒸餾水。
8.如權(quán)利要求1所述的一種嗜鐵解磷細(xì)菌的分離篩選方法，其特征在于，步驟(2)中，所述滅菌的溫度為121°C，滅菌時(shí)間為15分鐘。
9.如權(quán)利要求1所述的一種嗜鐵解磷細(xì)菌的分離篩選方法，步驟(2)中，所述CAS-P檢測平板的制備方法為:將lmmol/L的CaCl2溶液0.2mL、lmmol/L的MgSO4.7Η20溶液0.2mL、質(zhì)量濃度為10%的酸水解酪蛋白溶液6mL混合均勻，向其中加入Ca3(PO4)20.5g，調(diào)節(jié)pH為.6.8-7.0，用去離子水定容至10mL,加入2g瓊脂粉，滅菌，滅菌后待溫度降至50_60°C時(shí)，再加入3-8mL CAS藍(lán)色檢測液，混勻后倒平板，即得。
【文檔編號】C12N1/20GK104178440SQ201410432410
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月28日
【發(fā)明者】余賢美, 艾呈祥, 付麗, 安淼, 王海榮, 劉嘉芬 申請人:山東省果樹研究所