與番茄雄性不育基因緊密連鎖的srap分子標記及其獲得方法
【專利摘要】本發明公開了與番茄雄性不育基因緊密連鎖的SRAP分子標記及其獲得方法，以番茄紫莖可育87-5為父本，苗期綠莖雄性不育型番茄為母本，雜交產生F1代，自交構建F2分離群體。用集群分離分析法對雄性不育基因ms進行了SRAP標記分析，通過SRAP前、后引物的隨機組合，選取了544對引物組合在雄性不育、可育池間篩選，標記為C10B9_1、C10B9_4在兩DNA池間表現為多態性。利用這兩個標記對F2分離群體進行SRAP標記驗證，通過連鎖分析發現，C10B9_1、C10B9_4與不育基因ms的連鎖距離分別為3.3cM和-3.3cM。利用此分子標記可以進行番茄雄性不育輔助選育，縮短轉育周期，提高轉育效率，可省去轉育過程中每代需自交鑒定其不育性的繁瑣程序，將傳統的表現型選擇轉化為基因型選擇，提高選擇的準確性和科學性。
【專利說明】與番茄雄性不育基因緊密連鎖的SRAP分子標記及其獲得 方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于農業生物【技術領域】，特別是涉及一種與番茄雄性不育基因緊密連鎖的 SRAP分子標記及其獲得方法。
【背景技術】
[0002] 番爺（Solanum lycopersicum L.)是一種在全世界栽培極為廣泛的蔬菜，也是我 國的主要栽培蔬菜之一，其既可鮮食，也可加工成不同類型的番茄制品。雜種優勢是生物界 的普遍現象，是改良作物、大幅度提高產量的重要途徑。番茄是自花授粉作物，雜種優勢十 分明顯，雜交種比普通品種增產20-30%以上，且整齊度高，抗逆性強，當前番茄生產上大面 積推廣的雜交種全部使用雜交制種，仍然以人工去雄為主，制種成本過高已成為番茄雜種 優勢利用的主要限制因素之一。
[0003] 雄性不育系在蔬菜雜交制種上的應用為番茄雜交種子生產提供了新思路，由于目 前番茄雄性不育系在利用上尚存在一定困難，在利用雄性不育系進行育種時，其后代可育 株與不育株發生分離。利用早期的標記性狀，在幼苗時期根據標記性狀來鑒別不育株和可 育株，解決了原來兩用系只有在開花時，才能鑒別可育株的問題。而一般的不育系其商品性 狀較差，所以在實際應用中需將雄性不育基因進行轉育。但是普通的不育系轉育周期很長， 要通過雜交、自交各重復多代才可能轉育成一個優良的雄性不育系。如何在早期有效地鑒 定可育株與不育株，將直接影響其應用價值。
[0004] 隨著分子生物學理論和技術的發展，番茄雄性不育的研究已經從細胞學、形態學、 生物化學逐漸轉向了分子生物學。目前利用形態學標記或分子學標記，已經基本將各種不 同類型的番茄雄性不育基因定位到了各條染色體上。目前較為成功的方法是利用基因工 程，將雄性不育基因與抗除草劑基因緊密連鎖，使不育株具有抗除草劑的能力，進而可通過 在苗期噴施除草劑殺死可育株，而不育株不受影響，從而使不育株保持下來。
【發明內容】
[0005] 本發明的目在于：用集群分離分析法（BSA)對雄性不育基因 ms進行SRAP標記分 析，以期找到與雄性不育基因 ms緊密連鎖的SRAP標記，應用于分子標記輔助選擇育種實 踐，省去轉育過程中每代需自交鑒定其不育性的繁瑣程序，縮短轉育周期，提高轉育效率。 同時將傳統的表現型選擇轉化為基因型選擇，提高選擇的準確性和科學性。簡單講就是通 過番茄紫莖可育、綠莖雄性不育番茄品系，用集群分離分析法（BSA)對雄性不育基因 ms進 行了 SRAP標記分析，找到與番茄雄性不育基因 ms緊密連鎖的分子標記，實現利用此分子標 記有效的進行番茄雄性不育輔助選育。
[0006] 本發明通過以下技術方案實現的：與番茄雄性不育基因緊密連鎖的SRAP分子標 記，所述SRAP分子標記為C10B9_1和C10B9_4,其引物組合相同，均為C10B9,引物序列如 下 ：C10B9組合上游引物C10:為5'-TGAGTCCAAACCGGCAT-'3，其核苷酸序列如SEQIDN0.1 所示；下游引物B9 :5' -GACTGCGTACGAATTCAG-' 3,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0007] 所述的SRAP分子標記C10B9_1和C10B9_4與番茄雄性不育基因 ms的連鎖距離分 別為 3. 3cM、-3. 3cM。
[0008] 與番茄雄性不育基因緊密連鎖的SRAP分子標記的獲得方法，所述的獲得方法包 括以下步驟： (1) 確定以紫莖可育自交品系87-5番茄為父本，以綠莖雄性不育型番茄為母本，所述 的綠莖雄性不育型番茄中雄性不育基因與一個苗期綠莖基因緊密連鎖；將苗期綠莖雄性不 育型番茄與苗期紫莖可育自交系87-5番茄雜交產生F1代，F1代自交產生F2分離群體，然 后提取每個F2單株的基因組DNA，備用； (2) 從步驟（1)F2分離群體中通過集群分析分離法選取10株綠莖不育株，提取每株的 基因組DNA，將每株基因組DNA等量混合，建成不育基因池；再取10株紫莖可育株，提取每 株的基因組DNA，將每株基因組DNA等量混合，建成可育基因池；然后，利用SRAP分子標記 引物組合，通過PCR擴增后的產物在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，篩選出在可育與不育 池之間具有擴增多態性的SRAP分子標記引物組合1對，即C10B9 ;且C10B9引物組合在可 育與不育池之間產生的擴增多態性標記為2個，分別編號為C10B9_1和C10B9_4 ; (3) 利用步驟（2)中已獲得的2個具有多態性位點標記，通過PCR擴增及凝膠電泳，對 60株F2分離群體進行遺傳分析，獲得遺傳鑒定結果； (4) 對60株F2分離群體的遺傳鑒定結果進行連鎖分析，以3. 0為L0D閥值，確定與不 育基因 ms連鎖的SRAP分子標記為C10B9_1、C10B9_4,其連鎖距離分別為3. 3cM、-3. 3cM。
[0009] 所述的SRAP分子標記引物為市售的引物。
[0010] 詳細說明：（1)上述方法中所選擇的不育母本是由栽培種突變而來的，所以其遺 傳背景與栽培種父本十分相似，對研究單位點的功能基因非常有效，可非常有效地避免假 陽性位點的出現。一旦篩選出多態性標記位點，均可用于位點基因的連鎖作圖，且其遺傳距 離也比較理想。另外，由于母本的不育基因與苗期綠莖基因緊密連鎖，大大簡化了此雄性 不育基因在實際生產中的有效利用（李會遠，吉林蔬菜，2005"6):36)。（2)集群分析分離 法：是指根據 Michelmortal (Michelmore R W，Proc Natl Acad Sci，1991，88:9829_9832) 提出的，簡稱BSA(Bulk Segregate Anallysis)法。（3)SRAP分子標記的引物序列采用（Li G, Theor Appl Genet,2003,107:168-180 ：Li G, Theor Appl Genet, 2001, 103:455-461 ： 雷劍，中國馬鈴薯，2006, 20 (3) :150-153 :Budak，Theor Appl Genet, 2004,108:328-334: 王剛，中國科學邏輯生命科學，2004, 34 (6) :510-516 :Riaz，Plant Breeding，2001， 120:411-415)等已發表的引物，并且在市面上可以購買到的，將SRAP上游引物和下游引物 的隨機組合，共選取了 544對引物組合，其中有1對引物組合C10B9在兩DNA池間擴增效果 良好，并產生了 2個多態性標記，分別編號為C10B9_1和C10B9_4。利用多態性標記C10B9_1 和C10B9_4，通過PCR擴增及凝膠電泳，對60株F2分離群體進行遺傳分析，獲得遺傳鑒定 結果。（4)應用JoinMap4. 0軟件將其對60株F2群體的遺傳鑒定結果進行連鎖分析，以 3. 0為L0D閥值，確定與不育基因 ms連鎖的分子標記為C10B9_1及C10B9_4 ;已獲得的與不 育基因 ms連鎖具有多態性的2個特異性標記C10B9_1和C10B9_4,其引物組合相同，均為 C10B9,所述的多態性SRAP分子標記，其引物序列為：SRAP引物C10B9組合上游引物C10為 5' TGAGTCCAAACCGGCAT' 3,下游引物為 B9 為 5' GACTGCGTACGAATTCAG' 3。雄性不育基因 ms 連 鎖的分子標記C10B9_1、C10B9_4。其與不育基因 ms的連鎖距離分別為3. 3cM、-3. 3cM。 toon] 發明的有益效果：利用一個與苗期綠莖基因緊密連鎖的花粉敗育型材料，通過與 紫莖可育系雜交產生F2代分離群體。采用BSA選擇雄性不育單株和雄性可育單株構建不 育、可育DNA池。篩選SRAP引物，找到與雄性不育基因緊密連鎖的分子標記。利用此分子標 記進行輔助選育，可省去轉育過程中每代需自交鑒定其不育性的繁瑣程序，縮短轉育周期， 提高轉育效率。將傳統的表現型選擇轉化為基因型選擇，提高選擇的準確性和科學性。同 時利用苗期有綠莖標記性狀的番茄雄性不育系不僅可以保證番茄種子生產的純度，而且節 省勞動力，降低成本，提高工作效率。另外在育苗前期拔除可育株的工作由育種單位自己完 成，把完全拔除可育株的綠莖不育植株發給制種單位，由制種單位來完成接下來的工作能 有效的防止親本的流失，有利于雜交新品種的保護，應用與推廣意義重大。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012] 下面結合附圖對本發明作進一步的說明。
[0013] 圖1.部分SRAP引物在不育、可育池的篩選； 圖2. SRAP引物組合C10B9_1、C10B9_4在F2分離群體中擴增的部分結果； 圖3.不育基因的分子連鎖圖。
【具體實施方式】
[0014] 下面舉實施例說明本發明，但是，本發明并不限于下述的實施例。
[0015] 實施例1、與番茄雄性不育基因緊密連鎖的SRAP分子標記，所述SRAP分子標記為 C10B9_1和C10B9_4,其引物組合相同，均為C10B9,引物序列如下： C10B9組合上游引物C10 :為5' - TGAGTCCAAACCGGCAT-' 3，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；下游引物B9 :5' -GACTGCGTACGAATTCAG-' 3,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0016] 所述的SRAP分子標記C10B9_1和C10B9_4與番茄雄性不育基因 ms的連鎖距離分 別為 3. 3cM、-3. 3cM。
[0017] 實施例2、與番茄雄性不育基因緊密連鎖的SRAP分子標記的獲得方法，所述的獲 得方法包括以下步驟： (1) 確定以紫莖可育自交品系87-5番茄為父本，以綠莖雄性不育型番茄為母本，所述 的綠莖雄性不育型番茄中雄性不育基因與一個苗期綠莖基因緊密連鎖；將苗期綠莖雄性不 育型番茄與苗期紫莖可育自交系87-5番茄雜交產生F1代，F1代自交產生F2分離群體，然 后提取每個F2單株的基因組DNA，備用； (2) 從步驟（1)F2分離群體中通過集群分析分離法選取10株綠莖不育株，提取每株的 基因組DNA，將每株基因組DNA等量混合，建成不育基因池；再取10株紫莖可育株，提取每 株的基因組DNA，將每株基因組DNA等量混合，建成可育基因池；然后，利用SRAP分子標記 引物組合，通過PCR擴增后的產物在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，篩選出在可育與不育 池之間具有擴增多態性的SRAP分子標記引物組合1對，即C10B9 ;且C10B9引物組合在可 育與不育池之間產生的擴增多態性標記為2個，分別編號為C10B9_1和C10B9_4 ; (3) 利用步驟（2)中已獲得的2個具有多態性位點標記，通過PCR擴增及凝膠電泳，對 60株F2分離群體進行遺傳分析，獲得遺傳鑒定結果； (4)對60株F2分離群體的遺傳鑒定結果進行連鎖分析，以3. 0為LOD閥值，確定與不 育基因 ms連鎖的SRAP分子標記為C10B9_1、C10B9_4,其連鎖距離分別為3. 3cM、-3. 3cM。
[0018] 所述的SRAP分子標記引物為市售的引物。
[0019] 實踐操作中，具體實驗的設備和材料有：PCR儀選用英國TECHNE TC-512熱循環 儀；引物由上海生物工程責任有限公司提供；Taq酶采用上海生工Promega進口分裝；緩沖 液采用上海生工Promega進口分裝；dNTPs中dATP，dCTP，dGTP，dTTP各取10mM組成混合液 均購于大連寶生物責任有限公司和Promega進口原裝；其他試劑購于上海生工生物工程股 份有限公司。
[0020] PCR產物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。聚丙烯酰胺凝膠溶液的配制見表1。凝 膠大小為185 X 105 X 1mm，電泳緩沖液采用0. 5 X TBE，點樣量通常為3. 5 μ L (10 μ L PCR產 物中加入6yL上樣Buffer)。通常以160V電壓電泳2. 5h(個別引物適當延長電泳時間）。 電泳儀和電泳槽分別使用北京君意東方電泳設備有限公司的JY600C電泳儀和北京市六一 儀器廠的DYCZ-30電泳槽。
[0021] 表1. 8%聚丙烯酰胺凝膠配方
【權利要求】
1. 與番茄雄性不育基因緊密連鎖的SRAP分子標記，其特征在于：所述SRAP分子標記 為C10B9_1和C10B9_4,其引物組合相同，均為C10B9,引物序列如下： C10B9組合上游引物CIO :為5' - TGAGTCCAAACCGGCAT- ' 3,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；下游引物B9 :5' -GACTGCGTACGAATTCAG 3,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所 /_J、1 ο
2. 根據權利要求1所述的與番茄雄性不育基因緊密連鎖的SRAP分子標記，其特征在 于：所述的SRAP分子標記C10B9_1和C10B9_4與番茄雄性不育基因 ms的連鎖距離分別為 3. 3cM、_3. 3cM〇
3. 與番茄雄性不育基因緊密連鎖的SRAP分子標記的獲得方法，其特征在于：所述的獲 得方法包括以下步驟： (1) 確定以紫莖可育自交品系87-5番茄為父本，以綠莖雄性不育型番茄為母本，所述 的綠莖雄性不育型番茄中雄性不育基因與一個苗期綠莖基因緊密連鎖；將苗期綠莖雄性不 育型番茄與苗期紫莖可育自交系87-5番茄雜交產生F1代，F1代自交產生F2分離群體，然 后提取每個F2單株的基因組DNA，備用； (2) 從步驟（1) F2分離群體中通過集群分析分離法選取10株綠莖不育株，提取每株的 基因組DNA，將每株基因組DNA等量混合，建成不育基因池；再取10株紫莖可育株，提取每 株的基因組DNA，將每株基因組DNA等量混合，建成可育基因池；然后，利用SRAP分子標記 引物組合，通過PCR擴增后的產物在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，篩選出在可育與不育 池之間具有擴增多態性的SRAP分子標記引物組合1對，即C10B9 ;且C10B9引物組合在可 育與不育池之間產生的擴增多態性標記為2個，分別編號為C10B9_1和C10B9_4 ; (3) 利用步驟（2)中已獲得的2個具有多態性位點標記，通過PCR擴增及凝膠電泳，對 60株F2分離群體進行遺傳分析，獲得遺傳鑒定結果； (4) 對60株F2分離群體的遺傳鑒定結果進行連鎖分析，以3.0為L0D閥值，確定與 不育基因ms連鎖的SRAP分子標記為C10B9_1、C10B9_4,其連鎖距離分別為3. 3cM、-3. 3cM。
4. 根據權利要求3所述的與番茄雄性不育基因緊密連鎖的SRAP分子標記的獲得方法， 其特征在于：所述的SRAP分子標記引物為市售的引物。
【文檔編號】C12N15/11GK104120126SQ201410395154
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年8月12日 優先權日:2014年8月12日
【發明者】王強, 楊濤, 李寧, 唐亞萍, 王柏柯, 楊生保, 帕提古麗·艾斯木托拉, 余慶輝 申請人:新疆農業科學院園藝作物研究所