一種食品中沙門菌的pcr檢測方法

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一種食品中沙門菌的pcr檢測方法
【專利摘要】本發明具體為一種食品中沙門菌的PCR檢測方法。該檢測方法包括以下步驟：（1）樣品預處理：取樣后加入無菌生理鹽水溶解；（2）細菌培養：先進行前增菌再進行選擇性增菌，并進行細菌鑒定，取鑒定后的菌落加入無菌生理鹽水配制成菌懸液；（3）DNA提取：取菌懸液離心，沉淀洗滌，煮沸，懸浮菌體，冷卻加入Tris-HCL緩沖液，離心，取上清作為模板；（4）PCR擴增：取沙門菌的引物對步驟（3）中的模板進行PCR擴增得PCR擴增產物；（5）PCR產物檢測：取擴增產物，進行凝膠電泳成像。該檢測方法可迅速檢出食品中沙門菌，檢測結果準確，敏感度及特異度高。
【專利說明】-種食品中沙門菌的PCR檢測方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬食品安全檢測領域，具體涉及食品中沙門菌的快速檢測方法。

【背景技術】
[0002] 沙門菌廣泛存在于自然界，是引起食源性疾病的首要病原菌，人與動物均可感染，人類感染沙門菌后可發生傷寒、副傷寒、胃腸炎等疾病，傷寒傳染性強、病程長，患者需住院隔離治療，是我國《傳染病防治法》中規定報道的乙類傳染病。近年來，隨著臨床抗生素的不合理應用，且病原菌耐藥性的產生及變異增加，傷害早期診斷較困難，因此，有必要開發靈敏的病原菌的早期檢測方法。
[0003] 目前，公共衛生、食品安全及出入境檢驗檢疫中均將沙門菌檢測作為常規必需檢測的項目。經典的檢測方法為血培養，陽性率可達60% -80%，但該檢測方法耗時長，約 3-5d，且檢出率受采血量及服用抗生素等多種因素影響，此外，分離培養也較困難，因此，準確性及特異性均較差。近年來，有文獻報道采用PCR方法檢測食品中沙門菌，但這些方法大多側重于單一 PCR，而食品中沙門菌含量往往極低，傳統的PCR檢測則顯示出明顯缺陷。為此，本發明提供一種特異性強靈敏度高的多重PCR檢測方法。

【發明內容】

[0004] 本發明針對上述現有技術的不足，提供一種食品中沙門菌的快速檢測方法，檢測結果準確，特異性及靈敏度均較高。
[0005] 本發明的技術方案如下：
[0006] -種食品中沙門菌的PCR檢測方法，包括以下步驟：
[0007] (1)樣品預處理：準確稱取固體樣品2_5g，粉碎，或量取液體樣品5-10ml，在粉碎后的固體樣品及液體樣品中加入無菌生理鹽水進一步溶解；
[0008] (2)細菌培養：將待測樣品置入培養基中培養4_6h，取2_5g培養后紅色可疑菌落，繼續培養4_6h，將培養后的產物進行細菌鑒定，取鑒定后的菌落加入無菌生理鹽水配制成菌懸液；
[0009] (3) DNA提取：取步驟⑵中的菌懸液5-10ml，離心5-8min，沉淀洗漆，煮沸 5-8min，加入NaOH溶液懸浮菌體，冷卻加入Tris-HCL緩沖液，離心，取上清l-3ul作為模板；
[0010] (4)PCR擴增：取沙門菌的引物對步驟（3)中的模板進行PCR擴增；
[0011] 反應體系：10XPCR buffer 緩沖液 2. 5-5ul，Mg2+試劑 5-10ul，PCR 引物 5-10ul， Taq DNA聚合酶2_5ul，加純化水補足至25ul ;
[0012] 反應過程：95°C預變性5min，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，進行30 個循環；最后72 °C延伸5min，得PCR擴增產物；
[0013] (5) PCR產物檢測：取步驟（4)中反應得到的PCR擴增產物5-10ul，分別進行凝膠電泳成像。
[0014] 優選的，所述的培養基為加入了亞硒酸鹽胱氨酸增菌液的CHRMagar顯色增養基。
[0015] 優選的，所述的沉淀洗滌均采用PBS緩沖液，所述的沉淀洗滌重復操作2-5次。
[0016] 優選的，所述的NaOH溶液濃度為2-5mol/L，所述的Tris-HCL濃度為1. 2-1. 5mol/ L，PH 為 8. 2-8. 4。
[0017] 優選的，所述的離心速度為10000-12000轉/min。
[0018] 步驟⑷中PCR擴增采用的PCR引物為：
[0019] Inva 引物：F :CTTTAGCCAAGCCTTGACGAAC ;
[0020] R：AAAGGGCAATACGCAAAGAGGT ；
[0021] Hi la 引物：F :CTGCCGCAGTGTTAAGCATA ;
[0022] R：CTGTCGCCTTAATCGCATGT〇
[0023] 優選的，所述的Mg2+試劑選自MgCL2或MgS0 4的一種或多種，所述的Mg2+試劑濃度 % 1. 5-2. 0mmol/L〇
[0024] 優選的，所述的PCR引物濃度為為8-10mmol/L。
[0025] 優選的，所述的Taq DNA聚合酶濃度為2_5U/ul。
[0026] 本發明與現有技術相比，有益效果體現在：
[0027] 1.本發明先對細菌先進行前增菌，然后進行選擇性增菌，并鑒定，可對食品中沙門菌先進行定性檢測，操作簡便，為后續的PCR定量檢測提供了條件。
[0028] 2.本發明中對待測樣品進行細菌培養時，培養基不采用傳統的NaCl肉湯，而是采用加入了亞硒酸鹽胱氨酸增菌液的CHRMagar顯色增養基，增菌效果好，多重PCR效果良好。
[0029] 3. Inva是調控沙門菌侵入上皮細胞的重要因子，也是產生致病性的重要因子， Hila也是毒力島SP11基因之一，與沙門菌對腸道上皮細胞的侵襲有關，本發明選擇沙門菌特異的Inva及Hila基因，設計沙門菌PCR引物，進行二重PCR擴增，可特異性的檢測沙門菌，提高檢測結果的特異性，減少假陽性。同時，對二重PCR擴增的反應條件進行了優化，避免了引物間相互干擾，提高了檢測結的敏感性。

【具體實施方式】
[0030] 實施例1
[0031] 一種食品中沙門菌的PCR檢測方法，包括以下步驟：
[0032] (1)樣品預處理：準確稱取白木耳2g，粉碎，加入無菌生理鹽水進一步溶解；
[0033] (2)細菌培養：將步驟（1)中得到的白木耳置入加入了亞硒酸鹽胱氨酸增菌液的 CHRMagar顯色增養基中培養4h，取2g培養后紅色可疑菌落，繼續培養4h，將培養后的產物進行細菌鑒定，取鑒定后的菌落加入無菌生理鹽水配制成菌懸液；
[0034] (3)DNA提取：取步驟（2)中的菌懸液5ml，離心5min，采用PBS緩沖液沉淀洗滌，重復2次，煮沸5min，加入2mol/L NaOH溶液懸浮菌體，冷卻加入濃度為1. 2mol/L，PH為8. 2 的Tris-HCL緩沖液，離心，離心速度為10000轉/min取上清lul作為模板；
[0035] (4) PCR擴增：取沙門菌的引物對步驟⑶中的模板進行PCR擴增，Inva引物：F : CTTTAGCCAAGCCTTGACGAAC ；
[0036] R ：AAAGGGCAATACGCAAAGAGGT ；
[0037] Hila ：F ：CTGCCGCAGTGTTAAGCATA ；
[0038] R：CTGTCGCCTTAATCGCATGT ；
[0039] 反應體系：10XPCR buffer 緩沖液 2. 5ul，1. 5mmol/L 的 MgCl2 試劑 5ul，8mmol/L PCR引物5ul，2U/ul的Taq DNA聚合酶2ul，加純化水補足至25ul ;
[0040] 反應過程：95°C預變性5min，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，進行30 個循環；最后72 °C延伸5min，得PCR擴增產物；
[0041] (5) PCR產物檢測：取步驟（4)中反應得到的PCR擴增產物5ul，進行凝膠電泳成像。
[0042] 實施例2
[0043] 一種食品中沙門菌的PCR檢測方法，包括以下步驟：
[0044] (1)樣品預處理：準確稱取香菇5g，粉碎，或量取液體樣品加入無菌生理鹽水進一步溶解；
[0045] (2)細菌培養：將待測樣品置入加入了亞硒酸鹽胱氨酸增菌液的CHRMagar顯色增養基中培養h，取5g培養后紅色可疑菌落，繼續培養6h，將培養后的產物進行細菌鑒定，取鑒定后的菌落加入無菌生理鹽水配制成菌懸液；
[0046] (3)DNA提取：取步驟（2)中的菌懸液10ml，離心8min，采用PBS緩沖液沉淀洗滌，重復5次，煮沸8min，加入5mol/L的NaOH溶液懸浮菌體，冷卻加入濃度為1. 5mol/L，PH為 8. 4的Tris-HCL緩沖液，離心，離心速度為12000轉/min取上清3ul作為模板；
[0047] (4) PCR擴增：取沙門菌的引物對步驟⑶中的模板進行PCR擴增，Inva引物：F : CTTTAGCCAAGCCTTGACGAAC ；
[0048] R ：AAAGGGCAATACGCAAAGAGGT ；
[0049] Hila ：F ：CTGCCGCAGTGTTAAGCATA ；
[0050] R：CTGTCGCCTTAATCGCATGT ；
[0051] 反應體系：10XPCR buffer 緩沖液 5ul，2. Ommol/L 的 MgS0410ul，lOmmol/L 的 PCR 引物10ul，5U/ul的Taq DNA聚合酶5ul，加純化水補足至25ul ;
[0052] 反應過程：95°C預變性5min，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，進行30 個循環；最后72 °C延伸5min，得PCR擴增產物；
[0053] (5)PCR產物檢測：取步驟（4)中反應得到的PCR擴增產物10ul，分別進行凝膠電泳成像。
[0054] 實施例3
[0055] -種食品中沙門菌的PCR檢測方法，包括以下步驟：
[0056] (1)樣品預處理：準確量取碳酸飲料5ml，加入無菌生理鹽水進一步溶解；
[0057] (2)細菌培養：將待測樣品置入加入了亞硒酸鹽胱氨酸增菌液的CHRMagar顯色增養基中培養5h，取3g培養后紅色可疑菌落，繼續培養5h，將培養后的產物進行細菌鑒定，取鑒定后的菌落加入無菌生理鹽水配制成菌懸液；
[0058] (3)DNA提取：取步驟（2)中的菌懸液8ml，離心6min，采用PBS緩沖液沉淀洗滌，重復3次，煮沸6min，加入3. 5mol/L的NaOH溶液懸浮菌體，冷卻加入1. 3mol/L，PH為8. 3 的Tris-HCL緩沖液，離心，離心速度為11000轉/min，取上清2ul作為模板；
[0059] (4) PCR擴增：取沙門菌的引物對步驟⑶中的模板進行PCR擴增，Inva引物：F : CTTTAGCCAAGCCTTGACGAAC ；
[0060] R ：AAAGGGCAATACGCAAAGAGGT ；
[0061] Hi 1 a :F :CTGCCGCAGTGTTAAGCATA ;
[0062] R：CTGTCGCCTTAATCGCATGT ；
[0063] 反應體系：10XPCR buffer 緩沖液 4ul，1. 8mmol/L 的 MgCL2 試劑 8ul，9mmol/L 的 PCR引物5-10ul，3U/ul的Taq DNA聚合酶3. 5ul，加純化水補足至25ul ;
[0064] 反應過程：95°C預變性5min，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，進行30 個循環；最后72 °C延伸5min，得PCR擴增產物；
[0065] (5) PCR產物檢測：取步驟（4)中反應得到的PCR擴增產物5-10ul，分別進行凝膠電泳成像。
[0066] 上述實施例僅為本發明的優選實施方式，并不應理解為對本發明的限定，本領域技術人員根據本發明的揭示，不脫離本發明范疇所做出的改進和修改都應該在本發明的保護范圍之內。
【權利要求】
1. 一種食品中沙門菌的PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 樣品預處理：準確稱取固體樣品2-5g，粉碎，或量取液體樣品5-10ml，在粉碎后的固體樣品及液體樣品中加入無菌生理鹽水進一步溶解； (2) 細菌培養：將待測樣品置入培養基中培養4-6h，取2-5g培養后紅色可疑菌落，繼續培養4-6h，將培養后的產物進行細菌鑒定，取鑒定后的菌落加入無菌生理鹽水配制成菌懸液； (3) DNA提取：取步驟（2)中的菌懸液5-10ml，離心5-8min，沉淀洗滌，煮沸5-8min，力口入NaOH溶液懸浮菌體，冷卻加入Tris-HCL緩沖液，離心，取上清l-3ul作為模板； (4) PCR擴增：取沙門菌的引物對步驟（3)中的模板進行PCR擴增；反應體系：l〇XPCR buffer 緩沖液 2. 5-5ul，Mg2+試劑 5-10ul，PCR 引物 5-10ul，Taq DNA聚合酶2-5ul，加純化水補足至25ul ; 反應過程：95°C預變性5min，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，進行30個循環；最后72°C延伸5min，得PCR擴增產物； (5) PCR產物檢測：取步驟（4)中反應得到的PCR擴增產物5-10ul，進行凝膠電泳成像。
2. 根據權利要求1所述的食品中沙門菌的PCR檢測方法，其特征在于，步驟⑵中所述的培養基為加入了亞硒酸鹽胱氨酸增菌液的CHRMagar顯色增養基。
3. 根據權利要求1所述的食品中沙門菌的PCR檢測方法，其特征在于，步驟⑶中所述的沉淀洗滌均采用PBS緩沖液，所述的沉淀洗滌重復操作2-5次。
4. 根據權利要求1所述的食品中沙門菌的PCR檢測方法，其特征在于，步驟⑶中所述的 NaOH 溶液濃度為 2-5mol/L，所述的 Tris-HCL 濃度為 1. 2-1. 5mol/L，PH 為 8. 2-8. 4。
5. 根據權利要求1所述的食品中沙門菌的PCR檢測方法，其特征在于，步驟⑶中所述的離心速度為10000-12000轉/min。
6. 根據權利要求1所述的食品中沙門菌的PCR檢測方法，其特征在于，步驟（4)中PCR 擴增采用的PCR引物為： Inva 引物：F :CTTTAGCCAAGCCTTGACGAAC ; R ：AAAGGGCAATACGCAAAGAGGT ； Hila 引物：F :CTGCCGCAGTGTTAAGCATA ; R：CTGTCGCCTTAATCGCATGT〇
7. 根據權利要求1所述的食品中沙門菌的PCR檢測方法，其特征在于，步驟⑷中所述的Mg2+試劑選自MgCL 2或MgS04的一種或多種，所述的Mg2+試劑濃度為1. 5-2. Ommol/L。
8. 根據權利要求1所述的食品中沙門菌的PCR檢測方法，其特征在于，步驟⑷中所述的PCR引物濃度為為8-10mmol/L。
9. 根據權利要求1所述的食品中沙門菌的PCR檢測方法，其特征在于，步驟⑷中所述的Taq DNA聚合酶濃度為2-5U/ul。
【文檔編號】C12Q1/04GK104195240SQ201410404056
【公開日】2014年12月10日申請日期:2014年8月16日優先權日:2014年8月16日
【發明者】郭狄申請人:中山鼎晟生物科技有限公司

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