用于生物防控的禾谷孢囊線蟲RNAi位點序列及其載體和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種用于生物防控及線蟲研究的禾谷孢囊線蟲RNAi位點序列及其載體與應用，本發明通過RNA-seq測序技術并結合生物信息學分析，第一次獲得了較為完整的禾谷孢囊線蟲侵染抗性植物時候的基因表達譜，并在相關數據庫中找到了三條具有致死效應的RNAi特異位點序列，其序列為：RCCNY1：SEQ?ID?NO.1或RCCNY2：SEQ?ID?NO.2或RCCNY3：SEQ?ID?NO.3。
【專利說明】用于生物防控的禾谷孢囊線蟲RNAi位點序列及其載體和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物工程領域，特別涉及一種用于生物防控的禾谷孢囊線蟲RNAi位點序列及其載體和應用。
【背景技術】
[0002]禾谷孢囊線蟲(及SPfiaae人又稱燕麥孢囊線蟲、禾谷孢囊線蟲，對小麥、大麥、黑麥、燕麥及多種禾本科牧草具有嚴重危害性，是世界上廣泛存在的病原線蟲，尤其對小麥的生產構成嚴重的威脅。我國自1987年在湖北天門縣發現該病害以來，迄今已在華北、西北、華中以及華東等13個省區市發現有分布，且有逐漸蔓延之勢。目前的主要防治方法包括農業防治、化學農藥防治和生物防治。長期以來我國農民主要采取輪作、灌溉、增施有機廄肥、深翻和日曬土壤、種植誘捕植物和調節播期等農業技術措施防治線蟲，但是日常種植的作物基本上都是禾谷孢囊線蟲的寄主，因而防治效果并不顯著。化學農藥防控線蟲是有效的方法之一，但是它對環境和農產品造成的污染使得該方法缺陷凸顯。而生物防治目前報道最多的是食線蟲真菌和線蟲天敵細菌，但因其效果不明顯，商品化困難，至今尚沒有一種生防制劑被廣泛推廣。因此，尋找安全而又行之有效的線蟲防治途徑非常必要。
[0003]RNAi 干擾(RNA interference, RNAi)是指由雙鏈 RNA (double-strandRNA, dsRNA)在細胞內特異性地誘導與之同源互補的mRNA降解，使相應基因的表達關閉，從而引發的轉錄或轉錄后水平的基因沉默現象(post-transcript1nal genesilencing, PTGS) 0這種現象是生物為保護自身基因組免受外源(如病毒)和內源性(如轉座元件)序列的侵襲，特異性地調節或干擾基因表達的一種自身防御“免疫”應答現象。
[0004]關于線蟲研究中，已發現線蟲體內存在著能把RNAi信號放大和傳遞的機制，微量的dsRNA就能引導機體產生強烈的RNAi效應，而且能夠傳遞到子代。dsRNA可以通過微注射進入C.elegans成蟲，也可以把C.elegans成蟲浸泡在含有dsRNA的溶液中或者喂飼含有dsRNA的大腸桿菌。注射進入的dsRNA很容易在干細胞中擴散引起RNAi，而且能將這種效應傳遞到子代。這種方法產生的表型外顯率高，非常適合胚胎基因的功能研究。然而注射法需要體外合成dsRNA和手工注射操作，費時、花費高而且技術難度大，很難用于大規模的功能分析。浸泡法是將線蟲浸泡于高濃度的dsRNA溶液。相比注射法，浸泡法能夠同時對大量的線蟲材料進行處理。但是，浸泡法同樣需要體外合成大量的dsRNA(—般為l-5mg/ml),成本很高。與注射法和浸泡法比較，喂飼法有其獨特的優勢。喂飼法通過構建特殊載體，細菌體內誘導表達dsRNA，再喂飼線蟲，可以有效抑制靶標基因的表達，省錢省事，并且可大規模進行實驗。因而，如果建立一個RNAi細菌喂飼文庫，該方法就可高效地研究大批基因的功能，從而找出可用于農業生產中線蟲的防治方法。
[0005]禾谷孢囊線蟲與根結線蟲同屬于固著性內寄生線蟲，與寄主建立寄生關系后雌蟲固著在取食部位不再移動。由于不能在人工培養基上培養，所以直接在寄生線蟲中應用RNAi技術比較困難。根結線蟲體形小，微注射感染手段變得不再實用。另外，它們在感染寄主植物前不正常吸收液體也使得研究無法開展。因而，近幾年的一項重大突破即是找到在植物寄生線蟲上進行RNAi技術的方法。首次向植物寄生線蟲成功注入dsRNA的是Urwin等應用章魚胺刺激大豆胞囊線蟲(Heterodea glycines)和馬鈴薯白線蟲(Globoderapallida)的口腔，使其吸半胱氨酸蛋白酶、hgctl、精子主蛋白(MSP)三個基因的dsRNA。處理過的線蟲侵染植物14天后分離，發現三個靶標基因的表達明顯受到抑制，相應的表觀遺傳性狀也發生了改變。經優化后，此方法也被用于根結線蟲的研究。Bakhetia等把M.1ncognita幼蟲浸泡在編碼過氧化物酶(dual oxidase)的dsRNA中，結果在線蟲侵入大豆35天后檢測，總產卵量減少了 70%。Shingles等應用RNAi技術敲除M1-cpl-Ι基因，降低了其轉錄本豐度，M.1ncognita的J2s幼蟲的半胱氨酸蛋白酶活性也降低了。幾丁質合成酶是甘藍根結線蟲(Meloidogyne artiellia)生成卵殼幾丁質的一種重要的酶。Fanelli等證明把卵塊浸泡在幾丁質合成酶dsRNA溶液中，可以使幾丁質合成酶基因的表達減少，卵孵化延遲。另外，Rosso等研究發現，間苯二酹可刺激M.1ncognita對dsRNA的吸收，并且觀察到了明顯的RANi現象。除了離體干擾線蟲以外，有些學者通過構建表達dsRNA的轉基因植物達到減少根結線蟲寄生的目的。Yadav等把RNAi用于轉基因煙草成功地干擾了 M.1ncognita的生長發育,表明在寄主植物中表達dsRNA是一種控制寄生線蟲病的可行策略。Huang等在擬南芥內過表達根結線蟲寄生基因16D10，結果根結減少了63-90% ,而且體積很小，卵塊的產量也減少了 69-93%，成功地減少了 4種根結線蟲的寄生。Fairbairn等構建轉基因煙草(Nicotiana tabacum)表達dsRNA發夾結構,沉默爪睡根結線蟲(Melododogyne javanica)轉錄因子MjTisll。結果雖然沒有明顯減少線蟲的繁殖量和卵的孵化率，但是證明植物可以作為一種傳輸體系誘導根結線蟲RNAi介導的基因沉默。由上可以看出，利用RNAi轉基因植物來防治寄生線蟲是一個新的防治策略，將為植病防治工作帶來新的前景。
[0006]但前述研究均是集中在模式動物秀麗線蟲和植物寄生根線蟲的相關研究，由于禾谷孢囊線蟲的基因組背景尚未闡明，所以沒有相關研究報道。隨著近年來轉錄組測序技術的發展，利用基因組和轉錄組技術相結合來研究植物寄生性線蟲的方法流行起來。利用轉錄組技術可以高通量的獲得相關線蟲的候選基因從而進一步鑒定相關功能基因。我們利用對禾谷孢囊線蟲(H.avenae)和根結線蟲(Meloidogyne naasi)具有雙抗作用的材料易變山羊草的根部進行了深度的轉錄組測序。通過對測序結果進行分析，在去除了植物，微生物，細菌和載體序列后，首次得到了禾谷孢囊線蟲在侵染抗性植物時表達的相關基因846條。進一步和已有的線蟲數據庫進行比對分析后，去除和植物(plant)，昆蟲(insect)和人類(huma n)同源的基因,最后得到三條和秀麗線蟲(C.elegans)同源又具有致死效應的基因。在此基礎上構建了 dsRNA干擾載體，進行dsRNA浸泡干擾實驗，最后發現三個基因位點均具有致死效應，其中兩個基因具有顯著致死效用。
【發明內容】
[0007]為解決上述現有技術存在的問題，本發明的目的在于提供一種用于生物防控的禾谷孢囊線蟲RNAi位點序列及其載體和應用。
[0008]為達到上述目的，本發明的技術方案為:
[0009]一種用于生物防控及線蟲研究的禾谷孢囊線蟲RNAi位點序列，其序列為:RCCNYl:SEQ ID N0.1 或 RCCNY2:SEQ ID N0.2 或 RCCNY3:SEQ ID N0.3。
[0010]進一步的，所述干擾序列的構建方法為:選用具有CCN抗性和RKN抗性的易變山羊草I號作為轉錄組測序材料，之后通過RNA-Seq測序技術得到了第一個禾谷孢囊線蟲侵染植物的轉錄組，進行轉錄組測序，并通過序列比對，基于線蟲數據庫找到了 36個禾谷孢囊線蟲的RNAi干擾位點序列,通過進一步的篩選,排除了和植物(Plant)、昆蟲(Insect)和人類(Human)同源的序列，最后得到了三個具有致死效應的禾谷孢囊線蟲RNAi位點序列。[0011 ] 一種RNA干擾載體，其特征在于，所述RNA干擾載體含有上述的RCCNYl或RCCNY2或RCCNY3的禾谷孢囊線蟲RNAi位點序列。
[0012]一種用于生物防控及線蟲研究的禾谷孢囊線蟲RNAi位點序列在禾谷孢囊線蟲研究及生物防控方面的應用。
[0013]相對于現有技術，本發明的有益效果為:本發明通過體外轉錄分別合成禾谷孢囊線蟲(CCN)的靶標基因片段 RCCNYl (Unigene38116)、RCCNY2 (Unigenel02492)和RCCNY3 (Unigene38007)的dsRNA,然后通過浸泡法對禾谷孢囊線蟲(CCN)的J2幼蟲進行RNAi實驗。本實驗發現線蟲長時間聚集容易死亡，采用搖床培養懸浮線蟲溶液，大大改善了這一狀況。結果發現dsRNA明顯降低了幼蟲的活性，說明靶標致死效應基因在線蟲的生長發育中具有重要作用。
[0014]由此證明本發明采用轉錄組技術找到相關功能基因研究基因功能的方法切實可行，為大規模鑒定物種全基因組功能提供了新的思路，同時也首次較為系統的鑒定并篩選了禾谷孢囊線蟲與抗性植物拮抗過程中表達的相關基因。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1.利用基因特異的干擾RNA喂飼線蟲24h后線蟲的存活率，dsRNA的濃度為25ng/yL，和對照相比較有顯著差異的(p〈0.05)已用字母標出(a，b，c三組數據間存在顯著性差異)。
[0016]圖2為本發明3個禾谷囊胞線蟲目的基因的dsRNA處理結果，其中，A:水、B:基因RCCNYl (Unigene38116)、C:基因 RCCNY2 (Unigenel02492)、D:基因 RCCNY3 (Unigene38007)。
[0017]圖3為轉錄組測序Unigene序列比對路線圖。
[0018]圖4為基因RCCNYl (Unigene38116)測序圖，結果顯示測序序列和PCR序列完全—致。
[0019]圖5為基因RCCN Y2 (Unigenel02492)，測序圖結果顯示測序序列和PCR序列完全一致。
[0020]圖6為基因RCCNY3(Unigene38007)測序圖，結果顯示測序序列和PCR序列完全一致。
[0021]圖7為基于轉錄組中的候選Unigene基因片段的PCR電泳圖，其中，M:DNA 標記，1:基因 RCCNYl(Unigene38116)、2:基因 RCCNY2(Unigenel02492)、3:基因RCCNY3 (Unigene38007)、4:對照。
【具體實施方式】
[0022]下面結合附圖及【具體實施方式】對本發明方案做進一步詳細描述:
[0023]試驗例:一、實驗材料和試劑
[0024]1.供試線蟲材料
[0025]禾谷孢囊線蟲山東肥城群體(H.avenae,致病型pathotype Ha43)由山東農業大學劉峰教授提供。用采集受害的小麥根和根際土壤，取200ml 土壤于塑料盆中捻碎，用強水流沖洗，攪動，沉淀片刻，將水溶液過20和80目的網篩，重復以上步驟3次，再用小水流輕輕清洗80目篩殘余物，用濾紙過濾，解剖鏡下挑取健康可用的孢囊。
[0026]2.主要試劑和酶類
[0027]DNase I和RNaseH購自全式金公司；高純度質粒提取試劑盒購自Promega ;RNaseInhibitor、LITMUS281載體、T7RNA聚合酶NTPmix購自NEB公司；梭甲基纖維素鈉購自Sigma公司；Taq酶、DNA Marker、pGMTeasy連接試劑盒均為全式金公司產品；間苯二酹購自北京化學試劑廠。
[0028]二、分析及實驗流程:
[0029]RNA-seq 測序:
[0030] 1.植物材料:選用具有CCN抗性和RKN抗性的易變山羊草作為轉錄組測序材料，以測定它在接種CCN處理和不接種CCN兩種情況下根部所有基因的表達情況。首先將材料的種子進行表面滅菌處理(在3%濃度的次氯酸鈉和0.01%的TWeen20混合液中浸泡5min后再用滅菌水浸泡3次，再將種子均勻鋪陳在持續濕潤的濾紙上置于5cm直徑的培養皿中，在20°C左右的室溫和16h/8h的光照周期環境下發苗。十天后將幼苗均分為兩組:一組用于接種CCN的J2幼蟲(每株接種1000條)，另一組不接蟲而作為第一組的對照，同時將接種CCN 的時間點定義為 Oh/dpi (hours or days post inoculat1n, hpi or dpi)。30 個小時后(30hpi)，將所有植株轉到無線蟲和無菌的環境下以避免未侵入根部的CCN持續侵染，從而使得合胞體(syncytia)的發育同步化，同時確保周圍環境為20°C左右的室溫和16h/8h的光照周期以促使植株繼續生長發育。
[0031]2.轉錄組測序:等量混合接種禾谷孢囊線蟲和不接蟲兩種處理在接蟲后30小時、3天和9天的根部RNA進行Illumina HiSeq?2000測序平臺4G深度的轉錄組從頭測序,運用兩個組裝程序對測序數據進行拼接。通過Trinity method獲得了 118，064條獨立基因(unigene)，其平均長度為500bp、N50為599bp、平均測序深度為33.25倍。進一步對這些獨立基因進行了注解。
[0032]線蟲序列篩選:
[0033]1.通過注解獲得全部長度超過200bp的轉錄組數據庫在
[0034]Swiss-prot/trEMBL蛋白數據庫進行比對，以得分超過50 (bit score>50)為篩選得分臨界值；
[0035]2.對公共數據庫(NCBI dbEST)中可以下載的全部線蟲表達
[0036]序列標簽(Nematode EST)基于生活周期分為三類:自由線蟲(FLN)、動物寄生線蟲(APN)和植物寄生線蟲(PPN)。將蛋白數據庫比對后序列在線蟲表達數據庫中進行本地比對(tblastX)來進一步確定線蟲相關基因，同時也通過核苷酸序列比對(blastN)和蛋白質序列比對(blastX)在Μ.incognita和Μ.hapla的基因組數據庫中進行比對(genomeproject websites (http://www.1nra.fr/meloidogyne_incognita, http://www.hapla.0rg),以上比對結果均選擇最佳比對值(Top hits)。
[0037]轉錄組測序Unigene序列比對路線如圖4所示。
[0038]RNAi位點的發現:
[0039]1.把預測得到的線蟲基因序列采用本地比對，基于秀麗線蟲基數
[0040]據庫WormBase (http://www.wormbase.0rg, release WS227),將最為相似的基因序列作為禾谷孢囊線蟲候選基因保留下來；
[0041]2.將前述比對得到的基因和秀麗線蟲的RNAi位點數據庫相比較
[0042](WormMart sect1n of WormBase (release WS220)),選出可以對應到致死效應的位點的基因(比對得分臨界值>40，bit scoreMO)；
[0043]3.將前述得到的RNAi位點序列以比對得分臨界值>40 (bit scoreMO)為標準，進一步和植物的非冗余蛋白數據庫相比較(plant nonredundant protein database,Embryophyta, NCBI txid3193),將比對不到(No hits)植物非冗余蛋白數據庫的基因進一步和昆蟲(insect)的非冗余蛋白數據庫(nonredundant insect protein database (NCBItxid6960))及人類(human)的非冗余蛋白數據庫(nonredundant human proteindatabase (NCBI txid9606))進行比對(得分臨界值>40，bit scoreMO)，最后只將致死型RNAi (lethal RNAi)序列，同時又比對不到(No hits)植物、昆蟲和人類非冗余蛋白數據庫的基因序列作為候選的RNAi位點。
[0044]3.三個禾谷孢囊線蟲基因部分片段的PCR擴增
[0045]a.弓丨物設計:
[0046]如表1所示，候選禾谷孢囊線蟲轉錄組中具有致死效用基因序列及秀麗線蟲中同源基因
[0047]
【權利要求】
1.一種用于生物防控及線蟲研究的禾谷孢囊線蟲RNAi位點序列，其特征在于，其序列為:RCCNY1:SEQ ID N0.1 或 RCCNY2:SEQ ID N0.2 或 RCCNY3:SEQ ID N0.3。
2.根據權利要求1所述的一種用于線蟲研究及生物防控的禾谷孢囊線蟲RNAi位點序列，其特征在于，所述干擾序列的構建方法為:選用具有CCN抗性和RKN抗性的易變山羊草I號作為轉錄組測序材料，之后通過RNA-seq測序技術得到了第一個禾谷孢囊線蟲侵染植物的轉錄組，進行轉錄組測序，并通過序列比對，基于線蟲數據庫找到了 36個禾谷孢囊線蟲的RNAi干擾位點序列，通過進一步的篩選，排除了和植物、昆蟲和人類同源的序列，最后得到了三個具有致死效應的禾谷孢囊線蟲RNAi位點序列。
3.—種RNA干擾載體，其特征在于，所述RNA干擾載體含有權利要求1所述的RCCNYl或RCCNY2或RCCNY3的禾谷孢囊線蟲RNAi位點序列。
4.權利要求1所述的一種用于生物防控及線蟲研究的禾谷孢囊線蟲RNAi位點序列在禾谷孢囊線蟲研究 及生物防控方面的應用。
【文檔編號】C12N15/63GK104178490SQ201410406303
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月18日 優先權日:2014年8月18日
【發明者】余懋群, 鄭明輝, 李林, 徐德林, 龍海, 潘志芬, 鄧光兵 申請人:中國科學院成都生物研究所