診斷傳染病病原體及其藥物敏感性的方法

文檔序號：485296閱讀：392來源：國知局

診斷傳染病病原體及其藥物敏感性的方法
【專利摘要】本說明書一般涉及檢測、診斷和/或鑒定病原體例如傳染病病原體以及確定其藥物敏感性和適當的治療方法的方法。本發明亦一般涉及在單個受試者以及更大的受試者群體中監測病原體感染的方法。
【專利說明】診斷傳染病病原體及其藥物敏感性的方法
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請是2011年2月24日提交的題為"診斷傳染病病原體及其藥物敏感性的方法"的國際申請號為PCT/US2011/026092發明專利申請的分案申請，原申請進入中國國家階段獲得的國家申請號為2011800206935。
[0003] 本申請要求保護2010年2月24日提交的美國臨時專利申請號61/307, 669和2010 年4月12日提交的美國臨時專利申請號61/323, 252的權益，所述申請的全部內容通過引用以其整體結合到本文中。
[0004] 聯邦贊助的研究或開發
[0005] 本發明利用在國立衛生研究院授予的獎助金號3U54-A1057159-06S1和獎助金號 A108002下的政府支持進行。政府在本發明中具有一定權利。

【技術領域】
[0006] 本發明尤其涉及檢測、診斷和/或鑒定病原體例如傳染病病原體和確定其對已知或潛在治療的敏感性的方法。
[0007] 發明背景
[0008] 分子診斷學的發展在除傳染病之外的大多數醫學學科中徹底改革了護理，在傳染病中它們未能起到普遍的變革作用。對慢速培養法的依賴在抗生素抗性的當前危機中尤其無效，因為快速診斷刺激病原體及其抗藥譜的分子工具的開發將改變細菌感染、真菌感染、病毒感染和寄生蟲感染的管理，在試圖降低死亡率、控制衛生保健費用和改進對病原體中逐步上升的抗藥性的公共衛生控制方面，導向快速、知情的藥物治療。僅在美國醫院，每年有170萬人獲得醫院細菌感染且死亡99, 000人，這些感染的70 %因細菌對至少一種藥物的抗性所致，估計每年花費450億美元（Klevens等，2002. Public Health R印? 2007 ; 122 (2) :160-6 Elevens 等，Clin Infect Dis. 2008 ;47 (7) :927-30 ;Scott，The Direct Medical Costs of Healthcare-Associated Infection in U.S. Hospitals and the Benefits of Prevention.載于：Division of Healthcare Quality Promotion NCfP, Detection and Control of Infectious Diseases,編輯 Atlanta:CDC, 2009)。然而，所述問題不限于美國，目前微生物抗藥性在全球影響大多數普通細菌感染。抗甲氧西林金黃色葡萄球菌（S. aureus) (MRSA)、多藥耐藥性結核病（MDR-TB)和漸增的抗藥性革蘭氏陰性生物的全球傳播，促使制定聚焦于監督、預防和控制、研究及產品開發的行動計劃(US action plan to combat antimicrobial resistance. Infect Control Hosp Epidemiol. 2001 ;22 (3) :183-4)。然而，在任何這些前沿獲得了極微的進展。
[0009] 及時給予適當抗生素已反復地顯示使患有嚴重細菌感染的患者中的死亡率降到最低，不論是在帶有諸如屎腸球菌（E. faecium)、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌（K. pneumoniae)、鮑氏不動桿菌（A.baumanii)、銅綠假單胞菌（P. aeruginosa)和腸桿菌（Enterobacter)物種等醫院病原體的醫院環境內，或是在帶有諸如結核病（TB) 等病原體的資源貧乏環境中（Harbarth 等，Am J Med. 2003; 115 (7) :529-35 ;Harries 等，Lancet. 2001 ;357 (9267):1519-23 ;Lawn 等，Int J Tuberc Lung Dis. 1997; I (5) :485-6)。然而，由于涉及生物的培養和傳代培養的當前診斷方法可花費數天或更多天來正確地鑒定所述生物及其藥物敏感性模式二者，因此醫師依靠增加使用經驗的廣譜抗生素，增加對抗藥性的選擇壓力并增加相關的衛生保健費用。快速（例如少于1小時）檢測病原體及其抗藥譜的護理診斷要點為迫切需要的并且可引人注目地改變醫學實踐。針對設計基于DNA的檢驗或基于PCR的檢驗的一些努力已產生能夠以低檢出限快速鑒定病原體的工具。然而，這些工具的全球使用目前因費用和對實驗室基礎設施的要求而受限，以及因基于 PCR的方法在粗制樣品的環境下的固有不靈敏性而受限，所述粗制樣品不易遵循所需酶學。確定抗藥性的分子方法甚至更有限，可以非常有限的方式用于一些生物（例如MRSA、TB)，這基于相對于已知的賦予抗藥性的突變來確定感染細菌的基因型。然而此方法需要相當廣泛地鑒定用于檢驗的所有抗藥性賦予單核苷酸多態性（SNP)，以具有高靈敏性（Carroll 等，Mol Diagn Ther. 2008; 12(1): 15-24)。
[0010] 發明概述
[0011] 本發明至少在某種程度上基于診斷疾病、鑒定病原體和優化治療的新方法的發現，所述新方法基于在例如粗制的非純化樣品中檢測mRNA。本文所述方法提供對樣品例如臨床樣品中病原體的快速和準確鑒定，并且允許基于藥物敏感性測定選擇最佳治療。
[0012] 在一方面，本發明特征在于確定病原體（例如致病生物，如細菌、真菌、病毒或寄生蟲）的藥物敏感性的方法。所述方法包括提供包含病原體的樣品并且使所述樣品與一種或多種試驗化合物接觸例如少于4小時，以提供試樣。可在將mRNA自病原體釋放進入試樣的條件下處理所述試樣，并將所述試樣暴露給包含多個探針子集的多種核酸探針，其中各子集包含與靶mRNA特異性結合的一種或多種探針，與抗藥性生物相比，所述靶mRNA在對試驗化合物敏感的生物中差異表達，其中所述暴露在使探針和靶mRNA之間的結合可發生的時間內和條件下進行。所述方法包括確定探針與靶mRNA之間的結合水平，從而確定靶mRNA 水平；以及將存在試驗化合物時的靶mRNA水平與參考水平（例如不存在試驗化合物時的靶 mRNA水平）進行比較，其中在所述靶mRNA水平相對于靶mRNA參考水平的差異表明所述病原體對試驗化合物是敏感的還是抗性的。
[0013] 在一個實施方案中，病原體為已知的，例如經鑒定的病原體。在一些實施方案中，所述方法確定未知病原體（例如，仍待鑒定的病原體）的藥物敏感性。
[0014] 在一些實施方案中，使包含病原體的樣品例如同時地或在相同樣品中與兩種或更多種試驗化合物接觸，例如與已知或潛在的治療化合物接觸，所述化合物例如抗生素、抗真菌劑、抗病毒劑和抗寄生蟲藥。許多這些化合物為本領域已知的，例如異煙肼、利福平、批嗪酰胺、乙胺丁醇、鏈霉素、阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素、紫霉素、恩維霉素、環丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、乙硫異煙胺、丙硫異煙胺、環絲氨酸、對氨水楊酸、利福布丁、克拉霉素、利奈唑胺、氨硫脲、硫利達嗪、精氨酸、維生素D、R207910、氧氟沙星、新生霉素、四環素、 merepenem、慶大霉素、新霉素、奈替米星、鏈霉素、妥布霉素、巴龍霉素、格爾德霉素、除賽霉素、氯碳頭孢、厄他培南、多利培南、亞胺培南/西司他丁、美羅培南、頭孢羥氨芐、頭孢唑林、頭孢噻吩、頭孢氨芐、頭孢克洛、頭孢孟多、頭孢西丁、頭孢丙烯、頭孢呋辛、頭孢克肟、頭孢地尼、頭孢托侖、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢泊肟、頭孢他啶、頭孢布烯、頭孢唑肟、頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢吡普、替考拉寧、萬古霉素、阿奇霉素、地紅霉素、紅霉素、羅紅霉素、醋竹桃霉素、泰利霉素、大觀霉素、氨曲南、阿莫西林、氨芐西林、阿洛西林、羧芐西林、氯唑西林、雙氯西林、氟氯西林、美洛西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素、哌拉西林、替卡西林、桿菌肽、粘菌素、多粘菌素B、依諾沙星、加替沙星、洛美沙星、諾氟沙星、曲伐沙星、格帕沙星、司帕沙星、磺胺米隆、偶氮磺胺、磺胺醋酰、磺胺甲二唑、磺胺（sulfaniIimide)、柳氮磺吡啶、磺胺異*唑、甲氧芐啶、甲氧芐啶-磺胺甲嗯唑（復方新諾明）、地美環素、多西環素、米諾環素、土霉素、胂凡納明、氯霉素、氯林肯霉素、林可霉素、乙胺丁醇、磷霉素、梭鏈孢酸、呋喃唑酮、甲硝基羥乙唑、莫匹羅星、呋喃妥因、平板霉素、奎奴普丁 /達福普汀、利福平、甲砜霉素、磺甲硝咪唑、頭孢菌素、替考拉寧（teicoplatin)、力百汀、頭孢氨芐、利福霉素、利福昔明、頭孢羥唑、酮康唑、拉氧頭孢或頭孢甲肟。
[0015] 在一些實施方案中，使樣品與化合物接觸少于4小時，例如少于3小時、少于2小時、少于1小時、少于30分鐘、少于20分鐘、少于10分鐘、少于5分鐘、少于2分鐘、少于1 分鐘。
[0016] 在另一方面，本發明特征在于鑒定傳染病病原體（例如細菌、真菌、病毒或寄生蟲，如結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis))的方法，例如檢測樣品例如臨床樣品中病原體的存在情況的方法。所述方法包括：
[0017] 提供來自疑似被病原體感染的受試者的試樣；
[0018] 在釋放信使核糖核酸（mRNA)的條件下處理所述試樣；
[0019] 將所述試樣暴露給包含多個探針子集的多種核酸探針，其中各子集包含與靶mRNA 特異性結合的一種或多種探針，所述靶mRNA唯一地鑒定病原體，其中所述暴露在使探針和靶mRNA之間的結合可發生的時間內和條件下進行；和
[0020] 確定探針與靶mRNA之間的結合水平，從而確定靶mRNA水平。試樣相對于參考樣品在祀mRNA方面的增加表明試樣中病原體的身份（identity)。
[0021] 在一些實施方案中，所述方法在樣品中或自樣品中鑒定傳染病病原體，所述樣品為或包括痰、血、尿、糞便、關節液、腦脊液和子宮頸/陰道拭子。這類樣品可含有多種其它生物（例如一種或多種非致病細菌、真菌、病毒或寄生蟲）或病原體。在一些實施方案中，所述樣品為臨床樣品，例如來自正在經受或可能經受衛生保健提供者的醫學治療的患者或人的樣品。
[0022] 在本發明的一些實施方案中，所述一種或多種核酸探針選自表2。
[0023] 在一些實施方案中，所述mRNA在與探針接觸之前為粗制的（例如未純化的）和/ 或不包括擴增所述mRNA，例如以產生cDNA。
[0024] 在一些實施方案中，所述方法包括以酶法、化學法和/或機械法裂解細胞。
[0025] 在一些實施方案中，所述方法包括微流體裝置的使用。
[0026] 在一些實施方案中，所述方法用來監測病原體感染（例如發生率、患病率）以用于病原體爆發（例如在特定地區內病原體數量的突然上升）的公共衛生監測。
[0027] 本文所述方法在病原體在來自受試者的樣品中時有效，所述受試者包括人和動物，例如實驗動物，如小鼠、大鼠、兔或猴，或者馴養動物和農場動物，如貓、狗、山羊、綿羊、豬、母牛、馬和鳥類，如雞。
[0028] 在一些實施方案中，所述方法另外的特征在于基于如本文所述的測定結果，確定和/或選擇用于受試者的治療以及任選給予受試者所述治療。
[0029] 在另一個總的方面，本發明特征在于選擇用于受試者的治療的方法。所述方法包括：
[0030] 任選例如利用本文所述方法鑒定傳染病病原體（例如檢測樣品中具體病原體的存在情況和/或身份）；
[0031] 利用本文所述方法確定病原體的藥物敏感性；和
[0032] 選擇所述病原體對其敏感的藥物用于治療受試者。
[0033] 在又另一個方面，本發明提供在受試者中監測病原體感染的方法。所述方法包括：
[0034] 在第一時間獲得包含病原體的第一樣品；
[0035] 利用本文所述方法確定第一樣品中病原體的藥物敏感性；
[0036] 任選選擇所述病原體對其敏感的治療并給予受試者所選治療；
[0037] 在第二時間獲得包含病原體的第二樣品；
[0038] 利用本文所述方法確定第二樣品中病原體的藥物敏感性；和
[0039] 將第一樣品和第二樣品中病原體的藥物敏感性進行比較，從而在受試者中監測感染。
[0040] 在本文所述方法的一些實施方案中，所述受試者為免疫缺損的。
[0041] 在本文所述方法的一些實施方案中，所述方法包括選擇病原體對其敏感的治療并給予受試者所選治療，在病原體的藥物敏感性上的改變表明所述病原體對所述治療有抗性或變為對所述治療有抗性，例如所述方法包括確定病原體對待給予治療的藥物敏感性。
[0042] 在一些實施方案中，在病原體的藥物敏感性上的改變表明所述病原體對治療有抗性或變為對治療有抗性，所述方法進一步包括給予受試者不同的治療。
[0043] 在又另一方面，本發明特征在于在受試者群體中監測病原體感染的方法。所述方法包括：
[0044] 在第一時間獲得來自群體中受試者的第一多種樣品；
[0045] 利用本文所述方法確定第一多種樣品中病原體的藥物敏感性，以及任選利用本文所述方法鑒定第一多種樣品中的傳染病病原體；
[0046] 任選給予受試者治療；
[0047] 在第二時間獲得來自群體中受試者的第二多種樣品；
[0048] 利用本文所述方法確定第二多種樣品中病原體的藥物敏感性，以及任選利用本文所述方法鑒定第一多種樣品中的傳染病病原體；
[0049] 將第一多種樣品和第二多種樣品中病原體的藥物敏感性以及任選所述病原體的身份進行比較，從而在受試者群體中監測感染。
[0050] 在又另一方面，提供與固相支持體結合的多種多核苷酸。所述多種多核苷酸的每種多核苷酸選擇性地與來自表2的一個或多個基因雜交。在一些實施方案中，所述多種多核苷酸包括SEQ ID NO: 1-227及其任何組合。
[0051] "傳染病"也稱為可傳染的疾病或可傳播的疾病，包括因受試者感染、存在和生長致病生物劑而引起的臨床上明顯的疾病（即疾病的特征性醫學體征和/或癥狀）（Ryan和 Ray(編輯）（2004). Sherris Medical Microbiology(第 4版）.McGraw Hill)。醫師可通過例如診斷性試驗（例如血試驗法）、病歷回顧和臨床病史回顧來確證傳染病的診斷。在某些情況下，傳染病在其部分或全部病程中可為無癥狀的。傳染性病原體可包括病毒、細菌、真菌、原生動物、多細胞寄生蟲和朊病毒。本領域技術人員應認識到，病原體的傳播可通過不同途徑進行，無例外地包括物理接觸、污染的食物、體液、物體、空氣傳播性吸入，以及通過病媒生物進行。特別具傳染性的傳染病有時稱為接觸傳染性的并且可通過與病人或其分泌物接觸而傳播。
[0052] 本文所用術語"基因"是指染色體中編碼產物（RNA或其翻譯產物多肽）的DNA序列。基因包含編碼區并包括編碼區前后的區（分別稱為"前導"和"尾部"）。編碼區由多個編碼區段（"外顯子"）和各個編碼區段之間的間插序列（"內含子"）組成。
[0053] 本文所用術語"探針"是指與靶mRNA特異性結合的寡核苷酸。探針在與靶標雜交時可為單鏈的。
[0054] 除非另有定義，否則本文所用的所有技術和科學術語與本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的意義相同。本文描述了用于本發明的方法和材料；還可使用本領域已知的其它合適的方法和材料。所述材料、方法和實施例僅為說明性的且不意圖其成為限制。本文提及的所有出版物、專利申請、專利、序列、數據庫條目和其它參考文獻通過引用以其整體結合。如有沖突，以本說明書（包括定義）為準。
[0055] 本發明的其它特征和優點將從下列詳述和附圖以及從權利要求中顯而易見。
[0056] 附圖描述
[0057] 圖1A-1D為說明利用NanoString?(使用顏色編碼探針直接多路測定基因表達）技術定量樣品中的mRNA分子的示例性方法的流程圖。1A.向粗制樣品裂解物中加入對應于每個目的mRNA的兩種分子探針。捕獲探針由50bp寡聚物組成，所述寡聚物與給定mRNA 分子互補，所述探針與生物素綴合。報告探針由不同的50bp寡聚物組成，所述寡聚物與上述mRNA分子的不同部分互補，所述探針與熒光標記綴合。每個標記唯一地鑒別給定的mRNA 分子。捕獲探針和報告探針在裂解物內與其對應的mRNA分子雜交。1B.通過與每個聚合物上的柄（handle)雜交的珠粒純化來去除過量的報道分子，僅留下雜交的mRNA復合體。 1C.將mRNA復合體固定并對齊在表面上。通過生物素綴合的捕獲探針將mRNA復合體捕獲至鏈霉抗生物素（strepavidin)包被的表面。施加電場使復合體全部以相同的方向對齊在表面上。1D.將表面成像并對編碼進行計數。將mRNA復合體顯微成像并且可計數對齊的報告標記，從而提供mRNA分子的定量測定。（圖片獲自nanostring, com)。
[0058] 圖2A-2F為顯示抗藥性基因表達特征（signature)的診斷的一組圖片。2A.來自患者的樣品，例如痰。2B.誘導表達程序以區分藥物敏感株和抗藥株。將樣品分開并暴露給不同的藥物以誘導表達程序，所述表達程序取決于所述菌株是抗藥的還是藥物敏感的。 2C.條形碼探針與mRNA分子雜交。裂解細胞并向粗制樣品中加入探針。2D.捕獲mRNA復合體并使其對齊。2E.將復合體成像并計數。2F.特征分析。將測定的mRNA水平標準化并與無藥物對照以及藥物敏感性標準品和抗藥性標準品進行比較，以確定跨越所有藥物的抗藥譜。
[0059] 圖3為顯示大腸桿菌（E. coli)臨床隔離群的陽性鑒定的直方圖。使用針對6個大腸桿菌基因（ftsQ、murC、opgG、putP、secA和uup)設計的探針，將4個臨床隔離群陽性鑒定為大腸桿菌。每個值代表4-6次重復的平均值和標準差。
[0060] 圖4為顯示銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)臨床隔離群的陽性鑒定的直方圖。使用針對5個銅綠假單胞菌基因（pr〇A、SltBl、nadD、dacC和IipB)設計的探針，將2個臨床隔離群陽性鑒定為銅綠假單胞菌。
[0061] 圖5為顯示肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)臨床隔離群的陽性鑒定的直方圖。使用針對5個肺炎克雷伯氏菌基因（lrp、yCbK、clpS、ihfB、mraW)設計的探針，陽性鑒定出1個臨床隔離群。
[0062] 圖6為顯示金黃色葡萄球菌臨床隔離群的陽性鑒定的直方圖。使用針對3個金黃色葡萄球菌基因（pi~〇C、rp 〇B和fabD)設計的探針，陽性鑒定出4個臨床隔離群。
[0063] 圖7為一組顯示使用病原體特異性探針鑒定病原體的三個直方圖。
[0064] 圖8為一組顯不病原體鑒定靈敏性的三個直方圖。
[0065] 圖9A和9B為幾組顯示自模擬的臨床樣品中鑒定病原體的三個直方圖。
[0066] 圖10為一組顯示銅綠假單胞菌的2個臨床隔離群鑒定的兩個直方圖。
[0067] 圖11為顯示在大腸桿菌中鑒定氟喹諾酮抗性的直方圖。
[0068] 圖12為顯示在大腸桿菌中鑒定氨基糖苷抗性的直方圖。
[0069] 圖13為顯示在金黃色葡萄球菌中鑒定甲氧西林抗性的直方圖。
[0070] 圖14為顯示在腸球菌（Enterococcus)中鑒定萬古霉素抗性的直方圖。
[0071] 圖15為一組顯示藥物敏感性結核分枝桿菌（M. tuberculosis)中的藥物特異性基因誘導的四個直方圖。
[0072] 圖16為一組比較異煙肼敏感性TB菌株和抗異煙肼TB菌株的三個散點圖。每個點代表24種基因探針之一。軸報告如通過數字基因表達技術（NanoString?)所測定的轉錄物數量。左--無藥物處理的情況下異煙肼抗性株和異煙肼敏感株中表達的比較。中-- 經藥物處理與未經藥物處理的異煙肼敏感株中表達的比較。右--經藥物處理與未經藥物處理的異煙肼抗性株中表達的比較。
[0073] 圖17為一組利用NanoString?比較藥物敏感性和抗藥性結核分枝桿菌的轉錄反應的四個直方圖。（A)如本文所述用INH(0. g/ml)處理菌株A50(INH-R)。（B)用g/ ml鏈霉素處理SM-R克隆S10。
[0074] 圖18為顯示敏感性TB菌株與抗藥性TB菌株中的差異基因誘導的直方圖。將每個基因在經INH處理的INH敏感（野生型）細胞/未處理細胞中的表達比率除以每個基因在經INH處理的抗INH細胞/未處理細胞中的表達。
[0075] 圖19為顯示結核分枝桿菌中INH誘導基因的誘導時程的線圖。將異煙肼敏感性 H37Rv暴露給0. g/mlINH(5XMIC)，在1、2和5小時自IOml培養物中制備RNA。然后使用qRT-PCR定量針對kasA、kasB和SigA的轉錄物的豐度，將水平對SigA標準化并與t = 0比較。
[0076] 圖20為用于檢測表達特征的示例性工作流程。由于桿菌在痰中的實際生理狀態為未知的，因此在過程開發中模擬復制和非復制細菌二者。以純性培養（在富含7H9/0ADC/ SDS的培養基中培養或在7H9/四丁酚醛中饑餓培養）生長的H37Rv代表這些試驗中在痰中的桿菌。在暴露給豐富培養基的情況下使桿菌脈沖若干時間h以刺激自休眠狀態的復蘇并激活轉錄。最佳^以實驗確定。然后在暴露給藥物的情況下使桿菌脈沖若干時間1 2以引起轉錄反應。最佳t2以實驗確定。最后，將全部樣品加工并通過表達概況分析進行分析以及通過定量RT-PCR確證。
[0077] 圖21為比較基因的表達比率以區分藥物敏感性桿菌和抗藥性桿菌的示例性方法。利用定量RT-PCR，對于候選包含在表達特征中的基因測定mRNA水平。在存在藥物時 (誘導的-藥物）和不存在藥物時（未誘導的-無藥物），在稱為"實驗的（exp)"的樣品 (即臨床隔離群）中測定關注基因的mRNA水平。亦在存在（持家-藥物）和不存在（持家-無藥物）藥物時測定標準持家基因的mRNA水平。關注基因和持家基因的水平比率允許對存在藥物（A)和不存在藥物（B)時的表達進行標準化。預期的是，對于一些藥物敏感株，A>B ;而對于抗藥株，A = B。最后，對于已知其為藥物敏感的和抗藥的對照菌株（C和D) 產生相同的對應比率。這些對照值充當用于比較獲自未知菌株的實驗比率的標準。
[0078] 圖22為一組顯示直接自培養物或患者標本中陽性鑒定細菌種類的直方圖和散點圖。使用針對檢測種特異性轉錄物設計的NanoString?探針分析細菌樣品。Y軸：轉錄物原始計數；X軸：基因名稱。對大腸桿菌（黑色）、肺炎克雷伯氏菌（白色）、銅綠假單胞菌（灰色）特異的探針。誤差棒反映兩個生物學重復的標準差。（A)來自革蘭氏陰性菌培養物的檢測。（B)混合培養物（斯氏普羅威登斯菌（Providencia stuartii)、奇異變形菌（Proteus mirabilis)、粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens)、產氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes)、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae)、摩氏摩根氏菌（Morganella morganii)、產酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca)、弗氏朽1檬酸桿菌 (Citrobacter freundii))內的檢測。（C)培養物中分枝桿菌的屬特異性和種特異性檢測。結核分枝桿菌（Mtb)、鳥分枝桿菌胞內亞種（M. avium subsp.intracellulare(MAI))、副結核分枝桿菌（M.paratuberculosis (Mpara))和海分枝桿菌（M.marinum(Mmar))。屬廣泛性探針（灰色），結核分枝桿菌特異性探針（黑色）。（D)對直接來自臨床尿標本的大腸桿菌的檢測。（E)大腸桿菌樣品與非大腸桿菌樣品相比身份的統計學測定。對每個探針的計數取平均值、對數轉換并求和。（F)mecA mRNA(其在葡萄球菌（Staphylococci)中賦予對甲氧西林的抗藥性）和vanA mRNA(其在腸球菌中賦予對萬古霉素的抗藥性）的檢測。每個點代表不同的臨床隔離群。
[0079] 圖23為一組顯示在抗生素暴露時區分敏感菌和抗藥菌的RNA表達特征的七個直方圖。使敏感菌株或抗藥菌株生長至對數期，短暫暴露給抗生素、裂解，并使用針對定量轉錄物設計的NanoString?探針集分析，所述轉錄物因響應抗生素暴露而變化。將原始計數對樣品的所有探針的平均值標準化，并通過將經藥物暴露的樣品與未經藥物暴露的樣品比較來確定倍數誘導。Y軸：倍數變化；X軸：基因名稱。在暴露給（A)大腸桿菌：環丙沙星 (CIP)、氨芐西林（AMP)或慶大霉素（GM)，（B)銅綠假單胞菌：環丙沙星，和（C)結核分枝桿菌：異煙肼（INH)、鏈霉素（SM)或環丙沙星（CIP)時敏感株（黑色；上圖）或抗藥株（灰色；下圖）的特征。每個菌株以一式兩份進行試驗；誤差棒代表一個典型菌株的兩個生物學重復的標準差。關于試驗菌株的完整列表參見表6。
[0080] 圖24為一組顯示使用表達特征的誘導水平的均方距離的抗生素抗性菌株和敏感菌株的統計學分離的三個散點圖。將均方距離（MSD)表示為Z分數，其顯示每個試驗菌株自暴露給抗生素的敏感株的平均信號的偏差。敏感株：空心菱形；抗藥株：實心菱形。虛線：Z = 3. 09 (p = 0. 001) (A)大腸桿菌臨床隔離群。每個點代表一個菌株的2-4個生物學重復。（B和C)響應抗生素暴露的表達特征不依賴抗藥機制。（B)大腸桿菌。將親株J53 及衍生物暴露給環丙沙星然后如上分析，所述衍生物包含賦予染色體氟喹諾酮抗性的gyrA 中的突變或者質粒介導的喹諾酮抗性決定簇（aac(6'）-Ib、qnrB或oqxAB)。誤差棒代表四個生物學重復的標準差。（C)結核分枝桿菌。將異煙肼敏感株和高水平抗性株或低水平抗性株暴露給異煙肼。在I U g/mL，低水平抗INH inhA顯示敏感性特征，但在0. 2 ii g/mL，其顯示抗藥性特征。
[0081] 圖25為一組描述病毒和寄生蟲檢測的五個直方圖。依照標準NanoString?方案將細胞裂解、合并、加入探針集并使樣品雜交。（A)自純性培養物中檢測的白假絲酵母 (Candida albicans)。（B) HIV-I。使用針對HIV-Igag和rev設計的探針自PBMC裂解物中進行檢測。（C)A型流感。使用針對基質蛋白1和2設計的探針在293T細胞裂解物中檢測 PR8流感病毒。（D)HSV-I和HSV-2。使用針對HSV-2糖蛋白G設計的探針在Hela細胞裂解物中檢測HSV-2菌株186Syn+。甚至在高MOI時也幾乎沒有HSV-2特異性探針與HSV-I的交叉雜交。（E)惡性痕原蟲（Plasmodium falciparum)。自在指定的寄生蟲血癥水平下采集的紅細胞中檢測惡性瘧原蟲（P. falciparum)菌株3D7。針對惡性瘧原蟲的指定血階段設計探針。
[0082] 圖26為一組顯示臨床隔離群的生物鑒定的三個散點圖。將細菌培養物裂解并通過標準NanoString?方案將針對檢測種特異性轉錄物設計的探針加入、雜交并檢測。將合并的探針集用于A和B，所述探針集包含鑒定大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌或銅綠假單胞菌的探針。在C中，用于結核分枝桿菌的種特異性探針在針對微生物病原體的更大探針集中。左Y軸顯示來自每個生物的1-5個獨立轉錄物的對數轉換計數的總和，X軸顯示試驗物種。虛線描述了 P值為〇. 001，其基于給定樣品的分數遠離對照（"無生物"）樣品的平均值的標準差數量。"無生物"樣品是指包含其他細菌生物但已知其中不存在限定生物的試樣。對于（C)，無生物樣品不含結核分枝桿菌，包括胞內分枝桿菌（M. intracellulare)、副結核分枝桿菌、膿腫分枝桿菌（M. abscessus)、海分枝桿菌、戈登分枝桿菌（M. gordonae)和偶發分枝桿菌（M. fortuitum)。試驗的菌株和臨床隔離群的數量在表4中顯示，用于病原體鑒定的基因（對其設計50nt探針）列于表5中。
[0083] 圖27描述慶大霉素（左圖）或氨芐西林（左（left)圖）敏感性和抗性大腸桿菌菌株的均方距離（MSD)比較。Y軸顯示每個樣品的MSD相對于已知敏感株的響應形心的Z 分數。虛線表示Z = 3. 09,其對應于p值0.001。
[0084] 圖28為顯示環丙沙星敏感性和抗性銅綠假單胞菌菌株的均方距離比較的散點圖。Y軸顯示每個樣品的MSD相對于已知敏感株的響應形心的Z分數。
[0085] 圖29為一組顯示鏈霉素（SM)或環丙沙星（CIP)敏感性和抗性結核分枝桿菌菌株的均方距離比較的兩個散點圖。Y軸顯示每個樣品的MSD相對于已知敏感株的響應形心的 Z分數。
[0086] 圖30為顯示金黃色葡萄球菌隔離群的陽性鑒定的直方圖。使用針對5個金黃色葡萄球菌基因（ileS、ppnK、pyrB、rocD和uvrC)設計的探針，陽性鑒定出3個金黃色葡萄球菌隔離群。
[0087] 圖31為顯示嗜麥芽糖寡養單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia)隔離群的陽性鑒定的直方圖。使用針對6個嗜麥芽糖寡養單胞菌（S.maltophilia)基因（clpP、dnaK、 purC、purF、sdhA和secD)設計的探針，將3個隔離群陽性鑒定為嗜麥芽糖寡養單胞菌。
[0088] 發明詳述
[0089] 本文描述了基于轉錄表達譜特征，鑒定病原體（例如細菌、真菌、病毒和寄生蟲）及其抗藥性模式二者的快速、高靈敏性、基于表型的方法。敏感性和抗藥性病原體對藥物暴露的反應非常不同，最早最迅速的反應之一反映在其各自表達譜上的改變。帶有分子條形碼的數字基因表達可用來檢測對藥物暴露的這些早期轉錄反應，以不需要酶學或分子生物學的快速方式來區分藥物敏感性和抗藥性病原體。本發明適用于多種臨床樣品中廣泛范圍的微生物病原體并且可與當前診斷工具聯用或獨立使用。所述方法將主要描述用于結核病 ("TB" ；結核分枝桿菌），但技術從業人員要理解的是，它們可適用于其他病原體及其伴隨的臨床綜合征（例如，如表1所列舉的）。
[0090] 關于TB的抗藥性診斷和鑒定特別具挑戰性，這是因為即使使用更快速的"顯微鏡觀察藥物敏感性"（MODS)培養法、噬菌體遞送報道分子或比色指示劑，培養試驗所需的TB 仍極其緩慢地生長。確定抗藥性的備選方法基于相對于已知抗藥性賦予突變來確定傳染病原體的基因型，然而此方法需要相當廣泛地鑒定所有抗藥性賦予單核苷酸多態性（SNP)，以使試驗具有1?靈敏性。
[0091] 可基于病原體的表達譜特征，將本文所述方法用于例如鑒定樣品例如臨床樣品中的病原體以及確定病原體的藥物敏感性。可用于區分藥物敏感性和抗藥性病原體的最早最快的反應之一為在暴露給關注藥物時它們各自的轉錄譜。病原體對于藥物暴露的反應非常不同，這取決于它們對所述具體藥物為敏感的還是抗性的。例如，在某些情況下，藥物敏感菌或抗藥菌將在數分鐘至數小時內通過增量調節和減量調節基因來響應藥物暴露，或許試圖克服所述藥物以及跟隨的更多非特異性應力，而抗藥菌沒有這類反應。此快速反應與化合物殺死病原體或抑制病原體生長所需的較長時間不同。以有效的方式自臨床樣品中檢測病原體的死亡或生長抑制代表甚至更大的挑戰。可使用例如帶有分子條形碼的數字基因表達來檢測對藥物暴露的這些早期轉錄反應，以不需要酶學或分子生物學的快速方式來區分藥物敏感性和抗藥性病原體，并因此所述數字基因表達可直接在收集自患者的粗制臨床樣品上進行。此讀出為表型的并因此不需要廣泛地確定解釋例如TB抗藥性的SNP。本文描述了一組基因，其將給病原體例如TB桿菌以及區分敏感性和抗藥性病原體提供高特異性。基于構成區分敏感性和抗藥性病原體的表達特征的基因的選擇，通過選擇大量誘導并因此不會僅僅受臨床樣品內病原體數量的限制的轉錄物，來優化檢出限的靈敏性。確定該組基因的大小以使所需基因的數量減到最少。因此，可將本發明用作診斷帶有其伴隨抗藥性模式的病原體的高度靈敏的表型試驗，其為快速的（例如幾個小時）、靈敏的和特異性的。此試驗可改變病原體感染患者的護理，并且是用于例如全球TB流行區的成本效益的護理點診斷。
[0092] 本發明方法允許以高度的靈敏性和特異性直接自粗制細胞樣品中檢測核酸特征、特別是RNA水平。此技術可用于通過測定不同的表達特征以高度的靈敏性且快速的簡單加工直接從臨床樣品（例如痰、尿、血或糞便）鑒定TB并確定藥物敏感性模式；所述技術亦適用于諸如淋巴結等其他組織。高靈敏性可通過檢測mRNA而非DNA(因為單個細胞可攜帶比單基因組DNA拷貝（其通常需要擴增以用于檢測）更多的mRNA拷貝/細胞（>10 3))和通過所述技術的固有高靈敏性（檢測〈2000拷貝mRNA)來獲得。所述快速簡單樣品加工為可能的，這是因為缺少檢測mRNA分子所需的酶學和分子生物學；反而在一些實施方案中，所述方法利用條形碼探針與粗制裂解物中的mRNA分子的雜交，接著直接顯現（例如，如圖 1所述）。由于在這些實施方案中使用雜交，可直接檢測mRNA，而無需自粗制細胞裂解物、固定的組織樣品以及含有異硫氰酸胍、聚丙烯酰胺和THz〇r'的樣品的任何純化步驟。粗制mRNA樣品可獲自生物流體或固體，例如痰、血、尿、糞便、關節液、腦脊液、子宮頸/陰道拭子、膽汁液、胸膜液、腹膜液或心包液；或者亦可使用例如來自骨活檢、肝活檢、肺活檢、腦活檢、淋巴結活檢、食管活檢、結腸活檢、胃活檢、小腸活檢、心肌活檢、皮膚活檢和竇活檢的組織活檢樣品。
[0093] RNA 提取
[0094] 通過用酶法、化學法或機械法處理樣品以裂解樣品中的細胞并釋放mRNA，可自樣品中的細胞例如病原體細胞或臨床樣品中提取RNA。技術從業人員要理解的是，可在所述過程中使用其他破碎方法。
[0095] 酶法去除細胞壁的使用已在本領域良好地建立。所述酶通常可市購以及在大多數情況下最初分離自生物來源。常用的酶包括溶菌酶、溶葡萄球菌素、消解酶、變溶菌素、聚糖酶、蛋白酶和甘露糖。
[0096] 化學品例如去污劑通過干擾脂質-脂質、脂質-蛋白質和蛋白質-蛋白質相互作用來破壞環繞細胞的脂質屏障。用于細胞裂解的理想去污劑取決于細胞類型和來源。細菌和酵母因其細胞壁的性質所致對最佳裂解有不同的需求。一般而言，非離子型去污劑和兩性離子去污劑更溫和。TritonX系列非離子型去污劑和兩性離子去污劑3-[(3-膽酰胺基丙基）二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽（CHAPS)常用于這些目的。相比之下，離子型去污劑為強增溶劑并且趨于使蛋白質變性，從而破壞蛋白質活性和功能。在本領域廣泛使用SDS(與蛋白質結合并使其變性的離子型去污劑）來破碎細胞。
[0097] 細胞的物理破碎可能需要超聲處理、弗式壓碎器、電穿孔，或者可使用包含裝配結構的微流體裝置來機械破碎細胞。這些方法為本領域已知的。
[0098] 帶有分子條形碼的數字基因表達
[0099] 在圖1中顯示了基于其基因表達譜來鑒定病原體的示例性過程的流程圖。通過 BLAST軟件將來自關注病原體的編碼序列與其他生物中的全部基因序列進行比對，來選擇鑒定各關注病原體的寡核苷酸探針。僅選擇與關注病原體完全匹配但與任何其他生物 < 50%匹配的約50個核苷酸（例如80個核苷酸、70個核苷酸、60個核苷酸、40個核苷酸、 30個核苷酸和20個核苷酸）的探針。選擇對應于每個關注mRNA且在彼此的100個堿基對之內的兩種探針。
[0100] 向含有HiRNA分子的粗制樣品裂解物中加入兩種分子探針。捕獲探針包含與給定的mRNA分子互補的50個核苷酸并且可與生物素綴合。報告探針包含與相同mRNA分子的不同部分互補的不同的50個核苷酸并且可與報道分子（例如熒光標記或量子點）綴合。每個報道分子唯一地鑒別給定的mRNA分子。所述捕獲探針和報告探針在裂解物內與其對應的mRNA分子雜交。通過與每個聚合物上的柄雜交的珠粒純化來去除過量報道分子，僅留下雜交的mRNA復合體。可將mRNA復合體捕獲并固定在表面例如鏈霉抗生物素包被的表面上。可施加電場使復合體全部以相同的方向對齊在表面上，然后將所述表面顯微成像。 [0101] 可計數報道分子以提供mRNA分子的定量測定。可在所述過程中使用可市購的 nCounter?Analysis System (NanoString, Seattle, WA)。然而，技術從業人員要理解的是，在所述過程中亦可使用其他系統。例如，可使用量子點而不用條形碼來標記探針；參見例如 Sapsford 等，"Biosensing with luminescent semiconductor quantum dots. "Sensors6(8):925-953(2006) ;Stavis 等，"Single molecule studies of quantum dot conjugates in a submicrometer fluidic channel.，'Lab on a Chip5(3):337-343(2005);和 Liang等，"An oligonucleotide microarray for microRNA expression analysis based on labeling RNA with quantum dot and nanogold probe. "Nucleic Acids Research33 (2):el7(2005)。
[0102] 在一些實施方案中，可在本方法中使用微流體（例如"芯片實驗室"）裝置來檢測和定量樣品中的mRNA。這類裝置已成功用于微流體流式細胞術、連續的基于尺寸的分離和色譜分離。具體而言，這類裝置可用于檢測如本文所述粗制樣品中的特定靶mRNA。可使用多種方法來檢測在特定mRNA水平上的變化。因此，可在用于本文所述方法的診斷和預后裝置中使用這類微流體芯片技術。例如，參見例如Stavis等，Lab on a Chip5 (3):337-343 (2005) ;Hong 等，Nat.Biotechnol.22 (4):435-439 (2004); Wang 等，Biosensors and Bioelectronics22(5):582-588(2006) ;Carlo 等，Lab on a Chip3 (4):287-291 (2003) ;Lion 等，Electrophoresis24213533-3562(2003) ;Fortier 等，Anal. Chem.，77(6) :1631-1640(2005);美國專利公布號 2009/0082552 ;和美國專利號 7, 611，834。本申請還包括包含結合部分的微流體裝置，所述結合部分例如與本文所述病原體特異性結合的抗體或其抗原結合片段。
[0103] 這些微流體裝置可并入標記的量子點和其他報道分子的激光激發。這些裝置亦可通過多種檢測機制（包括可見光）和多種數字成像傳感器方法（包括基于照相機的電荷耦合裝置），并入所得發射的檢測。這些裝置還可并入圖像處理及分析能力以將所得原始信號和數據翻譯成診斷信息的。
[0104] 利用表達特征快速表型診斷病原體身份和病原體抗藥性
[0105] 此技術可用于獲得病原體身份或抗藥性的快速測定。
[0106] 可基于獨特基因的檢測在樣品中鑒定病原體。因此，例如可自具有以下癥狀的受試者中獲得痰樣，所述癥狀與諸如肺炎或支氣管炎等呼吸系統疾病相關，并進行測定以確定存在何種疾病以及何種病原體為所述疾病的原因（參見例如表1)。可獲得尿樣以診斷膀胱炎、腎盂腎炎或前列腺炎（參見例如表1)。技術從業人員要理解的是，可根據患者表現出癥狀的性質及其鑒別診斷來獲得和分析具體形式的樣品。用于鑒定各種生物的特定基因可通過本文所述方法鑒定；表2包含了用于鑒定某些病原體的示例性基因。
[0107] 用于大大加速抗藥性試驗的原理基于檢測在暴露給特定關注藥物時，在病原體的藥物敏感株和抗藥株之間存在的轉錄反應上的差別。這些轉錄譜是可測定的對藥物暴露的最早表型反應，并且可在藥物暴露時，早在桿菌死亡之前將其測定。此基于轉錄的方法亦相對于基于基因型的方法具有明顯的優勢，這是因為其測定病原體對藥物暴露的直接反應而非測定替代物SNP。
[0108] 在一些實施方案中，可如圖2所述進行所述試驗。將樣品（例如來自患有TB患者的痰樣）分成數個較小的子樣品。將不同的子樣品不暴露給藥物或暴露給不同的已知或潛在藥物（例如，在TB樣品的情況下為異煙肼、利福平、乙胺丁醇、莫西沙星、鏈霉素）達限定的時間（例如少于4小時、少于3小時、少于2小時、少于1小時、少于30分鐘、少于20分鐘、少于10分鐘、少于5分鐘、少于2分鐘、少于1分鐘），期間在藥物敏感株中誘導使其與抗藥株區分的表達譜。然后將子樣品中的TB桿菌裂解、加入條形碼分子探針用于雜交以及在固定和成像之后分析所述子樣品。然后基于TB的藥物敏感株和抗藥株的表達反應，分析轉錄數據集以確定對一組藥物的抗藥性。因此，可確定唯一鑒別TB的表達特征及其對單個抗生素的反應，建立用于數字基因表達應用的探針集以及優化樣品處理和收集方法。
[0109] 在確定表達特征和優化轉錄信號上應考慮的兩個問題為：1.痰中桿菌當前未確定的代謝狀態，因為細胞可能處于復制或非復制狀態，和2.收集痰中的TB桿菌已預暴露給抗生素的可能性（即所述患者已用抗生素經驗地治療）。
[0110] 在一些實施方案中，鑒定病原體的方法和確定藥物敏感性的方法同時進行，例如用相同的微陣列裝置或微流體裝置在相同的樣品上進行，或者先后進行，例如一旦確定了病原體的身份，便選擇和進行用于藥物敏感性的適當測定。
[0111] 在隨附提交的表2中提供了可用于本文所述方法的示例性基因和探針集。
[0112] 治療方法
[0113] 本文所述方法包括但不限于用于治療病癥（例如表1所列病癥）的方法。通常，所述方法包括使用本文所述方法鑒定來自受試者的樣品中的病原體或者鑒定受試者中的病原體對其敏感的一種或多種藥物，以及給予需要這類治療或已確定需要這類治療的受試者治療上有效量的治療化合物，所述治療化合物中和病原體。在本文中所用的"治療"意指改善病癥的至少一個癥狀，所述病癥與表1所列病癥之一有關。例如，所述方法包括治療TB， TB常常導致咳嗽、胸痛、發燒、疲勞、無意識的體重減輕、食欲缺乏、寒冷和盜汗，因此治療可導致這些癥狀的減輕。其他疾病的臨床癥狀為本領域眾所周知的。
[0114] "有效量"為足以產生有益結果或所需結果的量。例如，治療量為達到所需療效的量。所述量可與預防上有效量相同或不同，所述預防上有效量為預防疾病或疾病癥狀的發作所需的量。可以一次或多次給予、施用或給藥來給予有效量。組合物的治療上有效量取決于所選的組合物。可從一次或多次/天至一次或多次/周（包括每隔一天一次）給予所述組合物。亦可從一次或多次/月至一次或多次/年給予所述組合物。技術人員將理解的是，某些因素可能影響有效治療受試者所需的劑量和時間安排，所述因素包括但不限于疾病或病癥的嚴重性、先前治療、受試者的一般健康和/或年齡以及存在的其他疾病。此外，使用治療上有效量的本文所述組合物治療受試者可包括單一治療或一系列治療。
[0115] 診斷方法
[0116] 本文包括用于鑒定病原體和/或確定其藥物敏感性的方法。所述方法包括自受試者獲取樣品并評價樣品中病原體的存在情況和/或藥物敏感性，以及將所述存在情況和 /或藥物敏感性與一個或多個參照（例如在未受影響的受試者中的水平或野生型病原體）進行比較。可利用本文所述和本領域已知的方法（例如利用定量免疫測定法）評價mRNA 的存在情況和/或水平。在一些實施方案中，可利用高通量法例如本領域已知的基因芯片（參見例如第 12 章，Genomics, Griffiths 等，編輯 Modern Genetic Analysis, 1999, W. H.Freeman and Company ；Ekins 和 Chu,Trends in Biotechnology, 1999, 17:217-218 ； MacBeath 和 Schreiber, Science2000, 289(5485):1760-1763 ;Simpson, Proteins and Proteomics:A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press ；2002 ； Hardi man, Microarrays Methods and App I i cat ions: Nut s&Bo Its, DNA Press, 2003)，來檢測mRNA的存在情況和/或水平。
[0117] 在一些實施方案中，樣品包括生物流體或固體，例如痰、血、尿、糞便、關節液、腦脊液、子宮頸/陰道拭子、膽汁液、胸膜液、腹膜液或心包液；或者例如來自骨活檢、肝活檢、肺活檢、腦活檢、淋巴結活檢、食管活檢、結腸活檢、胃活檢、小腸活檢、心肌活檢、皮膚活檢和竇活檢的組織活檢樣品。在一些實施方案中，一旦已確定某人具有病原體（例如表1所列病原體）或具有抗藥性病原體，即可給予例如本領域已知或如本文所述的治療。
[0118] 試劑盒
[0119] 包含探針的試劑盒亦在本發明的范圍內，所述探針與如本文所述的基因的區雜交并且可用來檢測本文所述的病原體。所述試劑盒可包含一種或多種其他組件，包括：使用說明書；以及其他試劑，例如標記或用于使標記與探針連接的試劑。使用說明書可包括關于用于在本文所述方法中預測對治療的反應的探針的診斷應用的說明。其他說明可包括對于將標記與探針連接的說明、對于用所述探針進行分析的說明和/或對于從受試者獲取待分析樣品的說明。如上所論述，所述試劑盒可包含標記，例如熒光團、生物素、地高辛配基 (digoxygenin)和放射性同位素，例如32P和3H。在一些實施方案中，所述試劑盒包含與如文本所述的基因的區雜交的標記探針，例如如本文所述的標記探針。
[0120] 所述試劑盒亦可包含一種或多種附加的探針，所述探針與相同基因或同病原體相關的另一基因或其部分雜交。包含附加探針的試劑盒可進一步包含標記，例如用于探針的一種或多種相同或不同的標記。在其他實施方案中，提供給試劑盒的一種或多種附加探針可以是一種或多種標記的探針。當試劑盒進一步包含一種或多種附加的探針時，所述試劑盒可進一步提供用于使用所述附加探針的說明書。
[0121] 亦可提供用于自我測試的試劑盒。例如，這類測試試劑盒可包含裝置和說明書，受試者無需衛生保健提供者的幫助便可使用所述裝置和說明書來獲取例如痰、口頰細胞或血等樣品。例如，可利用口腔拭子或刷子或者使用漱口水獲取口頰細胞。
[0122] 本文提供的試劑盒亦可包含郵寄物（mailer)，例如郵費已付的信封或郵包，其可用于將樣品返回例如實驗室以進行分析。所述試劑盒可包含一個或多個用于樣品的容器，或者樣品可處于標準采血瓶中。所述試劑盒還可包含一份或多份知情同意書、測試申請單以及如何在本文所述方法中使用試劑盒的說明書。本文亦包含使用這類試劑盒的方法。可例如使用條形碼編碼一份或多份所述表格（例如測試申請單）和一個或多個裝樣品的容器，以辨別提供樣品的受試者。
[0123] 在一些實施方案中，所述試劑盒可包含用于處理樣品的一種或多種試劑。例如，試劑盒可包含用于自樣品中分離mRNA的試劑。所述試劑盒亦可任選包含用于可檢測地標記 mRNA或mRNA擴增子的一種或多種試劑，所述試劑可包括例如酶（例如DNA聚合酶的Klenow 片段、T4多核苷酸激酶）、一種或多種可檢測標記的dNTP或者可檢測標記的Y磷酸ATP (例如 33P-ATP)。
[0124] 在一些實施方案中，所述試劑盒可包含用于分析例如微陣列分析結果或表達譜結果的軟件包。
[0125] 在下列實施例中進一步描述本發明，所述實施例不限制在權利要求中描述的本發明的范圍。實施例
[0126] 實施例I :病原體鑒定
[0127] 大腸桿菌（Escherichia coli)、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)。鑒定出大腸桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌、金黃色葡萄球菌和糞腸球菌（Enterococcus faecalis)中的獨特編碼序列（表2)并將其用于陽性鑒定這些生物（圖3-6)。使臨床隔離群在LB培養基中于37°C生長至對數期。然后向100 微升異硫氰酸胍裂解緩沖液（RLT緩沖液，Qiagen)中加入5微升各培養物并渦旋5秒鐘。然后依照用于裂解物的制造商標準方案，將4微升各裂解物制品用于nC 〇UnterTMSyStem測定。用于鑒定的標準為對于全部5種（對于銅綠假單胞菌或肺炎克雷伯氏菌）或6種（對于大腸桿菌）生物鑒定探針的計數，其至少在背景平均值（對用于另兩種生物的所有生物鑒定探針計數的平均值）的兩倍以上。將計數對ProC的計數標準化，以在重復之間比較。利用表2所述生物鑒定探針，使用針對6個大腸桿菌基因（ftsQ、murC、opgG、putP、secA和 imp)設計的探針正確鑒定出4個大腸桿菌臨床隔離群（圖3)。如圖4所示，使用針對5個銅綠假單胞菌基因（proA、sltBl、nadD、dacC和IipB)設計的探針將2個臨床隔離群正確鑒定為銅綠假單胞菌。如圖5所示，針對5個肺炎克雷伯氏菌基因（lrp、ycbK、clpS、ihfB 和mraW)設計的探針陽性鑒定出一個肺炎克雷伯氏菌臨床隔離群。使用針對3個金黃色葡萄球菌基因（ pr〇C、rpoB和fabD)設計的探針，陽性鑒定出4個臨床隔離群（圖6)。用于鑒定的截止標準為對rpoB和fabD的計數至少在背景平均值（對用于大腸桿菌、銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯氏菌的所有生物鑒定探針計數的平均值）的兩倍以上。
[0128] 平均說來，較大的庫（pool)包含用于各種生物的4-5個序列以獲得所需的特異性水平。利用此技術，通過直接探查粗制裂解物，在純性培養物和在包含8種另外的革蘭氏陰性病原體的復雜混合物中檢測、鑒定和區分這三種生物的每一種（圖22A和22B)。
[0129] TB。針對Rvl641. 1和Rv3583c. 1的探針檢測結核分枝桿菌中的高豐度轉錄物（參考文獻8)以及將檢測鳥分枝桿菌（M. avium)和鳥分枝桿菌副結核亞種（M. avium subsp. paratuberculosis)中的直向同源轉錄物，因此可用于檢測任何這三個種。另外，針對3個TB基因（Rvl980c. 1、Rvl398c. 1和Rv2031c. 1)的探針可用來差異地鑒定結核分枝桿菌，即它們不會檢測鳥分枝桿菌或鳥分枝桿菌副結核亞種。針對MAP_2121c. 1、 MAV_3252. 1、MAV_3239. 1和MAV_1600. 1的探針可用于檢測鳥分枝桿菌或鳥分枝桿菌副結核亞種，但不會檢測結核分枝桿菌。因此，使用Rvl980c和Rv3853探針獲得最大靈敏性，而針對 Rvl980c. 1、Rvl398c. 1 和 Rv2031c. 1 以及 MAP_2121c. 1、MAV_3252. 1、MAV_3239. 1 和 MAV_1600. I的探針使得能夠區分結核分枝桿菌感染和鳥分枝桿菌或鳥分枝桿菌副結核亞種感染。
[0130] 針對既對遍及分枝桿菌屬保守又僅對結核分枝桿菌特異的基因設計探針。泛分枝桿菌探針識別多個種，而結核分枝桿菌探針為高度特異的（圖22C)。
[0131] 金黃色葡萄球菌和嗜麥芽糖寡養單胞菌
[0132] 利用表2所述生物鑒定探針，使用針對5個金黃色葡萄球菌基因（ileS、ppnK、 pyrB、r 〇cD和uvrC)設計的探針正確鑒定出3個金黃色葡萄球菌隔離群（圖30)。類似地，使用針對6個嗜麥芽糖寡養單胞菌基因（clpP、dnaK、purC、purF、sdhA和secD)設計的探針正確鑒定出3個嗜麥芽糖寡養單胞菌隔離群（表2 ;以及圖31)。
[0133] 實施例2 :方法的靈敏性
[0134] 如圖7-10所示，本方法對各種關注病原體為特異的并且在臨床樣品（例如血和尿）中靈敏地檢測少于100個細胞。
[0135] 用24基因探針集探查分離自三種病原體的每一種的RNA(Ing)(圖7)。大腸桿菌基因，左；肺炎克雷伯氏菌基因，中；銅綠假單胞菌基因，右。大腸桿菌RNA，上；肺炎克雷伯氏菌，中；銅綠假單胞菌，下。y軸顯示如通過利用數字基因表達技術所測定的對每個基因的計數數量。來自各個生物的RNA顯示不同的表達特征，其允許容易地鑒定各種病原體。
[0136] 將此24基因探針集用于探查來自10, 000個細胞、1000個細胞和100個細胞的粗制大腸桿菌裂解物（圖8)。可區分低至100個細胞的不同的大腸桿菌表達特征。
[0137] 在經摻加（spiked)的尿樣和血樣中模擬臨床樣品。在經摻加的尿樣中，用105 個大腸桿菌AiL尿摻加尿樣。使樣品在4°C冷藏過夜，然后將所述粗制細菌樣品裂解并使用用于革蘭氏陰性菌的24-基因探針集探查以鑒定大腸桿菌（圖9A上圖和9B)。將血以 lOOOcfu/ml摻加并且亦用24-基因探針集探查（圖9A下圖）。
[0138] 使用用于革蘭氏陰性菌的24-基因探針集探查銅綠假單胞菌的2個臨床隔離群 (獲自Brigham和Women臨床微生物學實驗室）以證實所述基因集能夠鑒定相同細菌屬的臨床多樣化菌株（圖10)。
[0139] 直接在尿樣中鑒定大腸桿菌。使大腸桿菌菌株K12在LB培養基中于37°C生長至對數培養晚期。然后向來自健康供體的尿液標本中加入細菌至1〇〇, OOOcfu/ml的終濃度 (如通過0D_所估計）。然后將尿樣置于室溫下達0小時、4小時、24小時或48小時或者置于4°C達24小時。將Iml經摻加的尿在13, OOOxg離心1分鐘。去除上清液；用100微升LB培養基重懸沉淀物。用Bacteria RNase Protect(Qiagen)處理細菌，然后在異硫氰酸胍（guianidinium isothiocyanate)裂解緩沖液（RLT緩沖液，Qiagen)中裂解細菌。依照制造商方案將裂解物用于nCounter?System測定。
[0140] 直接測定患者尿液標本的等分部分以檢測尿路感染中的大腸桿菌轉錄物（圖 22D)。為了將來自多種轉錄物的信號簡化成評價生物存在或不存在的單一度量，將來自每個探針的原始計數對數轉換并求和。當應用于一組17個臨床大腸桿菌隔離群時，各個隔離群容易地區別于一組13個無大腸桿菌樣品（相對于無大腸桿菌對照，Z分數>6. 5,圖22E)。
[0141] 實施例3 :病原體的藥物敏感性
[0142] 大腸桿菌中氟喹諾酮抗性和氨基糖苷抗性的鑒定。利用大腸桿菌在暴露給氟喹諾酮和氨基糖苷時已公布的表達陣列數據（Sangurdekar DP, Srienc F, Khodursky AB. A classification based framework for quantitative description of large-scale microarray data. Genome Biol2006 ;7 (4): R32),選擇預期其在暴露給氟喹諾酮和氨基糖苷時顯著減量調節或增量調節的基因集。使泛敏感性實驗室菌株（K12)、抗氟喹諾酮臨床隔離群1和2以及抗慶大霉素臨床隔離群（E2729181和EB894940)在LB培養基中于37°C生長至對數期。取出各培養物的2ml等分部分，并且向所述等分部分中加入抗生素至8 y g/ ml環丙沙星或128 ii g/ml慶大霉素的終濃度。將培養物在37°C孵育10分鐘。向100微升異硫氰酸胍裂解緩沖液中加入5微升各培養物并渦旋5秒鐘。依照制造商方案將裂解物用于nCounter?System測定。將計數對proC的計數標準化；proC似乎再次為實驗之間最具可比性的；通過比較在存在和不存在抗生素暴露時的計數來確定每個基因的倍數誘導。來自9個探針（〇8^、(16〇(]、；1^]^?、111：1^、代〇4、11￥^、：713111(、11即和€3&0)的明確信號顯示了在藥物敏感性K12菌株中誘導或阻遏，這將其與2個抗藥性臨床隔離群區分開（圖11)。第十個探針WbbK既不誘導也不阻遏，給具有變化表達的基因提供有用的比較。類似地，針對 8個基因的探針顯示這些基因在藥物敏感性K12菌株中阻遏（flgF、 CysD、glnA、〇pgG)或誘導（ftsQ、bl649、recA、dinD)，這將其與2個抗藥性臨床隔離群區分開（圖12)。
[0143] 葡萄球菌（Staphylococcus)中甲氧西林抗性的鑒定。使6個金黃色葡萄球菌臨床隔離群在LB培養基中于37°C生長至對數期。然后取出各培養物的2ml等分部分；加入氯唑西林至25 ii g/ml的終濃度。將培養物在37 °C孵育30分鐘。向100微升異硫氰酸胍裂解緩沖液中加入5微升各培養物并潤旋5秒鐘。依照制造商方案將裂解物用于nCounter?Sy stem 測定。利用兩個獨立的探針（表2)，在已知為抗甲氧西林的4個隔離群中鑒定mecA表達。相比之下，在已知為甲氧西林敏感性的2個隔離群中沒有可檢測的mecA表達，在不存在氯唑西林時有極微的mecA表達（圖13)。
[0144] 腸球菌中萬古霉素抗性的鑒定。使4個腸球菌臨床隔離群在LB培養基中于37°C生長至對數期。取出2ml等分部分；加入萬古霉素至128ii g/ml的終濃度。將培養物在37°C 孵育30分鐘。向100微升異硫氰酸胍裂解緩沖液中加入5微升各培養物并渦旋5秒鐘。依照制造商方案將裂解物用于nCounter?System測定。利用兩個獨立的探針（表2)，在已知為抗萬古霉素的2個隔離群中鑒定vanA表達。相比之下，在已知為萬古霉素敏感性的2個隔離群中沒有可檢測的vanA表達，在不存在萬古霉素時有極微的vanA表達（圖14)。在所述4個隔離群的任何中均無可檢測的vanB表達。
[0145] 除檢測轉錄物用于生物鑒定之外，檢測在可動遺傳因子上編碼的基因可提供關于特定隔離群的更多基因組詳情。例如，探查細菌隔離群的mecA mRNA(其在葡萄球菌中賦予對甲氧西林的抗藥性）和vanA mRNA(其在腸球菌中賦予對萬古霉素的抗藥性）。在兩種情況下，檢測允許快速鑒定MRSA和抗萬古霉素腸球菌（VRE)的相關轉錄物（圖22F)。因此， RNA的直接檢測能夠檢出已知的抗藥性元件。此外，此方法能夠通過其他遺傳因子（例如通過在食物傳播病原體中的水平基因交換獲得的毒力因子，即腸出血性大腸桿菌或產志賀毒素大腸桿菌中的志賀毒素（Shiga toxin))來辨別隔離群。
[0146] TB中抗藥性的鑒定。自公布的基因表達數據中鑒定24基因探針集以鑒定表達特征，所述表達特征將允許鑒定藥物敏感性TB在暴露給不同抗生素時的表達變化，所述抗生素包括異煙肼（isoniaid)、利福平、鏈霉素和氟喹諾酮（圖15-18)。藥物暴露后誘導或阻遏的量在表3中顯示。
[0147] 在存在四種不同的藥物（異煙肼，0. 4iig/ml ;鏈霉素，2iig/ml ;氧氟沙星，5iig/ ml ;利福平，0. g/ml)之一的情況下，使處于A_0. 3的對數期結核分枝桿菌在墨水池 (inkwell)瓶（IOml體積，平行培養）中生長。在開始藥物治療之后的指定時間（圖15)，通過離心（3000xg，5分鐘）收獲培養物，用Iml Trizol重懸并且以珠粒攪打（IOOnm玻璃珠，最大速度，兩次1分鐘脈沖）。向樣品中加入氯仿（〇.2ml)，接著以6000xg離心5分鐘，收集水相用于分析。
[0148] 以1:10稀釋樣品并依照制造商方案利用表2所述NanoString?探針集分析。首先通過對三個持家基因（sigA、rpoB和mpt64)的平均計數標準化來計算各轉錄物的相對豐度，然后將數據繪制為相對于來自未處理對照的樣品的倍數變化。框表示基于藥物特異性誘導的先前證據選擇的探針（Boshoff 等，J Biol Chem. 2004,279(38): 40174-84.)。
[0149] 抗藥性TB菌株相比于藥物敏感株在暴露給異煙肼時未顯示表達特征誘導，藥物敏感株在異煙肼暴露時清楚地顯示表達特征的誘導（圖16)。圖16顯示了比較異煙肼敏感性和抗性TB菌株的三個散點圖，每個點代表24個基因探針之一。軸報告如通過數字基因表達技術（NanoString?)測定的轉錄物數量。左--無藥物處理的情況下異煙肼抗性株和異煙肼敏感株中表達的比較。中--經藥物處理與未經藥物處理的異煙肼敏感株中表達的比較。右--經藥物處理與未經藥物處理的異煙肼抗性株中表達的比較。
[0150] 根據圖17所示藥物，在藥物敏感性結核分枝桿菌中誘導不同的基因集。藥物敏感性和抗藥性結核分枝桿菌的轉錄反應（A)如本文所述用INH(0.4iig/ml)處理菌株 A50 (INH-R)。（B)用2 ii g/ml鏈霉素處理SM-R克隆S10。可通過TB24基因探針集的數字基因表達來測定差異基因誘導，以顯示清楚的特征并允許藥物敏感性的鑒定（圖18)。
[0151] 將二個持豕基因mpt64、rpoB和sigA用于標準化。對于每個實驗樣品，將實驗基因的原始計數對這三個持家基因原始計數的平均值標準化，提供試驗基因相對于對照基因的豐度測定。將誘導或阻遏定義為經藥物暴露的樣品相對于未藥物暴露的樣品在這些標準化計數上的變化。利用此方法，發現下列基因在暴露給異煙肼、利福平、氟喹諾酮和鏈霉素之后，在藥物敏感性TB中受到誘導或阻遏。
[0152] 異煙肼：對于藥物依賴性誘導：kasA、fadD32、accD6、efpA和Rv3675. 1。
[0153] 利福平：對于藥物依賴性誘導：bioD、hisl、era和Rv2296。
[0154] 氟喹諾酮：對于藥物依賴性誘導：rpsR、alkA、recA、Itpl和Ihr ;對于藥物依賴性阻遏：kasA 和 accD6。
[0155] 鏈霉素：對于藥物依賴性誘導：CHP、bcpB、gcvB和groEL。
[0156] 實施例4 :利用帶有分子條形碼的數字基因表達鑒定藥物敏感性和抗藥性TB的基于表型表達特征的試驗
[0157] 本實施例描述了用于診斷痰中TB并快速確定抗藥譜的基于表型表達特征的試驗。所述方法基于在創建帶條形碼的成對分子探針的探針集的情況下對基因的檢測，所述基因的表達譜將唯一檢出TB并區分抗藥株和藥物敏感株。基因的選擇通過表達譜數據的生物信息學分析來確定，所述表達譜數據在不同生長條件下利用微陣列獲得，包括純性培養中的TB(復制和非復制狀態二者）、細胞培養的巨噬細胞中的TB以及摻加到痰中的TB。
[0158] A.確定用于TB鑒定的特征
[0159] 已鑒定一組分子探針，其與來自復制和非復制TB二者的mRNA特異性雜交。所述探針對下列mRNA為特異的，所述mRNA在所有生長條件下為高豐度的并且跨越所有TB菌株為保守的。盡管先前已確定獨特DNA序列以鑒定TB識別16SrRNA(Ampli C〇r，R〇Che)或 IS6110區（Gen-probe)，但這些確定的區不具有數字基因表達中的特征所需的最佳特征。 16SrRNA在分枝桿菌物種中沒有足夠分歧而不能利用50-堿基寡聚物基因探針區分不同的種，所述探針因其長度所致可容許低水平的遺傳變異性。基因組的IS6110區并非在所有生長條件下以足夠高的水平表達，而不允許其被用作鑒定TB的穩健信號。因此，描述了一種表達特征，其將允許自其他分枝桿菌物種中鑒定出TB。
[0160] i.對保守TB基因的生物信息學基因分析。已確定用于相對于其他分枝桿菌物種檢測TB的獨特表達特征。一般而言，用于包含在特征中的最佳基因將滿足下列標準：1.具有高表達水平（高mRNA拷貝數）以增加靈敏性，2.跨越所有TB菌株為高度保守的并且具有高度保守的序列，和3.相對于所有其他分枝桿菌物種對TB基因組為高度特異的。利用可得TB基因組中保守基因的生物信息學分析鑒定這類基因，所述TB基因組并非存在于所有其他測序的分枝桿菌屬（即海分枝桿菌、鳥-胞內分枝桿菌（M. avium-intracellulaire)、堪薩斯分枝桿菌（M.kansasii)、偶發分枝桿菌、膿腫分枝桿菌）中。可得到來自臨床分離株的超過40個TB基因組用于分析，所述基因組已在Broad Institute測序。
[0161] ii.候選基因mRNA水平的表達譜分析。選擇用于檢測痰中TB桿菌的分子探針的第二個標準為，它們與高豐度的穩定的mRNA雜交以使靈敏性最高。預期這類mRNA對應于基本的持家基因。利用對數據庫（在Broad Institute和Stanford University(tbdb. org)創建）中的現存公開可得表達數據的生物信息學分析和對TB菌株H37Rv的實驗表達譜的組合來選擇基因，所述實驗表達譜利用表達概況分析來確證候選基因在允許復制（對數生長）和不允許復制（通過碳饑餓、穩定期和低氧來誘導）的條件下的高水平表達。對 H37Rv的表達概況分析實驗使用已建立的TB碳饑餓模型（在7H9/四丁酚醛中饑餓培養5 周）、穩定期生長以及用于厭氧生長的Wayne模型（在密閉管中緩慢攪動培養物）進行。，將Solexa/Illumina測序用于通過將mRNA轉換成cDNA和將測序用于計數cDNA分子而確定表達譜。用于鑒定表達水平的此定量方法比微陣列數據更可能反映利用數字基因表達獲得的水平，并且其為已使用Broad Institute測序平臺建立的方法。有可能進行多路測定 12個樣品/測序泳道，假定75bp讀出和1千萬讀出/泳道。
[0162] iii.鑒定TB的表達特征的探針選擇。由于所述數字基因表達技術基于兩種50 個核苷酸探針與關注mRNA的雜交，因此自（Ai)和（Aii)鑒定基因中的兩個50個堿基對的區，所述區在基因組內為唯一的以使非特異性雜交減到最少，并且如測序的TB基因組所證實，其包含最少多態性。以生物信息學法選擇探針，以在5度解鏈溫度窗口內適合并具有最少mRNA二級結構。利用可得技術針對分離自復制和無復制TB (包括多個菌株，即H37Rv、 ⑶C1551、Fll、Erdman)、海分枝桿菌、胞內海分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌（M. kansaii)和偶發分枝桿菌的mRNA測試探針，以確證整個探針集的特異性。可針對這些其他的分枝桿菌物種選擇探針，其將同樣允許自痰中鑒定這些病原體。在感染的巨噬細胞模型中測試鑒定胞內桿菌的能力，以證實在宿主mRNA存在下檢測TB mRNA的能力。最后，通過向下滴定試樣中的TB桿菌的數量（和因此存在于細胞裂解物中的mRNA)來確定測定的靈敏性。利用數字基因表達的所有實驗使用針對相同基因集的定量RT-PCR來確證。所述集合的改進和精化將以迭代方式進行。
[0163] B.確定特征以區分敏感性和抗藥性TB
[0164] 已鑒定與mRNA雜交的一組分子探針，其允許獲得區分藥物敏感株和抗藥株的特征，所述mRNA在暴露給各單獨的TB藥物時被特異性誘導。已確定暴露給異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素和莫西沙星的特征。
[0165] 對于待包含在特征中的理想基因，除以上特性（即跨越TB菌株為保守的、對TB基因組為特異的）之外，在選擇用于抗藥性特征的基因上，還要優先考慮數個其他特性。由于抗藥性將通過藥物敏感株和抗藥株的轉錄物誘導之間的差異來確定，理想的候選基因應在暴露給給定藥物時在藥物敏感株中高度誘導。理想的是，早期和快速地誘導這些基因，因為這段時間將在很大程度上決定整個診斷試驗的速度。基于使用qRT-PCR的數據，在短達1-2 小時中觀察到對藥物暴露的轉錄反應（圖19)。考慮到mRNA分子的半壽期，利用基因誘導而非利用基因阻遏提供更快且更可檢測的反應。
[0166] 對于涉及異煙肼和鏈霉素的所有描述的實驗，將TB菌株H37Rv用于BSL3環境，其中已產生一組單獨抗藥株以用于與野生型完全藥物敏感性H37Rv對比。為了確保利福平在實驗室獲得性感染的不可能事件中仍然是治療選項，將在TB的營養缺陷型菌株（lysA、 panC)中產生抗利福平突變型，所述TB的營養缺陷型菌株需要加入賴氨酸和泛酸鹽用于生長。
[0167] 最后，鑒定了對每種抗生素唯一的特征而非對任何或所有抗生素的普遍應激反應。此特異性的基本原理為，在臨床環境中，許多患者已用不同的抗生素經驗地治療，并因此可能已在痰樣內的桿菌中激活一些普遍的應激反應。然而，保留藥物特異性反應用于測試和分析。
[0168] i.響應抗生素暴露的表達概況分析。進行了表達概況分析以鑒定候選基因，所述候選基因區分在H37Rv的藥物敏感株和抗藥株中的轉錄反應。由于桿菌在痰中的復制狀態或轉錄活性為未知的，因此對非復制（通過5周碳饑餓模型誘導）桿菌進行附加的實驗。其將確定非復制桿菌在豐富培養基（7H9/0ADC)中是否需要短時間U 1)的"生長刺激"以刺激一些基礎轉錄，所述基礎轉錄之后可響應藥物暴露（圖20)。亦確定了為了獲得區分藥物敏感株和抗藥株的穩健特征以及最佳藥物濃度對藥物暴露而言所需的最佳時間（t 2)，以獲得穩健的可重現的反應。對每個單獨的抗生物素進行這些實驗。
[0169] 如果痰中桿菌處于非復制的休眠狀態，則完全非復制狀態為"最壞情況"（即將需要最長時間）。實際上，基于檢查患者痰中桿菌的表達譜的已公布工作，如果真的需要的話，此時間將極其短，假定表達譜直接獲自痰桿菌。（注意，此公布數據亦將結合到分析中以提供對痰中細菌的可能候選基因的最初見識。）進行概況分析實驗矩陣，從〇、1和2小時改變暴露給富含7H9/0ADC培養基的時間U 1);對于每個&，改變暴露給各抗生素的時間（t2)。對于敏感性和抗藥性H37Rv菌株二者，對于每組^和t 2，對各抗生物素從最小抑菌濃度（MIC) 的lx、3x和5x改變抗生素濃度，以確定最佳參數。表達概況分析將用來鑒定用于產生穩健的可重現特征的最適條件。
[0170] 基于最適條件U1和t2)，在這些條件下對藥物敏感性和抗藥性H37Rv菌株進行表達譜分析。進行生物信息學分析以鑒定用于每種藥物的基因，其中藥物敏感株中的誘導水平比抗藥株高（除在利福平中之外，其中藥物敏感株中的阻遏水平比抗藥株高）。在藥物敏感株和抗藥株之間比較表達水平并通過定量RT-PCR確證表達水平。
[0171] ii.開發分析算法以鑒定抗藥性。確定了優化算法以分析基因集的表達比率，所述表達比率區分敏感株和抗藥株（如通過標準MIC測定所確定的）。本方法的優勢之一為，對于大多數情況（即未經預暴露給TB抗生素的那些情況），可在未經暴露給給定抗生素和暴露給給定抗生素的相同菌株的基因表達水平之間完成比較。將定量RT-PCR用于在下列條件下自H37Rv測定mRNA水平，所述條件包括1.未暴露給抗生素，2.暴露給異煙肼，3.暴露給利福平，4.暴露給乙胺丁醇，5.暴露給鏈霉素，和6.暴露給莫西沙星。將暴露給抗生素之后的給定基因的表達水平對來自一組穩態持家基因（即sigA，其編碼刺激持家基因轉錄的主要〇因子；和rpoB，其編碼RNA聚合酶的合成亞基）的表達水平標準化，并與經同樣標準化的無抗生素暴露情況下相同基因的表達水平進行比較。亦與標準的敏感性和抗藥性對照菌株進行比較（圖21)。理想的是，暴露給特定藥物將誘導藥物敏感株中的基因表達至高水平，A?B，而對于對藥物暴露不敏感的抗藥株，A = B。（對于利福平將有例外，其中鑒于利福平的機制，檢測具有最短半壽期的mRNA的基因阻遏，即A = C〈〈B = D。）由于轉錄水平的大動態范圍，選擇對其而言C/D比率為最大的基因，從而允許敏感株和抗藥株的明顯強烈的差異。此外，對于每個單獨的抗生素選擇最佳唯一的基因集，使得在誘導反應上與其他抗生素沒有重疊。
[0172] iii.預先抗生素暴露對TB桿菌特征的影響的分析。為了確定這些特征即使在患者已用抗生素預治療的情況下鑒定抗藥性模式的有效性，在施用此測試之前，將藥物敏感性和抗藥性TB桿菌（復制、非復制，巨噬細胞內）預暴露給阿莫西林、頭孢菌素、甲氧芐啶-磺胺甲?唑和紅霉素，其為在TB地方性環境中患者可能暴露給其的普通抗生素。亦進行TB桿菌對當前TB藥物的不同組合的預暴露，以確定這類預暴露是否也會影響轉錄反應和我們檢測這類反應的能力。應保留獨特的特征，因而不會削弱我們確定抗藥性的能力。關注基因集的基因表達水平將使用定量RT-PCR確定。
[0173] iv.表達特征的探針選擇以鑒定抗藥譜。基于在Sub-aim Bi中獲得的數據，選擇了一組候選基因，所述候選基因將產生用于對抗生素暴露的轉錄反應的特征。在整個TB基因組內高度保守的區內選擇用于每個基因的兩個50個堿基對的區。以生物信息學法選擇探針，以在5度解鏈溫度窗口內適合并具有最少mRNA二級結構。這些探針將用于在下述條件下利用可得的技術比較藥物敏感株和抗藥株，包括純性培養中最初復制或非復制的桿菌、我們實驗室現有的細胞培養巨噬細胞感染模型中的胞內桿菌以及預暴露給不同抗生素組合的細菌。將所有結果與通過定量RT-PCR獲得的數據進行比較。所述集合的改進和精化將以迭代方式進行。
[0174] C.優化樣品處理用于帶有分子條形碼的數字基因表達。
[0175] 除確定用于鑒定表達特征的探針集之外，第二個主要挑戰為優化樣品處理以從存在于樣品內的桿菌測定數字基因表達。由于大多數TB病例為肺起源的以及大多數待處理的樣品為患者痰，因此優化痰樣的處理以從感染性TB桿菌獲得mRNA測定。使用經摻加的痰模型，其中用處于復制或非復制（碳饑餓）狀態的TB桿菌摻加收集自健康未感染患者 (其未用抗生素治療）的痰。待處理的問題包括處理痰的可變粘度以及有效地在痰樣內裂解TB桿菌。數字基因表達的主要優點之一為使mRNA在極其粗制的樣品中與其各自的探針雜交的能力，所述樣品包括粗制的細胞裂解物、固定的組織樣品、全血和尿中的細胞、來自蜱的粗制裂解物的細胞以及含有400mM異硫氰酸胍（GITC)、聚丙烯酰胺和trizol的樣品。因此，最初跡象表明，在裂解痰內的細菌后將不需要純化步驟，因為全血、尿或固定的組織樣品已不需要純化。僅需要充分混合以允許探針與mRNA之間的接觸。
[0176] 對于這些實驗，未感染的痰獲自Brigham和Women' s醫院（BWH)標本庫。所述標本庫為IRB管理的單位，由BWH病理科的LynBry，MD, PhD管理。廢棄的痰將在實驗室中完成所有處理之后獲得（一般在收集的12-24小時之內）。僅從前48個小時中未接受任何抗生素的受試者中收集痰。將所有樣品去識別化并且收集未受保護的衛生信息。基于標本實驗室的當前工作量，在大約數周內獲得所需量的痰（25-50mL)。
[0177] i.痰處理。痰樣在細菌接種量、稠度和粘度上不同。測試了數種方法使以下速度達到最大，細菌以所述速度與培養基條件中殺菌水平的抗生素接觸并暴露給寡聚物探針以雜交。使用了處理痰的數種方法，包括不處理、使痰通過注射器針頭、用溶菌酶和/或DNA 酶、Sputalysin(Calbiochem ;0. 1% DTT，標準地用于處理來自囊性纖維化患者的痰）處理或者將樣品簡單稀釋到某些輕微變性劑（即GITC)中。用H37Rv摻加痰并通過多種方法處理以改變其粘度，進行上述以確定這些方法中的任一種是否干擾所述技術。
[0178] ii.用TB桿菌摻加的痰中的細菌裂解。在測定中使用了有效裂解細菌細胞、阻止轉錄和基于酶的mRNA降解以及使mRNA易接近探針的數種方法。檢測痰中細菌轉錄反應的先前研究首先向樣品中加入GTC或類似試劑以阻止轉錄反應。然后可在GTC處理后使用離心自痰樣中濃縮細菌。分枝桿菌的裂解通常通過物理方法完成，即用〇. Iml玻璃珠或鋯珠勻漿。開發這類物理方法破碎經處理痰內的細菌，以利用來自IA的經設計以檢測TB桿菌的探針集分析摻加到未感染人痰中的桿菌。
[0179] 用于裂解的備選方法可能更遵從基于領域的考慮，包括噬菌體裂解。加入噬菌體或者更優化的純化的噬菌體溶素可提供用于細菌裂解的低成本、簡易且非電的選項。 Fischetti實驗室（Rockefeller University)近期已證實利用純化的噬菌體溶素快速并徹底裂解數種革蘭氏陽性物種，所述噬菌體溶素以酶法水解肽聚糖，導致滲透性裂解。 Hatfull實驗室（University of Pittsburgh)目前正致力于從數種裂解性分枝桿菌噬菌體表征LysA酶的活性并優化其性能。在不存在純化的溶素時，進行研究以確定裂解性噬菌體例如D29對TB的高MOI感染可否在痰中有效地裂解TB。目前不清楚此方法將如何影響細菌的轉錄譜，因為其將可能需要在不存在變性劑的情況下進行，所述變性劑會影響噬菌體的結合、進入和隨后的裂解性質。分枝桿菌噬菌體TM4亦表達具有肽聚糖水解酶活性的結構蛋白Tmp，所述Tmp可允許將其用作高MOI下細胞裂解的快速方法。一旦裂解，用GITC、 RNAlater或者可鈍化內源RNA酶活性的其他試劑穩定mRNA。
[0180] 實施例5:
[0181] 細菌和真菌培養：使大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌、斯氏普羅威登斯菌、奇異變形菌（P. mirabilis)、粘質沙雷氏菌（S. marcescens)、產氣腸桿菌 (E. aerogenes)、陰溝腸桿菌（E. cloacae)、摩氏摩根氏菌（M. morganii)、產酸克雷伯氏菌（K. oxytoca)、弗氏朽1檬酸桿菌（C. freundii)或白假絲酵母（C. albicans)在 Luria-Bertani培養基（LB)中生長至OD6tltl約為1。對于混合實驗，在裂解用于NanoString? 分析之前，將如通過〇D_所確定的相等數量的細菌組合。如上所述在收獲或抗生素暴露之前，使分枝桿菌隔離群在Middlebr 〇〇k7H9培養基中生長至對數中期。
[0182] 抗藥性實驗室菌株的衍生：自Hooper實驗室，Massachusetts General Hospital, Boston, MA獲得在gyrA中具有限定的抗氟喹諾酮染色體突變（gyrAl-G81D ; gyrA2-S83L)的大腸桿菌實驗室菌株J53。從預先確定含有這些質粒的臨床隔離群中純化血楽介導的喹諾酮抗性決定簇（oqxAB、qnrB、aac6_Ib)。用這些質粒轉化大腸桿菌親株 J53,并且用PCR確證其存在。
[0183] 病毒和瘧原蟲感染：在所示的MOI下分別用HSV-I菌株KOS和HSV-I菌株 186Syn+、A 型流感 PR8 或 HIV-1NL-ADA 感染 HeLa 細胞（IxlO6)、293T 細胞（2xl05)和人外周血單核細胞（5xl05)。用惡性瘧原蟲菌株3D7感染原代紅細胞（5xl0 9)直至其達到指定的寄生蟲血癥水平。在所示的時間，將所述細胞用PBS清洗一次并采集。
[0184] 抗生素暴露：使大腸桿菌或銅綠假單胞菌的培養物在LB中生長至0D_約為1。然后將培養物分成兩個樣品，其中之一用抗生素處理（大腸桿菌處理10分鐘：環丙沙星 4-811〖/1111或300叩/1111、慶大霉素64或12811〖/1111或者氨節西林50011〖/1111;銅綠假單胞菌處理30分鐘：環丙沙星16 ii g/ml)。將處理部分和未處理部分二者維持在37°C，以200rpm 振蕩。使金黃色葡萄球菌或屎腸球菌的培養物在LB中生長至OD 6tltl約為1。然后將培養物分別暴露給氯唑西林（25 ii g/mL)或萬古霉素（128 ii g/mL)達30分鐘。
[0185] 使結核分枝桿菌的培養物生長至對數中期，然后對0D_0. 2標準化。不用抗生素或用以下抗生素之一（終濃度）處理2ml各培養物：異煙肼0. 2-1. 0 ii g/ml ;鏈霉素5 ii g/ ml、利福平0. 5 ii g/ml或環丙沙星5 ii g/ml。將平板密封并在無振蕩的情況下孵育3或6小時。然后制備裂解物并如上所述使用表6所列探針分析。
[0186] 樣品處理：對于革蘭氏陰性隔離群，將5-lOiU培養物直接加入IOOiURLT緩沖液中并渦旋。對于臨床標本，將來自患者的20 ill尿直接加入100 UlRLT緩沖液中，所述患者經臨床實驗室確定為患有大腸桿菌尿路感染。對于分枝桿菌，將I. 5ml培養物離心，然后用 Trizol(Gibco)重懸，進行或不進行通過珠粒攪打的機械破碎，收集最初水相用于分析。使用Trizol和氯仿類似地制備病毒和寄生蟲RNA。對于所有裂解物，依照標準NanoString? 方案，將3-5 iU直接用于雜交。將原始計數對樣品的所有探針的平均值標準化，并且通過將抗生素處理的樣品與未經抗生素處理的樣品比較來確定每個基因的倍數誘導。
[0187] 生物鑒定探針的選擇：為了選擇NanoString?探針用于生物的示差檢測，將相關生物的所有公開可得經測序的基因組進行比對。通過選擇與所述物種的所有經測序基因組的至少70%編碼序列（⑶S)長度具有至少50%同一性的⑶S，來鑒定在各物種之內保守的基因。將CDS斷裂成重疊的50-聚體并且僅保留以下50-聚體，所述50-聚體在物種內完全保守并且與研究中任何其他物種的CDS具有不高于50 %的同一性。回顧了 Gene Expression Omnibus中可得的已公布表達數據，并且選擇在多數條件下良好表達的基因。為了鑒定唯一的結核分枝桿菌探針，使用已公布的微陣列數據鑒定落入以下兩類之一的高表達基因：結核分枝桿菌復合物獨有的類別（使用BLASTN與非冗余數據庫中的任何其他基因具有>70%同一性并且跨越所有可得的結核分枝桿菌和牛分枝桿菌（Ebovis)基因組為保守的），以及在一組臨床上相關的分枝桿菌（包括結核分枝桿菌、鳥分枝桿菌和副結核分枝桿菌）內具有>85%同一性的類別。針對白假絲酵母基因組的50-聚體區段設計白假絲酵母探針，所述50-聚體區段與包含在其探針集中的十個附加病原生物的完整基因組相比為唯一的。針對在病毒（即所有HSV-2或HIV-I隔離群）內高度保守的基因設計病毒探針，所述基因在相同家族內的病毒之間（即HSV-I和HSV-2之間）較不保守。針對在寄生蟲生命周期的每個血階段中大量表達的基因設計惡性瘧原蟲探針。對所有探針進行篩選以避免與人RNA的交叉雜交。
[0188] 探針集：對于革蘭氏陰性生物鑒定，使用包含用于大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和銅綠假單胞菌的探針的合并探針集。對于分枝桿菌生物鑒定，用于結核分枝桿菌的種特異性探針和更廣泛的分枝桿菌屬探針在針對微生物病原體的更大探針集中。
[0189] 為在暴露給不同抗微生物劑時差異調節的基因設計探針，以測定反應的存在或不存在（Sangurdekar 等，Genome Biology7，R32(2006) ;Anderson 等,Infect. Tmmun. 76, 1423-1433, (2008) ；Brazas 和 Hancock, Antimicrob. Agents Chemother. 49, 3222-3227,（2005))。在將野生型大腸桿菌K-12暴露給環丙沙星、慶大霉素或氨芐西林10-30分鐘之后，觀察到在轉錄物水平上的預期改變，所述改變一起限定用于各抗生素的藥物敏感性表達特征（圖23A和23B，表7)。在相應的抗藥株中沒有引出這些特征（圖23A和23B)。
[0190] 快速表型藥物敏感性測試將在結核病中造成尤其深遠的影響，因為已建立的用于表型測試的方法花費數周至數月（Minion等，Lancet Infect DislO, 688-698，（2010))。響應抗結核藥異煙肼、環丙沙星和鏈霉素的表達特征能夠在3-6小時抗生素暴露后區分敏感性和抗藥性隔離群（圖23C)。轉錄譜中的一些基因為機制特異性的（即對于環丙沙星為： recA、alkA和Ihr ;對于鏈霉素為：groEL ;以及對于異煙肼為：kasA和accD6)。其它基因尤其是涉及分枝菌酸合成或中間代謝的基因，因響應多種抗生素而減量調節，表明自生長轉向損傷控制。
[0191] 為了將這些復雜響應簡化成單一定量的度量以區分敏感株和抗藥株，利用以下度量，即每個實驗樣品的表達反應離對照抗生素敏感樣品的形心的均方距離（MSD)。抗生素敏感株緊密聚簇，因此具有小MSD。相反地，抗生素抗性株具有較大值，因為許多基因未能以類似于一般敏感株的方式響應抗生素。將MSD報告為無因次的Z分數，表不樣品離大腸桿菌（圖24A、24B、27和28)或結核分枝桿菌（圖24C和29)的敏感性隔離群平均值的標準差數量。
[0192] 由于表達譜反映表型而不是基因型，因此可使用單一整合的表達特征測定通過多種機制介導的抗藥性。將環丙沙星敏感性大腸桿菌J53菌株的轉錄反應與具有不同抗藥性機制的一系列同基因突變型比較：兩個突變型在氟喹諾酮靶基因拓撲異構酶gyrA中具有單突變（G81D或S83L)，三個突變型攜有附加型喹諾酮抗性基因，包括aac(6'）-Ib(乙酰化鈍化酶）、qnrB(其阻斷gyrA的活性部位）和oqxAB(流出泵）。與親株相比，所有J53衍生物具有高Z分數，反映了抗藥性（圖24B)。
[0193] 將對異煙肼的反應與一系列敏感性臨床隔離群和實驗室隔離群以及兩個抗異煙肼菌株比較，包括攜有在katG(前藥激活所需的過氧化氫酶）的突變（S315T)的H37Rv衍生實驗室菌株，以及在異煙肼靶標inhA的啟動子具有突變（C-15T)的臨床隔離群。因它們不同的抗藥性機制所致，這兩個菌株對異煙肼具有不同水平的抗藥性，katG突變型具有高水平抗藥性（在最小抑菌濃度（MIC)上>100倍增加至>6. 4 ii g/mL)，而inhA啟動子突變在 MIC上僅具有8倍增加至0. 4 ii g/mL。暴露給低異煙肼濃度（0. 2 ii g/mL)在任一個抗藥株中均未引起轉錄反應，但是在更高異煙肼濃度（ly g/mL)下，inhA突變型以與katG突變型相比敏感的方式反應（圖24C)。因此，本方法不僅是機制獨立的，而且也可提供區分高水平和低水平抗藥性的相對衡量。
[0194] 最后，由于RNA幾乎普遍存在于范圍從細菌、病毒、真菌到寄生蟲的病原體中，因此可將RNA檢測整合到適用于跨越廣泛范圍傳染劑的單一診斷平臺中。利用一大群混合的病原體探針，我們能夠直接和特異地檢測信號以鑒定真菌病原體白假絲酵母（圖25A); 以劑量依賴性方式在細胞培養物中鑒定人免疫缺陷病毒（HIV)、流感病毒和單純皰疹病毒-2(HSV-2)(圖25B-D);以及在受感染紅細胞中鑒定惡性瘧原蟲生命周期的不同階段 (圖 25E)。
[0195] NanoString?數據分析以及對于藥物敏感性的距離度量均方距離的計算：對于所有經藥物處理的樣品，首先將每個探針的原始NanoString?計數對每個樣品的所有相關 (即種適當的）探針的平均值標準化。通過將每個測試條件下經抗生素處理的樣品中每個探針的標準化計數與未經處理的基線樣品中的相應計數進行比較，確定在轉錄水平上的倍數變化。
[0196] 為了將定性的表達特征轉換成敏感性或抗藥性的二元結果，開發了算法以計算樣品的轉錄譜離暴露給相同藥物的敏感株的轉錄譜的均方距離（MSD)。藥物敏感性實驗中的 MSD度量如下計算：
[0197] 1.通過將原始值對樣品中所有相關探針計數的平均數標準化，來修正在樣品量上的變化。
[0198] 2?選擇一組NanoString?探針，我們將其表示為Pj。下標j為I-N探針（所選探針的總數）。將所述分析限于在藥物敏感性和抗藥性隔離群之間差異變化的探針。
[0199] 3.將藥物敏感株的重復定義為Nsanip。對于每個重復，將在藥物處理前后對每個探針匕的標準化計數表示為或(^^，i表示樣品指數。
[0200] 4.接著計算"對數誘導比率"：
[0201]

【權利要求】
1. 一種確定病原體的藥物敏感性的方法，所述方法包括：提供包含病原體的樣品；使所述樣品與一種或多種試驗化合物接觸以提供試樣；在將信使核糖核酸（mRNA)自病原體釋放進入試樣的條件下處理所述試樣；將所述試樣暴露給包含多個探針子集的多種核酸探針，其中各子集包含與靶mRNA特異性結合的一種或多種探針，與抗藥性生物相比，所述靶mRNA在對試驗化合物敏感的生物中差異表達，其中所述暴露在使探針和靶mRNA之間的結合可發生的時間內和條件下進行；確定探針與祀mRNA之間的結合水平，從而確定祀mRNA水平；和將存在試驗化合物時的靶mRNA水平與參考水平進行比較，其中所述靶mRNA水平相對于靶mRNA參考水平的差異表明所述病原體對試驗化合物是敏感的還是抗性的。
2. 權利要求1的方法，其中所述試驗化合物為針對病原體的已知或潛在治療。
3. 權利要求1的方法，其中所述方法包括使樣品與兩種或更多種試驗化合物接觸。
4. 權利要求1的方法，其中使所述樣品與一種或多種試驗化合物接觸達少于4小時。
5. -種鑒定傳染病病原體的方法，所述方法包括：提供來自疑似被病原體感染的受試者的試樣；在釋放信使核糖核酸（mRNA)的條件下處理所述試樣；將試樣暴露給包含多個探針子集的多種核酸探針，其中各子集包含與靶mRNA特異性結合的一種或多種探針，所述靶mRNA唯一地鑒定病原體，其中所述暴露在使探針和靶mRNA 之間的結合可發生的時間內和條件下進行；和確定探針與祀mRNA之間的結合水平，從而確定祀mRNA水平；其中試樣相對于參考樣品在祀mRNA方面的增加，表明試樣中病原體的身份。
6. 權利要求1或5的方法，其中所述試樣選自痰、血、尿、糞便、關節液、腦脊液和子宮頸 /陰道拭子。
7. 權利要求1或5的方法，其中所述試樣包含多種不同的傳染病病原體或非致病生物。
8. 權利要求1或5的方法，其中所述一種或多種核酸探針選自表2。
9. 權利要求1或5的方法，其中所述病原體為細菌、真菌、病毒或寄生蟲。
10. 權利要求1或5的方法，其中所述病原體為結核分枝桿菌。
11. 權利要求1或5的方法，其中所述mRNA在與探針接觸之前為粗制的。
12. 權利要求1或5的方法，其中所述方法不包括擴增mRNA。
13. 權利要求1或5的方法，其中所述方法包括以酶法、化學法或機械法裂解細胞。
14. 權利要求1或5的方法，其中所述方法包括微流體裝置的使用。
15. 權利要求1或5的方法，其中將所述方法用于監測病原體感染。
16. 權利要求1的方法，其中所述病原體在來自受試者的樣品中。
17. 權利要求5或16的方法，其中所述受試者為人。
18. 權利要求5或16的方法，其中所述方法進一步包括確定或選擇用于受試者的治療，以及任選給予受試者所述治療。
19. 一種選擇用于受試者的治療的方法，所述方法包括：任選用以下方法鑒定來自受試者的樣品中的病原體，所述方法包括：提供來自疑似被病原體感染的受試者的試樣；在釋放信使核糖核酸（mRNA)的條件下處理所述試樣；將試樣暴露給包含多個探針子集的多種核酸探針，其中各子集包含與靶mRNA特異性結合的一種或多種探針，所述靶mRNA唯一地鑒定病原體，其中所述暴露在使探針和靶mRNA 之間的結合可發生的時間內和條件下進行；和確定探針與祀mRNA之間的結合水平，從而確定祀mRNA水平；其中試樣相對于參考樣品在祀mRNA方面的增加，表明試樣中病原體的身份；利用權利要求1的方法確定病原體的藥物敏感性；以及選擇所述病原體對其敏感的藥物用于治療受試者。
20. -種在受試者中監測病原體感染的方法，所述方法包括：在第一時間獲得包含病原體的第一樣品；利用權利要求1的方法確定第一樣品中病原體的藥物敏感性；任選選擇所述病原體對其敏感的治療并給予受試者所選治療；在第二時間獲得包含病原體的第二樣品；利用權利要求1的方法確定第二樣品中病原體的藥物敏感性；和將第一樣品和第二樣品中病原體的藥物敏感性進行比較，從而在受試者中監測感染。
21. 權利要求20的方法，其中所述受試者為免疫缺損的。
22. 權利要求20的方法，其中所述方法包括選擇病原體對其敏感的治療并給予受試者所選治療，以及利用權利要求1的方法確定第二樣品中的病原體對所選治療的藥物敏感性，其中在病原體的藥物敏感性上的改變表明所述病原體是對所述治療有抗性還是變為對所述治療有抗性。
23. 權利要求20的方法，其中在病原體的藥物敏感性上的改變表明所述病原體對所述治療有抗性或變為對所述治療有抗性，以及所述方法進一步包括給予受試者不同的治療。
24. -種在受試者群體中監測病原體感染的方法，所述方法包括：在第一時間獲得來自群體中受試者的第一多種樣品；利用權利要求1的方法確定第一多種樣品中病原體的藥物敏感性，以及任選用以下方法鑒定第一多種樣品中的傳染病病原體，所述方法包括：提供來自疑似被病原體感染的受試者的試樣；在釋放信使核糖核酸（mRNA)的條件下處理所述試樣；將試樣暴露給包含多個探針子集的多種核酸探針，其中各子集包含與靶mRNA特異性結合的一種或多種探針，所述靶mRNA唯一地鑒定病原體，其中所述暴露在使探針和靶mRNA 之間的結合可發生的時間內和條件下進行；和確定探針與祀mRNA之間的結合水平，從而確定祀mRNA水平；其中試樣相對于參考樣品在祀mRNA方面的增加，表明試樣中病原體的身份；任選給予受試者治療；在第二時間獲得來自群體中受試者的第二多種樣品；利用權利要求1的方法確定第二多種樣品中病原體的藥物敏感性，以及任選用以下方法鑒定第一多種樣品中的傳染病病原體，所述方法包括：提供來自疑似被病原體感染的受試者的試樣；在釋放信使核糖核酸（mRNA)的條件下處理所述試樣；將試樣暴露給包含多個探針子集的多種核酸探針，其中各子集包含與靶mRNA特異性結合的一種或多種探針，所述靶mRNA唯一地鑒定病原體，其中所述暴露在使探針和靶mRNA 之間的結合可發生的時間內和條件下進行；和確定探針與祀mRNA之間的結合水平，從而確定祀mRNA水平；其中試樣相對于參考樣品在祀mRNA方面的增加，表明試樣中病原體的身份；將第一多種樣品和第二多種樣品中病原體的藥物敏感性以及任選所述病原體的身份進行比較，從而在受試者群體中監測感染。
25. 與固相支持體結合的多種多核苷酸，其中所述多種多核苷酸包含至少一種多核苷酸，每種多核苷酸選擇性地與選自表2的一個或多個基因雜交。
26. 權利要求25的多種多核苷酸，所述多種多核苷酸包括SEQ ID NO: 1-227或其任何組合。
27. -種來自受試者的紅細胞。
【文檔編號】C12R1/01GK104212890SQ201410415201
【公開日】2014年12月17日申請日期:2011年2月24日優先權日:2010年2月24日
【發明者】D.洪J.戈麥斯, L.科西米, R.尼科爾, M.博羅夫斯基, A.巴查克, A.B.安德東克申請人:布羅德研究所有限公司, 綜合醫院公司, 布里格姆婦女醫院

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