一種超聲輔助酶解去糖基化制備低致敏大豆7s蛋白的方法
【專利摘要】一種超聲輔助酶解去糖基化制備低致敏大豆7S蛋白的方法，屬于食品生物【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明首先以大豆為原料，經(jīng)脫脂、提取大豆7S蛋白、超聲處理，然后向其添加十二烷基磺酸鈉、β-巰基乙醇等變性劑將蛋白進(jìn)行改性處理，再加入一定酶活的糖苷酶在一定條件下進(jìn)行去糖基化處理，離心取上清液，最后經(jīng)冷凍干燥得到低致敏大豆7S蛋白粉。本發(fā)明提供了一種降低大豆7S蛋白過敏原致敏性的新方法，其工藝簡單、條件溫和、易于控制；產(chǎn)品致敏性低，營養(yǎng)價值高，特別適用于大豆過敏患者的消費需求，具有良好的推廣和應(yīng)用前景，可用于低致敏食物的生產(chǎn)和加工過程中。
【專利說明】一種超聲輔助酶解去糖基化制備低致敏大豆7S蛋白的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]大豆含有蛋白質(zhì)、異黃酮、低聚糖、皂苷及磷脂等營養(yǎng)因子，因此其具有降血壓，預(yù)防癌癥、糖尿病和肥胖，改善體質(zhì)以及增強(qiáng)機(jī)體抗病能力等許多重要的生理功能。正因如此，大豆及其制品深受廣大消費者的青睞，其需求量也逐年上升。然而，大豆又是八大過敏食物之一,據(jù)報道:大豆過敏患者約占食物過敏總?cè)藬?shù)的25%，且多數(shù)患者為兒童，其中，大豆過敏兒童約占兒童過敏總?cè)藬?shù)的6%。據(jù)最新研究表明:90%的大豆過敏反應(yīng)都是由IgE介導(dǎo)而引發(fā)，而且尚未有大豆過敏的特效療法。因此為了降低大豆過敏的危害，利用食物加工的方法來降低甚至去除大豆中的主要致敏成分，開發(fā)低致敏的大豆產(chǎn)品，越來越受到消費者的關(guān)注。
[0003]大豆中蛋白質(zhì)按照沉降系數(shù)分為2S、7S、11S和15S蛋白。在7S蛋白中，伴大豆球蛋白含量最高，約占7S蛋白85% ;同時，盧-伴大豆球蛋白中的α亞基又是大豆主要過敏原之一。研究表明，P -伴大豆球蛋白是一種糖蛋白，其碳水化合物約占糖蛋白含量的4-5%。7S蛋白組分中還存在著兩個低豐度蛋白Gly m Bd 30K和Gly m Bd 28K，這兩種蛋白是糖蛋白，也是大豆中主要過敏蛋白。由此可知，7S蛋白中含有大豆三大主要過敏原，且均為糖蛋白。
[0004]目前，大豆蛋白常用的脫敏技術(shù)包括物理法、化學(xué)法、基因工程法和酶處理法等。物理法主要包括熱處理、高壓、剪切力、輻照等，這些處理方式會對食物的質(zhì)構(gòu)、營養(yǎng)等產(chǎn)生不利影響；化學(xué)法又易對食物造成污染；基因工程法雖然可去除大豆致敏原的內(nèi)源基因，但是這些蛋白的缺失很可能會直接影響大豆植株的生長及其它相關(guān)的生理特性，而且轉(zhuǎn)基因食物的安全性仍然存在廣泛爭議。
[0005]超聲波瞬間產(chǎn)生的空化作用使能量高度聚集，并在瞬間產(chǎn)生高溫、高壓等一系列極端的物理效應(yīng)，從而對蛋白的空間結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。如超聲波處理促使大豆Kunitz胰蛋白酶抑制劑分子中二硫鍵斷裂，巰基和β -折疊含量明顯增高，β -轉(zhuǎn)角和不規(guī)則卷曲含量則會降低，從而引起二級結(jié)構(gòu)的變化。超聲波能影響蛋白的空間結(jié)構(gòu)，但其作用力微弱，在降低食物致敏性作用方面并不十分顯著，常輔助其它方法用于降低過敏食物的致敏性。酶解法是一種最為常用的脫敏方法，其主要通過破壞過敏蛋白的某些致敏表位的作用，從而降低或者消除過敏蛋白致敏性。迄今為止，酶解法降低或消除過敏原的致敏性大多數(shù)都是針對過敏蛋白，而針對過敏蛋白(糖蛋白)表面的多糖鮮有研究。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的是提供一種超聲輔助酶解去糖基化制備低致敏大豆7S蛋白的方法。
[0007]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下。
[0008](I)稱取一定質(zhì)量的新鮮干大豆，研磨成粉末，脫脂風(fēng)干，按照常規(guī)方法提取大豆7S蛋白。
[0009](2)將步驟(1)中所提取的大豆7S蛋白在水浴超聲裝置中超聲處理，超聲功率為300-500W,時間為60min，然后向大豆7S蛋白溶液中加入0.05% (kg/L)十二烷基磺酸鈉(SDS)、0.1% (kg/L)/?-巰基乙醇，在100°C加熱10 min，將蛋白濃度稀釋至lg/L，加入糖苷酶，酶解溫度37°C，酶添加量200-1000U/mg蛋白，震蕩速度300 rpm,時間24_36h，期間保持反應(yīng)體系相對穩(wěn)定，反應(yīng)結(jié)束后在100°C滅酶10 min，快速冷卻反應(yīng)液。
[0010]所述的糖苷酶為肽N-糖苷酶F(PNGase F)、內(nèi)切糖苷酶H(Endoglycosidase H,Endo H)、內(nèi)切-乙酸葡萄糖胺苷酶(Endo-/?-acetylglucosaminidase F3, Endo F3)或糖肽酶A (Glycopeptidase A)中的任意一種。
[0011](3)將步驟(2)中所得的酶解液在-80°c預(yù)凍12 h，然后在冷凍溫度為_65°C、真空度100 Pa、加熱板溫度50°C條件下，真空冷凍干燥，至水分含量< 5%，所得粉末即為低致敏大豆7S蛋白。
[0012]本發(fā)明提供了一種在保證蛋白營養(yǎng)價值和功能特性的前提下，建立超聲波輔助酶解去糖基化降低甚至消除過敏蛋白(糖蛋白)致敏性的方法。由于超聲波預(yù)處理可以通過影響氫鍵、疏水作用等來改變蛋白的三級結(jié)構(gòu)，有利于亞基與糖苷酶充分接觸。將超聲輔助糖苷酶去糖基化處理可以顯著降低大豆7S蛋白的致敏性。
[0013]本發(fā)明的優(yōu)點:1、本發(fā)明所采用超聲輔助糖苷酶去糖基化技術(shù)操作簡單、條件溫和、易于控制，且安全、經(jīng)濟(jì)。2、本發(fā)明得到的產(chǎn)品致敏性低，且7S蛋白功能特性基本不受影響，營養(yǎng)價值高，能滿足大豆過敏患者的消費需求，具有良好的推廣和應(yīng)用前景，可用于食品、藥品和化妝品等領(lǐng)域。
【具體實施方式】
[0014]本發(fā)明將通過以下具體實施例作進(jìn)一步說明。
[0015]實施例1。
[0016](I)稱取5kg的新鮮干大豆，研磨成粉末，在研磨的過程中不斷加入液氮。與正己烷按1:15 (kg/L)脫脂3 h，后于4° C 9，OOOg離心30 min，棄上清，重復(fù)該脫脂操作三次，最后一次脫脂過夜，離心所得到的脫脂大豆粉在通風(fēng)櫥中揮發(fā)去除正己烷后備用。
[0017](2)提取大豆7S蛋白具體步驟如下。
[0018]a.脫脂大豆粉按1:15 (kg/L)溶于0.05M ρΗ8.0 Tris-HCl緩沖液中震蕩提取2h，離心取上清液備用，沉淀再重復(fù)浸提操作一次，混合兩次離心所得上清液。
[0019]b.向混合液中加入亞硫酸氫鈉(0.01M)，用IM HCl調(diào)pH至6.4，在4° C層析柜中攪拌過夜。
[0020]c.離心得上清液，向上清液中加入NaCl (0.25M)，IM HCl調(diào)pH至5.5，攪拌lh。
[0021]d.離心得上清液，IM HCl調(diào)上清液pH至5.0，攪拌lh。
[0022]e.離心得上清液，向上清液中加入兩倍體積的冰雙蒸水，IM HCl調(diào)pH至4.8。
[0023]f.離心得到沉淀，用雙蒸水洗滌沉淀，重復(fù)三次，后將沉淀復(fù)溶于pH 8.0,0.05MTris-HCl緩沖液，透析24 h，即得大豆7S蛋白。
[0024](3)將步驟(2)所提的蛋白在水浴超聲處理裝置(40 kHz,300ff)中超聲60min。
[0025](4)將步驟(3)超聲處理后的樣品進(jìn)行酶解去糖基化處理，加入0.05% (kg/L)SDS和0.1% (kg/L)/?-巰基乙醇100。。加熱10 min，將蛋白濃度稀釋至lg/L，按400U/mg蛋白的量向糖蛋白中加入PNGase F除去蛋白表面的多糖，酶解溫度為37°C，以300rpm震蕩24h，反應(yīng)結(jié)束后在100°C滅酶10 min，快速冷卻反應(yīng)液，然后4° C 5，000g，20min離心分離得到上清液，即為酶解去糖基化后的7S蛋白液。
[0026](5)將步驟(4)所得去糖基化的7S蛋白液真空冷凍干燥，至水分含量< 5%，所得粉末即為低致敏大豆7S蛋白。
[0027]實施例2。
[0028](I)稱取2kg的新鮮干大豆，研磨成粉末，在研磨的過程中不斷加入液氮。與正己烷按1:15 (kg/L)脫脂3 h，后于4° C 9，OOOg離心30 min，棄上清，重復(fù)該脫脂操作三次，最后一次脫脂過夜，離心所得到的脫脂大豆粉在通風(fēng)櫥中揮發(fā)去除正己烷后備用。
[0029](2)提取大豆7S蛋白具體步驟同實例I。
[0030](3)將步驟(2)所提的蛋白在水浴超聲處理裝置(40 kHz，400W)中超聲60min。
[0031](4)將步驟(3)超聲處理后的樣品進(jìn)行酶解去糖基化處理，加入0.05% (kg/L)SDS和0.1% (kg/L)/?-巰基乙醇100。。加熱10 min，將7S蛋白樣品稀釋至lg/L，按1000U/mg蛋白的量向糖蛋白中加入Endo H酶解溫度為37°C，以300 rpm震蕩36 h，反應(yīng)結(jié)束后在100°C滅酶10 min，快速冷卻反應(yīng)液，然后4° C 5, 000g, 20 min離心分離得到上清液，即為酶解去糖基化后的7S蛋白液。
[0032](5)將步驟(4)所得的去糖基化的7S蛋白液真空冷凍干燥，至水分含量< 5%，所得粉末即為低致敏大豆7S蛋白。
[0033]實施例3。
[0034](I)稱取4kg的新鮮干大豆，研磨成粉末，在研磨的過程中不斷加入液氮。與正己烷按1:15 (kg/L)脫脂3 h，后于4° C 9，OOOg離心30 min，棄上清，重復(fù)該脫脂操作三次，最后一次脫脂過夜，離心所得到的脫脂大豆粉在通風(fēng)櫥中揮發(fā)去除正己烷后備用。
[0035](2)提取大豆7S蛋白具體步驟同實例I。
[0036](3)將步驟(2)所提的蛋白在水浴超聲處理裝置(40 kHz，500W)中超聲60 min。
[0037](4)將步驟(3)超聲處理后的樣品進(jìn)行酶解去糖基化處理，加入0.05% (kg/L)SDS和0.l%(kg/L)/?_巰基乙醇100。。加熱10 min，將7S蛋白樣品稀釋至lg/L，按200U/mg蛋白的量向糖蛋白中加入Endo F3控制溫度37°C，以300rpm震蕩36 h，反應(yīng)結(jié)束后在100°C滅酶10 min，快速冷卻反應(yīng)液，然后4° C 5，000g，20min離心分離得到上清液，即酶解去糖基化后的7S蛋白液。
[0038](5)將步驟(4)所得的去糖基化的7S蛋白液真空冷凍干燥，至水分含量< 5%，所得粉末即為低致敏大豆7S蛋白。
[0039]實施例4。
[0040](I)稱取1kg的新鮮干大豆，研磨成粉末，在研磨的過程中不斷加入液氮。與正己烷按1:15 (kg/L)脫脂3 h，后于4° C 9，OOOg離心30 min，棄上清，重復(fù)該脫脂操作三次，最后一次脫脂過夜，離心所得到的脫脂大豆粉在通風(fēng)櫥中揮發(fā)去除正己烷后備用。
[0041](2)提取大豆7S蛋白具體步驟同實例I。
[0042](3)將步驟(2)所提的蛋白在水浴超聲處理裝置(40 kHz，400W)中超聲60min。
[0043](4)將步驟(3)超聲處理后的樣品進(jìn)行酶解去糖基化處理，加入0.05% (kg/L)SDS和0.1% (kg/L) P-巰基乙醇100°C加熱10 min，將7S蛋白樣品稀釋至lg/L，按600U/mg蛋白的量向糖蛋白中加入Glycopeptidase A,控制溫度37?,以300 rpm震蕩30 h,反應(yīng)結(jié)束后在100°C滅酶10 min，快速冷卻反應(yīng)液，然后4° C 5，000g，20min離心分離得到上清液，即為酶解去糖基化后的7S蛋白液。
[0044] (5)將步驟(4)所得的去糖基化的7S蛋白液真空冷凍干燥，至水分含量< 5%，所得粉末即為低致敏大豆7S蛋白。
【權(quán)利要求】
1.一種超聲輔助酶解去糖基化制備低致敏大豆7S蛋白的方法，其特征是按以下步驟:(1)稱取一定質(zhì)量的新鮮干大豆，研磨成粉末，脫脂風(fēng)干，按照常規(guī)方法提取大豆7S蛋白；(2)將步驟(1)中所提取的大豆7S蛋白在水浴超聲裝置中超聲處理，超聲功率為.300-500W,時間為60min，然后向大豆7S蛋白溶液中加入0.05% (kg/L)十二烷基磺酸鈉、 .0.1% (kg/L) 巰基乙醇，在100°C加熱10 min，將蛋白濃度稀釋至lg/L，加入糖苷酶，酶解溫度37°C，酶添加量200-1000U/mg蛋白，震蕩速度300 rpm,時間24_36h，期間保持反應(yīng)體系相對穩(wěn)定，反應(yīng)結(jié)束后在100°C滅酶10 min，快速冷卻反應(yīng)液； (3)將步驟(2)中所得的酶解液在_80°C預(yù)凍12h，然后在冷凍溫度為_65°C、真空度.100 Pa、加熱板溫度50°C條件下，真空冷凍干燥，至水分含量< 5%，所得粉末即為低致敏大? 7S蛋白； 步驟(2)所述的糖苷酶為肽N-糖苷酶F、內(nèi)切糖苷酶H、內(nèi)切1-乙酰葡萄糖胺苷酶或糖肽酶A中的任意一種。
【文檔編號】C12P21/00GK104164464SQ201410421064
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年8月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月26日
【發(fā)明者】楊安樹, 祖琴琴, 陳紅兵, 吳志華, 李欣, 佟平, 龔育清, 范臏 申請人:南昌大學(xué)