一種直接對臍血、羊水或外周血進行擴增的方法
【專利摘要】本發明公開了一種直接對臍血、羊水或外周血進行擴增的方法。以臍血樣本、羊水樣本或外周血樣本作為起始材料，不進行DNA提取，加入核酸擴增所需反應體系，直接進行PCR擴增，測定擴增產物；其中所述的反應體系中含有中性鹽、Tris溶液、鎂離子、擴增引物、dNTP混合物以及擴增用酶。本發明所提供的PCR擴增方法，不經過核酸的分離和提取過程，不經過任何核酸擴增前預處理步驟，直接從臍血、羊水或外周血中高效擴增目的核酸片段或全基因組核酸。本發明在產前基因診斷及染色體病快速診斷中具有很大的應用前景。
【專利說明】一種直接對臍血、羊水或外周血進行擴增的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程與產前診斷領域，涉及一種直接對臍血、羊水或外周血進行擴增的方法。
【背景技術】
[0002]在產前診斷中，高危、高齡以及具有不良孕產史、遺傳病家族史的孕婦來說，羊膜腔穿刺結合胎兒染色體核型分析和臍帶穿刺結合臍血染色體核型分析是全世界最經典的診斷方法，但該方法需經過細胞培養富集特定的胎兒細胞，非常耗時耗力，病人等待報告的周期長。因此，臨床上需要不經過細胞培養直接進行遺傳病診斷的方法，如全基因組測序技術、比較基因組雜交技術(arrayCGH)，但相對于檢測方法所需樣本量來說，羊水及臍血中胎J L遺傳物質較少，需要對遺傳物質進行放大。另外，遺傳病診斷前需對家系中的先癥者或父母雙方進行致病位點的尋找及確定，因此常抽取家系成員的外周血進行分析，同樣需要對遺傳物質進行擴增。聚合酶鏈式反應(PCR)技術是一種有效的體外擴增目的基因技術，它能在短時間內將少量的胎兒遺傳物質進行擴增放大，即將靶DNA擴增百萬倍，直接或者與其它技術結合后用于基因診斷和染色體病診斷。但一般步驟是從I _3ml臍血樣本或外周血樣本、10 -20ml羊水樣本中提取DNA后，再進行PCR擴增，DNA提取的方法有酚氯仿法、尿素法、柱提取法等，提取過程中通常要用到一些特定的試劑和復雜的步驟，盡管現在一些商品化的DNA純化試劑盒大大地簡化了這個過程，但仍然費時、費力，難于自動化，費用也增高，同時也容易產生核酸之間的交叉污染，更重要的是羊水以及血液樣品中可能存在的各種致病菌，甚至病毒等，對操作人員的健康會造成很大的威脅。當孕婦由于多種原因，如羊水量少、臍帶位置不好或胎兒不配合，導致獲取的臍血或羊水樣本量少，或者由于新生兒抽血困難獲得血量較少等，這種提取DNA后再擴增的方法更是不方便或不可行。如不經DNA提取直接利用臍血、羊水或外周血進行擴增，可大大節約實驗時間和檢測成本，也可避免樣本間的交叉污染，將會有很廣闊的應用前景。
[0003]由于體液中存在一些成分干擾了細胞的裂解，抑制了 DNA聚合酶的活性，因此給直接運用臍血、羊水或外周血進行PCR擴增帶來了難度，另外，臍血或外周血中的抗凝劑也影響PCR擴增。Al - soud研究小組發現血液中對PCR擴增的主要抑制物質是免疫球蛋白 G(IgG)【Al -Soud WA, Jonsson LJ, Radstrom P.1dentificat1n and characterizat1nof immunoglobulin G in blood as a major inhibitor of diagnostic PCR.J ClinMicrob1l, 2000, 38:345 -50】，將純化的IgG(PIgG)與模板DNA —起加熱后發現PCR擴增受到阻礙。之后研究又發現紅細胞中的血紅蛋白和白細胞中的乳鐵蛋白也是人血細胞中的兩種主要的 PCR 抑制劑【Al -Soud WA, Radstrom P.Purificat1n and characterizat1n ofPCR-1nhibitory components in blood cells.J Clin Microb1l 2001 ；39:485 - 93.】。抑制劑與基因組DNA之間的相互作用阻止了 DNA聚合酶與DNA模板之間的結合和延伸反應的發生，影響了 PCR的擴增，給直接利用臍血或外周血進行PCR擴增帶來了難度。
[0004]本研究小組曾提出了不經過核酸提取，直接對羊水進行高溫處理后加入HpHbuffer中進行擴增用于快速診斷脊肌萎縮癥【黃歡等，羊水直接PCR法快速診斷脊肌萎縮癥的實驗研究，現代生物醫學進展，2013，13 (25):6845 - 7】，其中HpH buffer的成分為高 pH 值的 Tris - HCl 溶液(pH 8.81 - 9.90)【Huang et al, Direct polymerase chainreact1n (PCR) from human whole blood and filter - paper - dried blood by using aPCR buffer with a higher pH, Analytical B1chemistry, 2008，375，370 -372】。羊水中含有的蛋白質樣本經過高溫變性，空間結構發生變化而導致溶解度降低，沉淀，另外，高溫處理羊水使得羊水中的胎兒細胞破裂，DNA釋放入溶液中參與PCR擴增。但該方法也存在一些缺點，如需在PCR擴增前對羊水進行開蓋離心，去上清后，高溫處理，之后再次開蓋取處理后的羊水樣本加入HpH buffer中，雖然與羊水DNA提取相比簡化了擴增前處理步驟，節省了成本，但仍然存在反復開蓋產生污染的風險，也同樣存在一些擴增前處理的操作步驟。然而，羊水不經過高溫處理直接加入HpH buffer中卻無法實現有效的擴增。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種直接對臍血、羊水或外周血進行擴增的方法。
[0006]本方法的目的是通過下列技術措施實現的:
[0007]—種直接對臍血、羊水或外周血進行擴增的方法，以臍血、羊水或外周血作為起始材料，不進行濃縮，也不進行DNA提取，加入核酸擴增反應體系的所需物質構成反應體系，直接進行PCR擴增，測定擴增產物(包括凝膠電泳、芯片電泳、測序等)；其中最終的反應體系中含有中性鹽、0.04 - 0.09mol/L的Tris溶液、1.5-3.0mmoI/L鎂離子及擴增引物，反應體系 pH 為 8.0 - 10.00
[0008]所述的直接對臍血、羊水或外周血進行擴增的方法中，臍帶血樣本或外周血樣本加到擴增用反應管的底部，羊水樣本加到擴增用反應管中，不對反應管進行任何攪動，直接加入核酸擴增所需反應體系進行PCR擴增。羊水加入量優選1- 5μ 1，進一步優選2μ I。
[0009]所述的直接對臍血或外周血進行擴增的方法中，臍血樣本選自含抗凝劑的抗凝臍血、不含抗凝劑的干燥濾紙臍血、含抗凝劑的干燥濾紙臍血。
[0010]所述的血樣為肝素鈉抗凝血或濾紙血時，所述的核酸擴增所需反應體系中還包括甘油，甘油的終濃度在0.5% - 25% (V/V)。
[0011]所述的羊水為羊膜腔穿刺抽取的胎兒羊水。
[0012]所述的中性鹽優選硫酸銨、乙酸銨、乙酸鈉、硝酸銨、硝酸鈉、硫酸鉀、草酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化銨、氯化鈉、磷酸鈉中的任意一種，進一步優選硫酸銨；所述的中性鹽在核酸擴增反應體系中的濃度為5mmol/L -20mmol/L。當中性物質為硫酸銨時，其在核酸擴增反應體系中的濃度優選6mmol/L~16mmol/L,進一步優選10mmol/L。
[0013]所述的直接對臍血、羊水或外周血進行擴增的方法中，擴增對象為臍血或外周血時，控制反應體系的pH為8.5 -10.0 ;擴增對象為羊水時，控制反應體系的pH為8.0 -10.0。
[0014]所述的直接對臍血、羊水或外周血進行擴增的方法中，反應體系中還包含PCR反應所需的特異性引物和Taq DNA聚合酶，特異性引物的濃度為0.8-1.6pmol/μ 1，擴增對象為臍血或外周血時，Taq DNA聚合酶的濃度為0.04 - 0.15υ/μ I。擴增對象為羊水時，TaqDNA聚合酶的濃度為0.15 - 0.2U/ μ I。
[0015]所述的反應體系中，所述的Tris溶液濃度優選0.06mol/L;鎂離子濃度優選2.0mmoI/L ；dNTP濃度優選0.2mmol/L,特異性引物的濃度優選0.8 - 1.6ρπιο1/μ I。擴增對象為臍血或外周血時，每條特異性引物濃度進一步優選1.0pmol/ μ I ；Taq DNA聚合酶濃度優選0.05U/ μ I ;擴增對象為羊水時，每條特異性引物濃度進一步優選1.2pmol/y I ；TaqDNA聚合酶濃度優選0.20U/ μ I。
[0016]一種用于直接對臍血或外周血進行擴增的試劑組合物，包括5mmol/L - 20mmol/L中性鹽、0.04 - 0.09mol/L Tris 溶液、1.5-3.0mmol /I,續離子溶液、0.1 ~0.3mmol/L dNTP混合物、0.04~0.2U/ μ I Taq DNA聚合酶及滅菌蒸餾水，pH為8.0 - 10.0。
[0017]所述的中性鹽優選硫酸銨、乙酸銨、乙酸鈉、硝酸銨、硝酸鈉、硫酸鉀、草酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化銨、氯化鈉、磷酸鈉中的任意一種，進一步優選硫酸銨。
[0018] 本發明通過有效抑制蛋白質與基因組DNA之間的靜電作用，實現直接以臍血、羊水或外周血為模板進行PCR擴增。臍血、羊水及外周血中含有的蛋白質類PCR抑制劑在水溶液中的溶解度取決于蛋白質分子表面離子周圍的水分子數目，亦即主要是由蛋白質分子外周親水基團與水形成水化膜的程度以及蛋白質分子帶有電荷的情況決定的。在含蛋白質類抑制劑的PCR反應液中加入中性鹽后，由于中性鹽與水分子的親和力大于蛋白質，致使蛋白質分子周圍的水化層減弱乃至消失。同時，中性鹽加入蛋白質溶液后由于離子強度發生改變，蛋白質表面的電荷大量被中和，更加導致蛋白質溶解度降低，蛋白質分子之間聚集而沉淀，消除蛋白質對PCR擴增的抑制。肝素鈉抗凝血中的肝素鈉成分以及濾紙血中的濾紙成分對PCR擴增有抑制作用，導致擴增失敗，使用甘油實現肝素鈉抗凝血以及濾紙血直接作為擴增的起始材料。EDTA抗凝血以及枸櫞酸鈉抗凝血直接PCR時，加入甘油提高EDTA抗凝血以及枸櫞酸鈉抗凝血的擴增產量。
[0019]本發明的有益效果:
[0020](I)提高了檢測效率
[0021]通常分子生物學實驗室進行臍血樣本、羊水樣本及外周血樣本中DNA檢測時，在PCR擴增前，均需要對臍血、羊水或外周血中的DNA進行提取。以常規使用的酚氯仿提取法為例，整個DNA提取過程耗時近2h ;如果使用商品化的DNA提取試劑盒，一個提取過程也需花費Ih左右的時間。而利用本發明進行臍血、羊水或外周血擴增，省略了 DNA提取這一繁瑣的過程，從收到樣本到上機擴增、電泳、檢測出結果，整個過程可控制在2h以內，極大地提高了檢測效率，節約了實驗時間。
[0022](2)降低了檢測成本
[0023]DNA提取除了各種試劑以外，還需要配備一些儀器設備，如恒溫水浴鍋，高速離心機等。如果使用商品化試劑盒進行DNA提取，則成本還要提高。而使用本發明直接進行臍血樣本、羊水樣本及外周血樣本擴增，無需提取DNA。其配制的試劑成本低，全部檢測成本與普通PCR擴增基本相同。
[0024](3)減少了交叉污染
[0025]常規的DNA提取過程需要反復打開管蓋，吸去棄液，加入新的試劑，最后還需要將上清轉移至另外的試管中。人工操作步驟多且繁瑣。平行提取多份樣本時，交叉污染的幾率更大。即使不提取核酸而使用高溫前處理步驟釋放羊水中DNA，也存在濃縮及開管等易引起交叉污染的步驟，與起始模板為DNA的PCR反應相比，直接對羊水原液、臍血或外周血進行擴增，不需濃縮，也不許進行DNA提取，僅在PCR反應液配制時將樣本加入即可，大大降低了污染的可能。
[0026](4)產前基因診斷及染色體病快速診斷中的臨床應用前景廣闊
[0027]臍血、羊水或外周血直接擴增法操作簡便易行，省略了傳統的DNA提取步驟，節約了檢測成本，降低了樣本的需要量，血液樣本僅需5μ L以內，羊水樣本僅需1- 4μ L即可，較之直接擴增減少了交叉污染的可能，縮短了檢測時間，提高了檢測效率。該發明無需特殊儀器設備，僅需PCR實驗室最基本的儀器即可開展檢測。因此，在基于核酸擴增測定的產前基因診斷及染色體病快速診斷中具有較好的應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0028]圖1是對比不同類型的臍血樣本直接PCR擴增的效果。A圖為經純化后的DNA PCR擴增結果圖；Β圖為添加2Na.EDTA抗凝劑的臍血直接PCR擴增結果圖；C圖為添加肝素鈉抗凝劑的臍血直接PCR擴增結果圖；D圖為添加枸櫞酸鈉抗凝劑的臍血直接PCR擴增結果圖；E圖為未添加抗凝劑的濾紙臍血直接PCR擴增結果圖；F圖為添加肝素鈉抗凝劑的濾紙臍血直接PCR擴增結果圖，其中左側的泳道添加了甘油，右側泳道未添加甘油。
[0029]圖2是在PCR反應體系中直接加入臍血或外周血樣本后攪拌與不攪拌對擴增結果的影響。泳道2，3，6及7不進行攪拌；泳道4，5，8及9進行攪拌。泳道2，4，6及8為一個胎兒的臍血樣本，泳道3，5，7及9為另一個成人的外周血樣本。
[0030]圖3是緩沖液中不同中性鹽硫酸銨濃度對擴增的影響。硫酸銨濃度分別為100mmol/L (泳道 I) ’ HOmmoI /I,(泳道 2) ’ BOmmoI /I,(泳道 3), 40mmol/L (泳道 4), 1 BmmoI / 泳道 6), 12mmol/L (泳道 7), 10mmol/L (泳道 8), 8mmol/L (泳道 9),Bmmol /I,(泳道 10)和 Ommol /I,(泳道 11)。
[0031]圖4臍血或外周血直接PCR在產前診斷單基因遺傳病檢測中的應用。A:臍帶血軟骨發育不全基因檢測:臍帶血軟骨發育低下基因檢測；C:外周血軟骨發育不全基因檢測；D:外周血軟骨發育低下基因檢測。
[0032]圖5是不同擴增體系對羊水直接PCR擴增效果的影響。泳道I =TaKaRa rTaq DNA聚合酶擴增體系，加入2 μ I羊水原液擴增；泳道2 =Promega Taq DNA聚合酶體系，加入2 μ I羊水原液擴增；泳道3:HpH buffer體系，加入2 μ I羊水原液擴增；泳道4:本發明中核酸擴增反應體系，加入2μ I羊水原液擴增；泳道5:本發明中核酸擴增反應體系中去除中性鹽，加入2 μ I羊水原液擴增；泳道6:本發明中核酸擴增反應體系，加入2 μ I高溫濃縮處理后的羊水。
[0033]圖6是羊水直接PCR擴增時加入的不同量羊水量考察及效果評價。泳道1:2 μ I羊水原液；泳道2:5 μ I羊水原液；泳道3:10 μ I羊水原液；泳道4:19 μ I羊水原液。
[0034]圖7是考察酶的不同加入量以及引物的不同加入量對擴增效率的影響。泳道1:
0.05U/ μ I Promega Taq DNA 聚合酶，0.4pmol/ μ I 每條引物；泳道 2:0.1OU/ μ I PromegaTaq DNA 聚合酶,0.4pmol/μ I 每條引物；泳道 3:0.15U/μ I Promega Taq DNA 聚合酶，
0.4pmol/ μ I 每條引物；泳道 4:0.20U/ μ I Promega Taq DNA 聚合酶，0.4pmol/ μ I 每條弓丨物；泳道5:0.1OU/ μ I Promega Taq DNA聚合酶，0.8pmol/μ I 每條引物；泳道6:0.1OU/μ I Promega Taq DNA聚合酶，1.2pmol/ μ I每條引物。核酸擴增反應體系pH 8.0 - 10.0,含濃度0.06mol/L Tris溶液，濃度在2.0mmoI/L的鎂離子，濃度為10mmol/L的中性鹽，濃度為0.2mmol/L的dNTP混合物。
[0035]圖8羊水直接PCR在產前診斷單基因遺傳病檢測中的應用。A:進行性肌營養不良基因檢測；B:Y染色體微缺失基因檢測。
【具體實施方式】
[0036]實施例1
[0037]I)臍血DNA的提取:對收集的臍血標本，每份取0.5ml，按酚/氯仿法提取，再以TE緩沖液溶解而得。實驗用DNA模板均用紫外分光光度法測定其濃度及純度，以TE緩沖液調整終濃度為20~10ng/μ I備用。
[0038]2)臍血樣本的準備:臍靜脈穿刺抽取孕婦的臍帶血，一部分加入一定量的抗凝劑，本實驗采用的抗凝劑分別是枸櫞酸鈉、2Na -EDTA和肝素鈉，留取部分抗凝血置于4°C待用，同時取幾滴肝素鈉抗凝血滴于干凈濾紙上干燥室溫保存，其余血樣放在-35°C冷凍保存。另一部分血液不加入抗凝劑，直接滴到干凈的濾紙上，并置于干燥器中室溫保存。
[0039]3) PCR反應及產物檢測:
[0040]以純化的DNA為模板進行PCR，反應體系25μ1，組成為:lXTaq buffer(不含Mg2+)，每條引物 0.4pmol/μ I, 1.5mmol/L MgCl2,0.2mmol/L dNTP 混合物，0.04U/μ I TaqDNA聚合酶，用滅菌水補充至25 μ I。
[0041]以臍血為模板進行PCR，直接取抗凝臍血模板0.5μ I或適量濾紙血，加入含中性鹽硫酸銨的 buffer (Tris 0.06mol/L, MgCl22mmol/L,硫酸銨 10mmol/L, pH9.3)，0.2mmol/LdNTP混合物，0.05U/y I Taq DNA聚合酶，兩條引物(序列分別為:F1:5，_ACC RCT GTA CTGACT GTG ATT ACA C - 3’ (SEQ ID N0.1)以及 Rl:5’ - GCA CYT CTT TGG TAT CYG AGA AAGT -3，(SEQ ID N0.2))各lpmol/μ 1，滅菌蒸餾水加至25μ I。在肝素鈉抗凝血、無抗凝劑濾紙血及肝素鈉抗凝濾紙血擴增體系中分別加入10% (v/v,以整個反應體系的總體積為基準)的甘油。放入PCR儀中，96°C，3分鐘；(96°C，30秒；55°C，30秒；72°C，I分鐘)35個循環；72°C，7分鐘；4°C保存。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。結果如圖1所示，各種抗凝血與DNA擴增相比，所有的血樣都成功得到了高效擴增。含中性鹽的擴增體系能適用于臨床各種血樣的直接擴增，甘油能提高肝素鈉抗凝濾紙血的擴增效率，實現快速基因檢測。
[0042]本實施例中PCR反應體系中各物質的濃度均為在反應體系中的終濃度。
[0043]實施例2
[0044]利用實施例1的方法對向臍帶血樣本或外周血樣本中加入反應體系后攪動與不攪動反應管進行擴增效率考察。結果如圖2所示，泳道2，3，6及7完全參照實施例1流程進行，泳道4，5，8及9在實施例1流程中擴增前加入攪動反應管的步驟，攪動反應管后擴增效率明顯降低，擴增產量極大的較少，結果在擴增兩份不同的血樣(泳道2，4，6及8為一個胎兒的臍血樣本，泳道3，5，7及9為另一個成人的外周血樣本)，每份血樣擴增兩個基因片段(泳道2 - 5擴增片段的大小為539bp，擴增引物為上游引物F2:5’ - TCA ACT GCA CAA CGATTG TCA - 3’ (SEQ ID N0.3)與下游引物 R2:5’ - TCC CTT AGC ACC TAG TTG TAA - 3’ (SEQID N0.4);泳道6 - 9擴增片段的大小為338bp，擴增引物為F3:5’ - CAT CAG ACT TTG ACCGTA-3’ (SEQ ID N0.5)與 R3:5，-AGA ATT AGC AAG CTG CCA-3’ (SEQ ID N0.6))，都得到了相似的擴增效率，攪動含有血樣的反應管確實會降低臍血直接PCR的擴增效率。進一步實驗發現通過增加DNA聚合酶的用量能夠提高PCR管攪拌后的擴增效率，因此認為攪拌引起的低擴增效率有可能是由于懸浮的絮狀物抓住了 PCR混合物中的DNA聚合酶，而在不攪動的情況下絮狀物只形成在PCR管底的血樣周圍的局部區，不會與溶液中分散的大量DNA聚合酶結合，因此也就不會對擴增產生明顯的抑制。因此在臍血或外周血擴增的實驗操作中，在加入臍血樣本或外周血樣本后不攪動PCR管直接進行PCR擴增。
[0045]實施例3
[0046]利用實施例1的方法對血樣擴增緩沖液中中性鹽硫酸銨濃度進行研究，在其它PCR條件和成分不變的情況下，改變硫酸銨的加入量,分別為0mmol/L,6 mmol/L,8mmol/L,10mmol/L,12mmol/L,13mmol/L,16mmol/L,40mmol/L,6OmmoI/T,,80mmol/L 和 1OOmmol/L，進行PCR擴增和電泳檢測。結果如圖3所示，硫酸銨的加入量在很寬范圍內(6mmol/L - 16mmol/L)均能得到較好的擴增結果(泳道5 -10)。與硫酸銨加入量為O (泳道11)的陰性做對照，顯示硫酸銨的加入對PCR的成功起到了重要作用。硫酸銨加入量最適范圍在8mmol/L - 13mmol/L(泳道6 - 9)之間,硫酸銨的最佳加入量為10mmol/L(泳道8)。過多的硫酸銨對反應有抑制作用(泳道1- 4)。不加入中性鹽硫酸銨也無明顯擴增產物。
[0047]實施例4
[0048]單基因遺傳病指由于單個基因的突變而引起的遺傳病，其遺傳方式符合孟德爾定律，所以又稱孟德爾遺傳病。人類大約有3萬個基因，目前約有2000個單基因病的致病基因被鑒定。多數單基因病目前尚無有效的治療，給家庭帶來沉重的負擔。對于一些嚴重的單基因病可通過基因診斷和產前診斷的方法，避免再生育患兒。在本實施例中檢測了兩種單基因遺傳病，分別為軟骨發育不全(臍血或外周血直接PCR診斷)以及軟骨發育低下(臍血或外周血直接PCR診斷)，具體方法和結果分析如下:
[0049]I)軟骨發育不全(ACH)致病基因為FGFR3基因，位于4pl6.3，包含19個外顯子和18個內含子，全長16.5kb，由806個氨基酸殘基編碼組成。FGFR3受體蛋白包括三部分:胞外區為3個免疫球蛋白樣的配體結合區(Ig 1、Ig II和IgIII);跨膜區；胞內區為酪氨酸激酶區(TKl和TK2)。目前已知，ACH患者基因突變的同質性與其臨床表型的同質性相一致，所有ACH患者都是由于FGFR3跨膜區突變引起。其中98 %為G380R突變，還有個別為G375C或G346E突變。FGFR3發生G380R突變，產生ACH表型，是由于在受體高度疏水的跨膜區引入一個親水殘基，影響跨膜區α -螺旋的形成。FGFR3基因G375C突變，是由于在受體跨膜區引入I個大的疏水性Cys，可以形成二硫鍵，從而改變FGFR3分子的高級結構，產生ACH表型。ACH是一種常染色體顯性遺傳病。95%以上的患者是由于FGFR3基因跨膜區1138位核苷酸G — A的突變，少數為G — C的顛換，導致380位密碼子的錯義突變，即精氨酸替代了甘氨酸，而致病。該實施例中建立的方法為臍血或外周血直接PCR后電泳測序。擴增用引物序列為:F4:5’ - AGG AGC TGG TGG AGG CTG A - 3，(SEQ ID N0.7)以及 R4:5，- GGAGAT CTT GTG CAC GGT GG-3，(SEQ ID N0.8)。結果如圖4A及圖4C所示，該胎兒及患兒均發生了 1138位核苷酸G — A的突變，即均診斷為軟骨發育不全。
[0050]2)軟骨發育低下(HCH)和ACH —樣，都是遺傳性侏儒，呈常染色體顯性遺傳。HCH和ACH均以身材矮小為特征，表現為四肢過短、椎骨莖縮短。雖然常見的HCH癥狀較ACH輕，但二者僅存在細微的表型差異。因此，臨床上很難將HCH從此類疾病中鑒別出來。60%~65%的HCH患者被檢測到FGFR3基因的N540K突變。該突變影響了胞內區酪氨酸激酶的活性，或者在無配體結合時，調節FGFR3形成二聚體，引起受體的異位表達或暫時異常表達。該實施例中所用方法為臍血或外周血直接PCR后電泳測序。擴增用引物序列為:F5:5’ -ACTGAC AAG GAC CTG TCG GAC C - 3’ (SEQ ID N0.9)以及 R5:5’ - TTG CAG GTG TCG AAG GAGTAG TC -3’ (SEQ ID N0.10)。結果如圖4B及4D所示，該胎兒(圖4B)發生了 N540K突變，即核苷酸C — A的突變，該胎兒診斷為軟骨發育低下。該患者(圖4D)未發生N540K突變，不診斷為N540K突變引起的軟骨發育低下。
[0051]實施例5
[0052]實驗流程:
[0053]I)羊水樣本處理:經過羊膜腔穿刺抽取的羊水樣本，分成兩份，一份直接貯存于4°C冰箱備用，另一份取100 μ I于0.2ml PCR管中，短暫離心30秒后，去除上清90 μ 1，將剩余的10 μ I樣本置于PCR儀上95°C處理2 - 10分鐘，結束后取出備用。
[0054]2)PCR擴增:使用四種不同擴增體系進行羊水直接PCR擴增考察，擴增體系25 μ I (含樣本)分為四種:(I) TaKaRa公司的rTaq DNA聚合酶，及對應buffer體系成分；
(2)Promega公司的Taq DNA聚合酶,及對應buffer體系成分；(3) HpH buffer體系:pH為9.0 的 Tris-HCl 溶液【Huang et al, Direct polymerase chain react1n (PCR) from humanwhole blood and filter - paper - dried blood by using a PCR buffer with a higherpH, Analytical B1chemistry, 2008, 375, 370 - 372】,每條濃度為 1.2pmol/ μ I 的引物，濃度為0.2U/y I的擴增用酶，濃度為0.2mmol/L的dNTP混合物；(4)本發明中核酸擴增反應體系(pH9.3)，含濃度 0 濃度為1.2pmol/y I的引物，濃度為0.2U/y I的擴增用酶，濃度為
0.2mmol/L的dNTP混合物；(5)除不含中性鹽外，其他同⑷中的反應體系。
[0055]引物序列分別為:上游引物:F1:5，-ACC RCT GTA CTG ACT GTG ATT ACA C -3，(SEQID N0.1)以及下游引物:R1:5’-GCA CYT CTT TGG TAT CYG AGA AAG T -3’ (SEQ ID N0.2)。
[0056]在PCR單管中加入備用羊水原液樣本或濃縮后高溫處理的羊水樣本2 μ I。在94°C預變性3分鐘后，于94°C 20秒、55°C 25秒以及72°C 20秒的條件下擴增35個循環，最后于72°C延伸5分鐘。
[0057]3)電泳檢測:取PCR產物3μ1與上樣緩沖液混合后，點樣于2%瓊脂糖凝膠，在100V電壓電泳15min。凝膠成像儀800ms曝光，根據擴增片段的有無來判斷是否擴增成功。由圖5的結果可以看出，使用商品化的Promega體系，TaKaRa體系以及HpH buffer體系(泳道1- 3)，均無明顯的擴增產物出現，而使用本發明中核酸擴增反應體系進行羊水直接PCR擴增，擴增效果較好，電泳圖上出現明顯的擴增產物(泳道4)，能達到與濃縮及高溫處理羊水擴增(泳道6)相似的擴增強度。在本發明中核酸擴增反應體系去除中性鹽成分，擴增強度有所減弱(泳道5)，說明中性鹽成分能提高羊水直接擴增的效率。
[0058]實施例6
[0059]經過羊膜腔穿刺抽取的羊水樣本，分別取2 μ 1、5μ 1、10μ I以及19 μ I加入實施例5的核酸擴增反應體系中進行PCR擴增，擴增用引物及程序同實施例5。結果如圖6所示，擴增效果(即擴增產物量):泳道1>泳道2>泳道3>泳道4。加入的羊水樣本量越大，對PCR擴增的抑制成分越多，擴增效率越差。加入量大于10μ I擴增效率急劇下降，19μ I的加入量導致無明顯擴增產物。因此，羊水的適合加入量小于等于5μ I。
[0060]實施例7
[0061]利用實施例6的方法對核酸擴增反應體系中酶的加入量以及引物的加入量進行擴增效率的考察，羊水樣本的加入量為2μ I。結果如圖7所示，隨著酶的加入量增大，擴增效率提高，濃度達到0.15U/ μ I時，擴增效率到達高點(擴增效果:泳道1>泳道2>泳道3以及泳道4)，再增加酶量，擴增效率變化不明顯(泳道3以及泳道4擴增效率相似)；隨著引物量的增加，擴增效率提高(擴增效果:泳道6>泳道5>泳道2)，考慮到引物二聚體的產生，本發明優選引物量為1.2ρπι01/μ I。
[0062]實施例8
[0063]在本實施例中檢測了兩種單基因遺傳病，分別為進行性肌營養不良(羊水直接PCR診斷)，Y染色體微缺失(羊水直接PCR診斷)，具體方法和結果分析如下:I)進行性肌營養不良診斷:進行性肌營養不良簡稱DMD，是一種X染色體連鎖隱性遺傳病。DMD主要由dyst1phin基因的缺失突變，重復突變，點突變和微小插入/缺失引起。最多見的突變是基因內部的缺失，占總突變類型的65%。dystrophin基因共有79個外顯子，通過測定79個外顯子中的19個熱點缺失區域，可以測到90%的缺失突變。在DMD基因的突變中，約有30%是新發突變，而非遺傳所致。本實施例通過羊水直接PCR擴增結合電泳的方法來檢測DMD 基因 19 對外顯子 3,4,6,8,12，13，17，19，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52 和 60，結果如圖8A所示，正常胎兒所有的片段都獲得明顯的擴增產物，患者胎兒缺失了 3，4及6號外顯子，診斷為DMD。
[0064]
【權利要求】
1.一種直接對臍血、羊水或外周血進行擴增的方法，其特征在于以臍血、羊水或外周血作為起始材料，不進行濃縮，也不進行DNA提取，加入核酸擴增反應體系的所需物質構成反應體系，直接進行PCR擴增，測定擴增產物；其中最終的反應體系中含有中性鹽、0.04 - 0.09mol/L的Tris溶液、1.5 - 3.0mmoI/L鎂離子、特異性擴增引物、dNTP混合物和Taq DNA聚合酶。
2.根據權利要求1所述的直接對臍血、羊水或外周血進行擴增的方法，其特征在于臍血樣本、外周血樣本加到擴增用反應管的底部，羊水樣本加到擴增用反應管中，不對反應管進行任何攪動，直接加入核酸擴增所需反應體系進行PCR擴增；羊水的加入量為1- 5μ I。
3.根據權利要求2所述的直接對臍血、羊水或外周血進行擴增的方法，其特征在于血樣選自含抗凝劑的抗凝血、不含抗凝劑的干燥濾紙血、含抗凝劑的干燥濾紙血。
4.根據權利要求3所述的直接對臍血、羊水或外周血進行擴增的方法，其特征在于所述的血樣為肝素鈉抗凝血或濾紙血時,所述的核酸擴增所需反應體系中還包括甘油，甘油的終濃度在0.5% - 25% (V/V)。
5.根據權利要求1所述的直接對臍血、羊水或外周血進行擴增的方法，其特征在于所述的羊水為羊膜腔穿刺抽取的胎兒羊水。
6.根據權利要求1所述的直接對臍血、羊水或外周血進行擴增的方法，其特征在于所述的中性鹽選自硫酸銨、乙酸銨、乙酸鈉、硝酸銨、硝酸鈉、硫酸鉀、草酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化銨、氯化鈉、磷酸鈉中的任意一種；所述的中性鹽在核酸擴增反應體系中的濃度為Smmol/I, - 20mmol/L。
7.根據權利要求1所述的直接對臍血、羊水或外周血進行擴增的方法，其特征在于擴增對象為臍血或外周血時，控制反應體系的pH為8.5 - 10.0 ;擴增對象為羊水時，控制反應體系的pH為8.0 - 10.00
8.根據權利要求1所述的直接對臍血、羊水或外周血進行擴增的方法，其特征在于反應體系中特異性引物的濃度為0.8 - 1.6ρπι01/μ 1，擴增對象為臍血或外周血時，Taq DNA聚合酶的濃度為0.05 -0.15U/y I ;擴增對象為羊水時，Taq DNA聚合酶的濃度為0.15 -0.2U/μ I。
9.一種用于直接對臍血、羊水或外周血進行擴增的試劑組合物，其特征在于包括Smmol /I, - 20mmol/L 中性鹽、0.04 - 0.09mol/L Tris 溶液、1.5-3.0mmol /I,鎂離子溶液、0.1~0.3mmol/L dNTP混合物、0.04~0.2U/ μ I Taq DNA聚合酶及滅菌蒸餾水，pH為8.0 - 10.0。
10.根據權利要求9所述的試劑組合物，其特征在于所述的中性鹽選自硫酸銨、乙酸銨、乙酸鈉、硝酸銨、硝酸鈉、硫酸鉀、草酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化銨、氯化鈉、磷酸鈉中的任意一種。
【文檔編號】C12Q1/68GK104178574SQ201410419644
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月22日 優先權日:2014年8月22日
【發明者】黃歡, 李朔, 孫麗洲, 周國華 申請人:黃歡