基因組dna測序文庫液相雜交誘捕富集溶液及雜交方法
【專利摘要】本發明公開了基因組DNA測序文庫液相雜交誘捕富集溶液及雜交方法，所述的雜交富集溶液包含磷酸鈉緩沖液，檸檬酸鈉緩沖液(SSC)，SDS，EDTA及Denhardt溶液。本發明的雜交溶液及相應雜交方法成本較低，簡便易行，有效縮短了雜交時間，并能夠精準的提取所需要的DNA片段，減小背景值對信號值所產生的影響，優化雜交靶向富集效果。
【專利說明】基因組DNA測序文庫液相雜交誘捕富集溶液及雜交方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學領域，具體而言，涉及一種基因組DNA測序文庫液相雜交誘捕富集溶液的配方及雜交方法。
【背景技術】
[0002]在過去的幾年中，DNA測序技術出現了一個根本性的轉變，從傳統的Sanger測序發展到了所謂的“下一代測序”技術(Next Generat1n Sequencing, NGS)。其突出特點為大規模并行測序。NGS技術允許數以百萬甚至億萬的測序反應同時進行，從而達到測序通量的巨幅增長。NGS技術平臺需要構建適用于大規模并行測序的片段文庫。構建測序文庫的過程包括將DNA片段化，隨后的DNA修復和末端處理(平端或A突出端)。最后，根據具體的技術平臺而選擇的特異性接頭連接。
[0003]盡管與傳統的Sanger測序法相比，NGS技術相關的成本大幅降低，全基因組測序仍然是成本較高的。此外，有許多應用并不需要全基因組測序，而是需要對于一個或多個樣品的特定區域進行測序。因此，如果感興趣的區域只是基因組的一部分并或者大量數目的樣品需要被分析，我們常常傾向于只對測序文庫的一部分特異子集進行測序，而不是對整個基因組文庫進行測序，從而減少不必要的成本和勞動力。例如有效的全外顯子(所有基因的編碼部分)測序是目前比較主要的應用，但是針對較小的基因組或基因組區域的富集測序也被廣泛應用。在靶向富集的過程中，不感興趣的DNA片段被最大限度的去除，目標區域被從最初的全基因組測序文庫中富集出來，使得后續NGS測序所產生的測序結果主要集中在感興趣的目標區域 。
[0004]為了更好地應用NGS進行靶向測序，多個在測序前進行靶向富集的流程已經被研制出來。通常要進行多個步驟的富集以提供最終的目標測序文庫。目前，常用的靶向富集方法包括PCR擴增法(PCR amplificat1n),選擇性環化法(selective circularizat1n),以及雜交誘捕法(hybrid capture)。不同的祀向富集技術具有不同的性能和易用性。每種方法的最重要的特性，反過來也反映了靶向富集的最大挑戰，包括得到靶向富集測序文庫所消耗的時間，獲得有用的測序結果的每個靶堿基的總成本，富集的參數，包括特異性(測序結果中目標區與非目標區的比例)，覆蓋率(測序深度)，在所有靶向目標區域的覆蓋均勻度，方法流程的可重復性以及所需要的輸入DNA的總量。
[0005]基于PCR原理的富集顧名思義，是利用針對目標區域的PCR引物來擴增靶向序列，進而對特異性的PCR產物進行測序。這種方法通常需要許多循環的變性，退火和延伸，常造成非特異性產物和擴增的偏向性。另外，對于運行數以百計或數以千計的單重PCR反應，需要運用專用自動化設備或分區化設備(例如Fruidigm和RainDance公司的技術)。其他的選擇為在一個反應中進行有限的多重PCR。因此，基于PCR的富集并不能很容易的擴大目標區域，因而多用于較小的目標區域(幾千堿基至幾兆范圍內)。
[0006]選擇性環化法也叫分子倒位探針(MIP)。每一個用于富集的環化探針都擁有一個單鏈DNA寡核酸鏈，其兩端分別含有與靶序列互補的不相連序列，并呈相反的線性順序。探針與靶序列的特異性雜交形成了環狀DNA結構。這種結構被進一步通過間隙填充和連接反應而形成封閉的環狀單鏈DNA。針對環上的一段共有序列而進行的PCR反應會最終擴增這些靶向富集的區域而產生靶向富集的測序文庫。選擇性環化法的最大優點在于其高特異性，但是其最突出的缺點是針對每個目標區域的捕獲均一性較差，遠低于雜交捕獲法。而且其成本較高，所能檢測的目標區域的大小有限(幾千堿基至幾兆范圍內)。
[0007]雜交誘捕法是當輸入DNA樣品中的目標核苷酸序列與定制的與其互補的DNA探針特異性雜交時，目標DNA序列就會被物理性的捕獲和分離出來。由于雜交誘捕法可以很容易的合成大量特異性DNA探針，并在一個反應體系中同時進行，而且多種DNA測序文庫樣品可通過連接不同編碼的測序接頭而混合在一起同時處理，因而雜交誘捕的方法多用于中型到大型的目標區域(I至60Mb)或較多樣品。隨著全外顯子測序的廣泛應用，雜交誘捕法被越來越多的應用起來，針對其的各種實驗流程及商品化試劑也越來越多。
[0008]雜交誘捕富集又可分為固相芯片雜交和液相雜交。在固相芯片雜交中，基因組DNA測序文庫與固定在芯片上的DNA探針相雜交。不能結合的非特異性DNA文庫片段被從芯片上洗去，而靶向富集的DNA文庫稍后被洗脫下來用于測序。在液相雜交中，DNA測序文庫的靶序列與定制的生物素標記的寡核苷酸捕獲探針特異性的結合。隨后加入鏈霉親和素磁珠將會與生物素標記探針結合，從而使與之結合的特異性靶序列利用磁力吸附而分離出來。富集后的DNA文庫被洗脫下來用于測序。
[0009]固相芯片雜交法雖具有許多優于PCR擴增富集的地方，但是芯片的成本比較高，且試驗流程需要昂貴的硬件設備，例如芯片孵育箱。另外，由于同時開始雜交的芯片必須同時一起洗脫富集的DNA文庫，每次可以同時處理的芯片數量也是非常有限的。最后，為了獲得一個雜交富集反應所需的足夠的DNA文庫量，我們需要大約10-15ug的輸入DNA來制備基因組文庫，其對實驗材料起始量的要求是巨大的。相比之下，液相雜交因其易于操作，又只需要少量的輸入DNA文庫，特別是當樣品有限時，而被越來越多的人所應用。液相雜交由于其捕獲探針相對于DNA文庫是過量的，從而推動了雜交反應的充分進行。另外液相雜交的均一性和特異性均高于固相芯片雜交。最后，液相雜交捕獲不需要特殊的儀器，只需要實驗室常規的熱循環儀，而且可以以96孔板的模式同時處理大量樣品。
[0010]由于所用的DNA捕獲探針被設計成能夠與目標靶區域序列互補雜交，使得富集從而依賴于核苷酸的物理和化學特性，例如核苷酸的分子質量，其GC含量，二級結構，熔化和退火溫度，以及核苷酸的濃度和鹽濃度。所有的這些因素都對雜交反應的結合動力學和特異性產生重要影響。基于雜交原理的技術常常需要較高的接近于所用探針的熔化溫度，并需要較長的孵育時間來提高特異性。標準的孵育時間范圍從10小時到72小時不等。長孵育時間的一個重要缺點是增長了得到靶向富集測序文庫的時間，從而影響了后續的測序。另外，較高的孵育溫度和長孵育時間所造成的如水分蒸發的問題，可能會改變雜交混合物中的重要參數，例如鹽濃度，尤其是當雜交反應的體積比較小的時候。目前許多公司已經開發了商品化的液相雜交誘捕富集基因組DNA測序文庫的試劑盒。但其雜交溶液及雜交方法多針對于本公司所生產的捕獲探針，其捕獲探針長度從60到150個堿基不等，且配方不公開，價格昂貴。每一種試劑盒的雜交溫度，孵育時間，及輸入文庫量均不相同。因而很有必要發明一種低成本，操作簡單，可重復性高，周期短，高特異性，又適用于多種方法構建的基因組DNA測序文庫及捕獲探針的雜交溶液及其相應地雜交方法，以滿足日益增長的對靶向下一代測序的要求。
【發明內容】
[0011]本發明的目的是提供一種能夠以較低成本，簡單，快速，高效的實現雜交誘捕富集基因組DNA測序文庫的雜交溶液及采用此雜交溶液進行雜交的方法。為了達到上述目的，擬采用如下技術方案:
[0012]本發明一方面涉及一種基因組DNA測序文庫雜交誘捕富集溶液，其特征在于其包含磷酸鈉緩沖液，檸檬酸鈉緩沖液(SSC)，十二烷基硫酸鈉(SDS)，乙二胺四乙酸(EDTA)及登哈特(Denhardt)溶液,所述的組分獨立包裝。
[0013]在本發明的一個優選實施方式中，基因組DNA測序文庫雜交誘捕富集溶液含有或者不含有其它組分。
[0014]在本發明的另一個優選實施方式中，所述的磷酸鈉緩沖液的是0.4-0.6M磷酸鈉緩沖液，其PH值介于6.8-7.2之間。
[0015]在本發明的另一個優選實施方式中，SDS的濃度是0.8-1.2% ;EDTA的濃度是l_3mM0
[0016]在本發明的另一個優選實施方式中，所述的基因組DNA測序文庫雜交誘捕富集溶液包括1份磷酸鈉緩沖液，2份檸檬酸鈉緩沖液(SSC)，1份SDS，1份EDTA及4份Denhardt溶液。
[0017]在本發明的一個優選實施方式中，IM磷酸鈉緩沖液(ρΗ7.0)的配方:57.7mllMNa2HPO4 與 42.3mllM NaH2PO4 混合。
[0018]在本發明的一個優選實施方式中，20X SSC配方:3M NaCl，300mM檸檬酸鈉；調節PH值至7.0。
[0019]在本發明的一個優選實施方式中，50X Denhardt溶液:該溶液中含有I %聚蔗糖(Ficoll,400型)，1%聚乙烯吡咯燒酮(polyvinylpyrrolidone),和1%牛血清白蛋白(BSA)。
[0020]本發明另一方面還涉及一種雜交方法，其特征在于采用上述基因組DNA測序文庫雜交誘捕富集溶液富集。
[0021]在本發明的一個優選實施方式中，所述的雜交方法包括如下步驟(圖1):
[0022](I)將基因組DNA片段化為350_550bp (機械破碎，如超聲處理，水力剪切，或酶促片段化均可；其所需片段長度取決于后續擬采用的測序長度)；
[0023](2)根據后續所使用的NGS測序平臺按照標準實驗流程制備基因組測序文庫。
[0024](3)將總量250-2000ng基因組測序文庫池于0.2mL PCR管中干燥，此文庫池中可混合帶有不同索引序列接頭的多個基因組測序文庫樣品。
[0025](4)將以下成分加入已烘干的測序文庫并靜置10分鐘使其充分溶解:
[0026]
【權利要求】
1.一種基因組DNA測序文庫雜交誘捕富集溶液，其特征在于其包含磷酸鈉緩沖液，檸檬酸鈉緩沖液(SSC)，SDS, EDTA及Denhardt溶液，所述的組分獨立包裝。
2.根據權利要求1所述的基因組DNA測序文庫雜交誘捕富集溶液，基因組DNA測序文庫雜交誘捕富集溶液含有或者不含有其它組分。
3.根據權利要求1所述的基因組DNA測序文庫雜交誘捕富集溶液，所述的磷酸鈉緩沖液的是0.4-0.6M磷酸鈉緩沖液，其pH值介于6.8-7.2之間。
4.根據權利要求1所述的基因組DNA測序文庫雜交誘捕富集溶液，SDS的濃度是0.8-1.2% ；EDTA 的濃度是 l-3mM0
5.根據權利要求1所述的基因組DNA測序文庫雜交誘捕富集溶液，所述的基因組DNA測序文庫雜交誘捕富集溶液包括1份磷酸鈉緩沖液，2份檸檬酸鈉緩沖液(SSC)，1份SDS，I份EDTA及4份Denhardt溶液。
6.根據權利要求1所述的基因組DNA測序文庫雜交誘捕富集溶液，IM磷酸鈉緩沖液(ρΗ7.0)的配方:57.7mllM Na2HPO4 與 42.3mllM NaH2PO4 混合。
7.根據權利要求1所述的基因組DNA測序文庫雜交誘捕富集溶液，20XSSC配方:3MNaCl,300mM檸檬酸鈉；調節PH值至7.0。
8.根據權利要求1所述的基因組DNA測序文庫雜交誘捕富集溶液，50XDenhardt溶液:該溶液中含有1%聚鹿糖 (Ficoll,400型)，1%聚乙烯吡咯燒酮(polyvinylpyrrolidone),和I %牛血清白蛋白(BSA)。
9.一種雜交方法，其特征在于采用上述基因組DNA測序文庫雜交誘捕富集溶液富集。
10.根據權利要求9所述的雜交方法，所述的雜交方法包括如下步驟: (1)將基因組DNA片段化為350-550bp(機械破碎，如超聲處理，水力剪切，或酶促片段化均可；其所需片段長度取決于后續擬采用的測序長度)； (2)根據后續所使用的NGS測序平臺按照標準實驗流程制備基因組測序文庫； (3)將總量250-2000ng基因組測序文庫池于0.2mL PCR管中真空高速干燥，此文庫池中可混合帶有不同索引序列接頭的多個基因組測序文庫樣品； (4)將以下成分加入已烘干的測序文庫并靜置10分鐘使其充分溶解:
生物素修飾的單鏈核苷酸捕獲探針3pMole
2-5 μ g 人類 Cot-1 DNA
相應兩端封閉聚合物混合物各ImM
無核酸酶去離子水，將總體積補至10 μ L (5)加入10μ L上述基因組DNA測序文庫雜交誘捕富集溶液，并用移液槍充分混合； (6)將上述反應體系放入熱循環儀運行下列程序:
【文檔編號】C12N15/10GK104178478SQ201410395411
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月13日 優先權日:2014年8月13日
【發明者】邵華武, 邵陽 申請人:邵華武, 邵陽