一種船舶壓載艙沉積物中活體細胞的分離方法
【專利摘要】本發明公開了一種船舶壓載艙沉積物中活體細胞的分離方法，包括如下步驟：(1)采集船舶壓載艙的沉積物，置于培養皿內；(2)用過濾海水沖洗沉積物，并采用第一篩絹過濾，保存沖洗后的液體；(3)將保存的液體采用第二篩絹過濾，保留所述第二篩絹上的殘留物；(4)用飽和蔗糖溶液沖洗所述第二篩絹上的殘留物至離心管；(5)將所述離心管離心；(6)吸取所述離心管的上清液，采用第三篩絹過濾，保留所述第三篩絹上的殘留物；(7)用過濾海水漂洗所述第三篩絹上的殘留物至培養皿中，實現活體細胞的分離，在顯微鏡下觀察活體細胞。本發明所述方法步驟簡單、操作簡便、可以實現分離快速。
【專利說明】一種船舶壓載艙沉積物中活體細胞的分離方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，特別是涉及一種用于船舶壓載艙沉積物中活體細胞的 分離方法。
【背景技術】
[0002] 外來生物入侵對我國生態環境和社會發展構成嚴重威脅，造成了重大的經濟損 失，抵御外來生物入侵，保護國境安全，是出入境檢驗檢疫刻不容緩的職責和義務。隨著海 上航運業的快速發展，船舶壓載水及沉積物帶來的海洋生物入侵問題日益嚴重，海洋生物 入侵會破壞海洋生態系統結構與功能，并造成一定的經濟損失。船舶壓艙水及沉積物攜帶 的海洋生物可以存活數月，并隨著壓艙水的排放而進入其他水域，這為不同水域間一些物 種的傳播提供了一個便利的媒介。外來物種在新的適宜生存環境中的異常繁殖，會對近岸 水域的生態系統帶來災難性破壞，甚至導致本土物種的滅絕。20世紀60年代以來北美五大 湖共發現40余個外來物種，而舊金山灣在1970年后出現了 50多種外來生物。為防止船舶 通過壓載水及沉積物轉移外來生物和病原體，國際海事組織制定《船舶壓載水及沉積物控 制和管理國際公約》及相關導則。
[0003] 海洋浮游動物如枝角類、橈足類等，在其生活史階段會產生休眠細胞以度過不良 環境條件，因此可以長時間在船舶壓載艙沉積物中存活。如Kelly對從日本到達美國塔克 馬和安吉里斯港的木材運輸船中的壓載水沉積物進行了檢測，其中也發現了存活的軟體動 物幼體和浮游甲殼綱動物。Bailey對進入大湖區9艘船舶壓載艙沉積物中的休眠細胞萌發 進行了實驗，在孵化出的浮游動物種類中發現4種外來入侵生物。
[0004] 目前對沉積物中外來生物的鑒定多依賴于實驗室原位萌發實驗，對沉積物中休眠 細胞萌發后的浮游動物幼體進行形態學鑒定，從而判定是否為入侵生物。該方法耗費時間 長，并且要求檢驗檢疫人員具有豐富的生物學分類經驗，嚴重制約船舶壓載艙沉積物中外 來生物檢驗檢疫工作的開展。而從船舶壓載艙沉積物中分離活體細胞并進行分子生物學鑒 定，將大大縮短對船舶壓載艙沉積物中外來入侵生物進行種類鑒定的時間。
[0005] 由于浮游動物休眠細胞個體微小（多為直徑幾十微米），從船舶沉積物壓載艙沉 積物中分離活體細胞十分困難，因此急需建立一種從船舶壓載艙沉積物中快速分離活體細 胞的方法。
【發明內容】
[0006] 本發明要解決的技術問題是提供一種步驟簡單、操作簡便、檢測快速精確的船舶 壓載艙沉積物中活體細胞的分離方法。
[0007] -種船舶壓載艙沉積物中活體細胞的分離方法，包括如下步驟：
[0008] (1)采集船舶壓載艙的沉積物，置于培養皿內；
[0009] (2)用過濾海水沖洗沉積物，并采用第一篩絹過濾，保存沖洗后的液體；
[0010] (3)將保存的液體采用第二篩絹過濾，保留所述第二篩絹上的殘留物；
[0011] (4)用飽和蔗糖溶液沖洗所述第二篩絹上的殘留物至離心管；
[0012] (5)將所述離心管離心；
[0013] (6)吸取所述離心管的所有上清液，采用第三篩絹過濾，保留所述第三篩絹上的殘 留物；
[0014] (7)用過濾海水漂洗所述第三篩絹上的殘留物至培養皿中，實現活體細胞的分離， 在顯微鏡下觀察活體細胞。
[0015] 本發明所述的船舶壓載艙沉積物中活體細胞的分離方法，其中所述第一篩絹的孔 徑為200?250微米，所述第二篩絹和所述第三篩絹的孔徑為30?50微米。
[0016] 本發明所述的船舶壓載艙沉積物中活體細胞的分離方法，其中步驟（4)中所述飽 和蔗糖溶液的濃度為200-220克蔗糖/100毫升蒸餾水。
[0017] 本發明所述的船舶壓載艙沉積物中活體細胞的分離方法，其中步驟（5)中的所述 離心米用臺式離心機，轉速為1000 -1200rpm，離心時間為3-5分鐘。
[0018] 本發明所述的船舶壓載艙沉積物中活體細胞的分離方法，其中步驟（2)和（7)中 的過濾海水為0. 15微米濾膜過濾后的海水。
[0019] 本發明所述的船舶壓載艙沉積物中活體細胞的分離方法，其中步驟（1)中稱取5 克所述沉積物置于培養皿內，步驟（2)和步驟（7)中的過濾海水的用量均為100毫升，步驟 (4)中所述飽和蔗糖溶液用量為100毫升。
[0020] 本發明船舶壓載艙沉積物中活體細胞的分離方法與現有技術不同之處在于：
[0021] 本發明船舶壓載艙沉積物中活體細胞的分離方法能夠從船舶壓載艙沉積物中快 速分離活體細胞，步驟簡單，可以實現分離快速，所分離的活體細胞樣品可用于出入境檢驗 檢疫工作中外來入侵生物的分子生物學物種鑒定。
[0022] 本發明船舶壓載艙沉積物中活體細胞的分離方法步驟（2)中采用0. 45微米濾膜 過濾后海水沖洗是為了去除自然海水中大于〇. 45微米的活體細胞，防止外來污染；采用第 一篩絹過濾目的是去除大于200-250微米的雜質；步驟（3)中殘留物是指直徑介于30-50 微米到200-250微米之間，包括活體細胞、泥沙顆粒等雜質；步驟（4)中濃度為200-220克 蔗糖/100毫升蒸餾水的飽和蔗糖溶液分離效果好，并且不會將活體細胞擠壓變形；此步驟 中篩絹上殘留物包括活體細胞、泥沙顆粒等雜質，這一步驟主要是將殘留物混合到飽和蔗 糖溶液；步驟（5)中離心主要去除泥沙顆粒等雜質，上清液里主要是活體細胞，底部沉淀是 泥沙顆粒等雜質；步驟￠)中過篩絹的目的是分離活體細胞和液體。
【具體實施方式】
[0023] 實施例1
[0024] 對停靠在煙臺芝罘港的船舶壓載艙沉積物樣品進行活體細胞的快速分離的方法， 包括如下步驟：
[0025] (1)米集船舶壓載艙沉積物，取5克沉積物放置于培養皿內；
[0026] (2)用100毫升0. 45微米過濾海水沖洗沉積物，采用200微米孔徑的第一篩絹過 濾，用塑料瓶保存沖洗過濾后的液體；
[0027] (3)將塑料瓶中保存的液體采用50微米孔徑的第二篩絹過濾，保留第二篩絹上的 殘留物；
[0028] (4)用100毫升濃度為200-220克蔗糖/100毫升蒸餾水的飽和蔗糖溶液沖洗第二 篩絹上的殘留物至離心管中；
[0029] (5)將所述離心管在臺式離心機上lOOOrpm條件下離心3分鐘；
[0030] (6)吸取所述離心管的所有上清液，上清液采用50微米孔徑的第三篩絹過濾，保 留所述第三篩絹上的殘留物；
[0031] (7)用100毫升0. 45微米濾膜過濾后的過濾海水漂洗第三篩絹上的殘留物至培養 皿中，實現分離，在顯微鏡下觀察活體細胞。
[0032] 實施例2
[0033] 對停靠在煙臺龍口港的船舶壓載艙沉積物樣品進行活體細胞的快速分離，包括如 下步驟：
[0034] (1)米集船舶壓載艙沉積物，取5克沉積物放置于培養皿內；
[0035] (2)用100毫升0. 45微米過濾海水沖洗沉積物，采用200微米孔徑的第一篩絹過 濾，用塑料瓶保存沖洗過濾后的液體；
[0036] (3)將塑料瓶中保存的液體采用40微米孔徑的第二篩絹過濾，保留第二篩絹上的 殘留物；
[0037] (4)用100毫升濃度為200-220克蔗糖/100毫升蒸餾水的飽和蔗糖溶液沖洗第二 篩絹上的殘留物至離心管中；
[0038] (5)將所述離心管在臺式離心機上1200rpm條件下離心5分鐘；
[0039] (6)吸取所述離心管的所有上清液，上清液采用40微米孔徑的第三篩絹過濾，保 留所述第三篩絹上的殘留物；
[0040] (7)用100毫升0. 45微米濾膜過濾后的過濾海水漂洗第三篩絹上的殘留物至培養 皿中，實現分離，在顯微鏡下觀察活體細胞。
[0041] 實施例3
[0042] 對停靠在東營港的船舶壓載艙沉積物樣品進行活體細胞的快速分離，包括如下步 驟：
[0043] (1)米集船舶壓載艙沉積物，取5克沉積物放置于培養皿內；
[0044] (2)用100毫升0. 45微米過濾海水沖洗沉積物，采用250微米孔徑的第一篩絹過 濾，用塑料瓶保存沖洗過濾后的液體；
[0045] (3)將塑料瓶中保存的液體采用30微米孔徑的第二篩絹過濾，保留第二篩絹上的 殘留物；
[0046] (4)用100毫升濃度為200-220克蔗糖/100毫升蒸餾水的飽和蔗糖溶液沖洗第二 篩絹上的殘留物至離心管中；
[0047] (5)將所述離心管在臺式離心機上1200rpm條件下離心3分鐘；
[0048] (6)吸取所述離心管的所有上清液，上清液采用30微米孔徑的第三篩絹過濾，保 留所述第三篩絹上的殘留物；
[0049] (7)用100毫升0. 45微米濾膜過濾后的過濾海水漂洗第三篩絹上的殘留物至培養 皿中，實現分離，在顯微鏡下觀察活體細胞。
[0050] 以上所述的實施例僅僅是對本發明的優選實施方式進行描述，并非對本發明的范 圍進行限定，在不脫離本發明設計精神的前提下，本領域普通技術人員對本發明的技術方 案作出的各種變形和改進，均應落入本發明權利要求書確定的保護范圍內。
【權利要求】
1. 一種船舶壓載艙沉積物中活體細胞的分離方法，其特征在于：包括如下步驟： (1) 采集船舶壓載艙的沉積物，置于培養皿內； (2) 用過濾海水沖洗沉積物，并采用第一篩絹過濾，保存沖洗后的液體； (3) 將保存的液體采用第二篩絹過濾，保留所述第二篩絹上的殘留物； (4) 用飽和蔗糖溶液沖洗所述第二篩絹上的殘留物至離心管； (5) 將所述離心管離心； (6) 吸取所述離心管的所有上清液，采用第三篩絹過濾，保留所述第三篩絹上的殘留 物； (7) 用過濾海水漂洗所述第三篩絹上的殘留物至培養皿中，實現活體細胞的分離，在顯 微鏡下觀察活體細胞。
2. 根據權利要求1所述的船舶壓載艙沉積物中活體細胞的分離方法，其特征在于：所 述第一篩絹的孔徑為200?250微米，所述第二篩絹和所述第三篩絹的孔徑為30?50微 米。
3. 根據權利要求2所述的船舶壓載艙沉積物中活體細胞的分離方法，其特征在于：步 驟（4)中所述飽和蔗糖溶液的濃度為200-220克蔗糖/100毫升蒸餾水。
4. 根據權利要求3所述的船舶壓載艙沉積物中活體細胞的分離方法，其特征在于：步 驟（5)中的所述離心采用臺式離心機，轉速為1000-1200rpm，離心時間為3-5分鐘。
5. 根據權利要求4所述的船舶壓載艙沉積物中活體細胞的分離方法，其特征在于：所 述步驟（2)和（7)中的過濾海水為0. 15微米濾膜過濾后的海水。
6. 根據權利要求1所述的船舶壓載艙沉積物中活體細胞的分離方法，其特征在于：步 驟（1)中稱取5克所述沉積物置于培養皿內，步驟（2)和步驟（7)中的過濾海水的用量均 為100暈升，步驟（4)中所述飽和鹿糖溶液用量為100暈升。
【文檔編號】C12N5/07GK104140947SQ201410395277
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2014年8月12日 優先權日:2014年5月19日
【發明者】黃強 申請人:山東恒誠檢測科技有限公司