利用腈水解酶工程菌制備1-氰基環己基乙酸的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用腈水解酶工程菌制備1-氰基環己基乙酸的方法：將含重組腈水解酶基因的工程菌經發酵培養后的培養液離心，以濕菌體作為催化劑，以1-氰基環己基乙腈為底物，以pH值為3.0?10.0的緩沖液為反應介質，在25?70°C進行轉化反應，反應結束后，獲得含1-氰基環己基乙酸的混合液，將混合液分離純化，獲得1-氰基環己基乙酸；所述含重組腈水解酶基因的工程菌由SEQIDN0.2所示核苷酸序列編碼基因構建而成；本發明所述含腈水解酶的工程菌作為催化劑，具有良好的區域選擇性和催化活力，生產過程對環境友好。
【專利說明】利用腈水解酶工程菌制備1-氰基環己基乙酸的方法 (一）
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種加巴噴丁關鍵中間體1-氰基環己基乙酸的制備方法，特別涉及 一種利用腈水解酶工程菌制備1-氰基環己基乙酸的方法。 (二）
【背景技術】
[0002] 1-氰基環己基乙酸是合成加巴噴丁的關鍵中間體，目前主要用化學法生產，反應 條件苛刻，產生的廢氣須大量堿液吸收，步驟較多，收率較低。
[0003] 腈水解酶能夠實現有機腈化合物的一步區域選擇性水解合成對應的有機羧酸。通 過腈水解酶實現氰基水解反應條件溫和，反應效率高，而且具有比較高的區域選擇性和立 體選擇性。近年來，利用腈水解酶進行氰基水解合成有機羧酸已經成為研究的熱點，大量文 獻、專利報道了利用腈水解酶的區域選擇性在有機羧酸合成中的應用。
[0004] Zhu等人報道了來自于菌株Bradyrhizobium japonicum USDA110中的臆水解酶 bll6402 (Dimming Zhu, Adv. Synth. Catal. 2007, 349, 1667-1670)，發現此臆水解酶可以催 化各種雙腈，對部分雙腈（包括1-氰基環己基乙腈及其類似物）具有較高的區域選擇性。
[0005] Sophie Bergeron 等人報道了 一 株臆水解酶 BD9570 (來自 Diversa) (Sophie Bergeron, Organic Process Research & Development 20〇6, 10, 661_665)，此臆水解酶可 以催化3-羥基戊二腈合成阿托伐他汀側鏈關鍵手性中間體（R) -4-氰基-3-羥基丁酸，具 有較高的區域選擇性和立體選擇性。
[0006] Zhiyi Xie等人報道了 一株來自于Arabidopsis thaliana的腈水解酶 AtNitl(Zhiyi Xie, Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic, 2006,41，75 - 80),該 腈水解酶可以催化異丁基丁二腈合成普瑞巴林手性中間體（3S)-3-氰基-5-甲基己酸，具 有很高的區域選擇性和立體選擇性。
[0007] John E. Gavagan等人報道了一株來源于Acidovorax facilis 72W腈水解酶（John Ε· Gavagan，J. Org. Chem.，1998, 63, 4792-4801)，該脂肪族腈水解酶對于 α，ω -雙腈具有 較好的區域選擇性。專利US2005009157 Al也報道了該腈水解酶可以催化1-氰基環己基 乙腈合成加巴噴丁中間體1-氰基環己基乙酸。
[0008] 專利 US2005009157 Al 還報道了商品化腈水解酶 NIT-104, NIT-105, NIT-106(來 自Biocatalytics Inc.)以及來自菌株Bacillus sphaericus的腈水解酶對于1-氰基環 己基乙腈具有區域選擇性活力。
[0009] Carmela Bengis-Garber 等人報道 了菌株 Rhodococcus rhodochrous N.C.I.B. 11216中的腈水解酶對于α，ω-雙腈的催化具有區域選擇性。且該菌株的 區域選擇性與底物α，ω-雙腈的碳鏈長度以及培養時所用的誘導劑有關。（Carmela Bengis-Garber 1Appl Microbiol Biotechnol(1989)32:11-16)
[0010] Chandrani Mukherjee 等人報道了 一 株來自于 Synechocystis sp. Strain PCC6803 的臆水解酶（Chandrani Mukher jee, Eur. J. Org. Chem. 2006, 5238 - 5242)，該臆水 解酶催化各種α，ω-雙腈，其區域選擇性與α，ω-雙腈的碳鏈長度有很大的關系。隨著 碳鏈長度的增加，該腈水解酶的區域選擇性逐漸下降。
[0011] 迄今為止，有關對1-氰基環己基乙腈具有區域選擇性催化活力的腈水解酶報道 較少，主要來自 Acidovorax facilis 72W，Bradyrhizobium japonicum USDA110，Bacillus sphaericus以及商品化腈水解酶見1'-104、見1'-105、見1'-106。但是這些腈水解酶催化1-氰 基環己基乙酸存在催化活性較低和催化劑用量較大的問題。所以篩選新型生物催化劑，開 發高效加巴噴丁關鍵中間體酶法合成工藝，建立綠色經濟的加巴噴丁合成新工藝具有重要 意義。 (三）
【發明內容】
[0012] 本發明目的在于解決傳統的化學法水解1-氰基環己基乙腈為1-氰基環己基乙酸 的工藝中，反應條件苛刻，反應中需要大量的有機溶劑，成本較高，收率較低，環境污染較為 嚴重的問題。
[0013] 本發明提供一種水解1-氰基環己基乙腈的區域選擇性腈水解酶，該酶在催化上 述反應時具有良好的區域選擇性和催化活力，生產過程對環境友好。
[0014] 本發明采用的技術方案是：
[0015] 本發明提供一種利用腈水解酶工程菌制備1-氰基環己基乙酸的方法，所述方法 為：將含重組腈水解酶基因的工程菌經發酵培養后的培養液離心，以濕菌體作為催化劑，以 1-氰基環己基乙腈為底物，以PH值為3. 0?10. 0的緩沖液為反應介質（優選pH值為7的 磷酸緩沖液），在25?70°C (優選35°C )進行轉化反應，反應結束后，獲得含1-氰基環己 基乙酸的混合液，將混合液分離純化，獲得1-氰基環己基乙酸；所述含重組腈水解酶基因 的工程菌由SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列編碼基因構建而成。所述底物初始濃度為0. 02? lmol/L，優選100mmol/L，所述濕菌體的質量終濃度為10?100g/L，優選50g/L。
[0016] 進一步，本發明所述催化劑按如下方法制備：將含腈水解酶基因的工程菌接種至 含終濃度50mg/L卡那霉素的LB液體培養基中，37°C、150rpm培養10?12小時，獲得種子 液；隨即將種子液以體積濃度2%的接種量接種至含終濃度50mg/L卡那霉素的LB液體培 養基中，37°C、150rpm培養至培養液的OD 6tltl為0. 6?0. 8,向培養液中加入終濃度為0. ImM 的IPTG，28°C、150rpm誘導培養10小時，將培養液離心，取沉淀水洗，獲得濕菌體即為催化 齊U ;所述LB液體培養基組成為：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化鈉，溶劑為 水，pH值為7。
[0017] 本發明所述1-氰基環己基乙酸分離純化的方法通常為：轉化結束后，轉化液內加 入7?8mL、10. 5M的NaOH溶液（使產物較好溶解，提高回收率），調pH至8. 5-9. 0,離心 (9000rpm，IOmin)，取上清液。往上清液中按體積比1:1比例加入乙醇水溶液（含水量5% 體積濃度）（去除菌體破碎產生的核酸，蛋白質等），抽濾。取濾液，減壓蒸餾（溫度控制在 50°C以下）。餾出酒精后的剩余液體內加入5%。的HC-767針劑用活性炭吸附雜質，抽濾。濾 液內加鹽酸調pH至2. 5左右，靜置，抽濾，將漏斗內含有單酸的濾液回收烘干（35 °C以下）， 即獲得產物1-氰基環己基乙酸。
[0018] 本發明所述生物催化1-氰基環己基乙腈制備1-氰基環己基乙酸的反應方程為：
[0019]
【權利要求】
1. 一種利用腈水解酶工程菌制備1-氰基環己基乙酸的方法，其特征在于所述方法 為：將含重組腈水解酶基因的工程菌經發酵培養后的培養液離心，以濕菌體作為催化劑，以 1-氰基環己基乙腈為底物，以PH值為3. O?10. O的緩沖液為反應介質，在25?70°C進行 轉化反應，反應結束后，獲得含1-氰基環己基乙酸的混合液，將混合液分離純化，獲得1-氰 基環己基乙酸；所述含重組腈水解酶基因的工程菌是由SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列編碼 基因構建而成。
2. 如權利要求1所述利用腈水解酶工程菌制備1-氰基環己基乙酸的方法，其特征在于 所述底物初始濃度為〇. 02?lmol/L，所述濕菌體的質量終濃度為10?100g/L。
3. 如權利要求1所述利用腈水解酶工程菌制備1-氰基環己基乙酸的方法，其特征在于 所述催化劑按如下方法制備：將含腈水解酶基因的工程菌接種至含終濃度50mg/L卡那霉 素的LB液體培養基中，37°C培養10?12小時，獲得種子液；隨即將種子液以體積濃度2% 的接種量接種至含終濃度50mg/L卡那霉素的LB液體培養基中，37°C培養至培養液的0D_ 為0. 6?0. 8,向培養液中加入終濃度為0. ImM的IPTG，28°C誘導培養10小時，將培養液離 心，取沉淀水洗，獲得濕菌體即為催化劑；所述LB液體培養基組成為：10g/L胰蛋白胨，5g/L 酵母提取物，l〇g/L氯化鈉，溶劑為水，pH值為7。
4. 如權利要求1所述利用腈水解酶工程菌制備1-氰基環己基乙酸的方法，其特征在于 所述轉化反應介質為pH值為7的磷酸緩沖液。
5. 如權利要求1所述利用腈水解酶工程菌制備1-氰基環己基乙酸的方法，其特征在于 所述轉化反應溫度為35°C。
【文檔編號】C12R1/19GK104212850SQ201410395753
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年8月12日 優先權日:2014年8月12日
【發明者】薛亞平, 鄭裕國, 徐喆, 柳志強, 王應鵬, 蘇新瑞, 賈東旭 申請人:浙江工業大學