一種d-阿拉伯糖醇高產酵母突變菌株的篩選方法
【專利摘要】本發明提供一種D-阿拉伯糖醇高產酵母突變菌株的篩選方法,主要以利用低能N+離子注入技術對乳酸克魯維酵母進行誘變而獲得的突變菌株為篩選對象,建立了高糖固體培養基初篩,紙色譜法和高效液相色譜法組合使用進行復篩的高通量篩選方法。該方法具有篩選效率高、成本低、篩選周期短、易于操作等優點,為高效篩選經低能離子注入改造酵母所得D-阿拉伯糖醇高產菌株提供了新方法。
【專利說明】一種D-阿拉伯糖醇高產酵母突變菌株的篩選方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于離子束【技術領域】,具體涉及一種D-阿拉伯糖醇高產酵母突變菌株的篩選方法。
【背景技術】
[0002]D-阿拉伯糖醇是一種五碳糖醇,分子式為C5H12O5,分子量為152.12,是木糖醇和核糖醇的同分異構體。糖醇是經糖還原的一類多元醇,具有低熱值、抗齲齒、不影響胰島素水平等優點,在醫藥、食品、化工等領域具有重要的應用價值。目前,常規生產D-阿拉伯糖醇的方法主要是化學法合成,但是該方法反應過程復雜、設備要求高、環境污染嚴重。針對化學合成法的缺點,人們將目光集中于通過生物轉化法生產D-阿拉伯糖醇,其反應條件溫和、生產工藝簡單,因而備受關注。
[0003]Spencer等人研究發現耐高滲酵母在高滲條件下可產生多元醇,代謝葡萄糖產生的多元醇主要有甘油、D-阿拉伯糖醇、赤醉糖醇等,其中五碳多元醇以D-阿拉伯糖醇為主,截止目前可用于生產D-阿拉伯糖醇的菌株,主要包括曲霉菌屬(Aspergillus)、假絲酵母屬(Candida)、德巴利氏酵母屬(Debaryomyces)、擬內袍霉屬(EndomycoPsis)、小叢梗袍屬(Moniliella)、漢遜酵母屬(Hansenula)、畢赤母屬(Pichia)、接合酵母屬(Zygosaccharomyces)。但是,大部分產D-阿拉伯糖醇的酵母菌株對底物葡萄糖的轉化率較低,多數酵母菌株的轉化葡萄糖產D-阿拉伯糖醇的底物葡萄糖的轉化率介于10%~40%之間,并且普遍存在甘油及其他多元醇副產物。乳酸克魯維酵母是一種能夠以乳酸作為其唯一的碳源和能源的酵母,具有營養要求簡單、生長旺盛、生物量大、生長溫度適應范圍廣(25~46°C )、分泌蛋白能力強、不產生內毒素、對人類安全等優點,因此長期以來一直被用于發酵工業。
[0004]低能離子N+注入技術作為一種新的誘變源,目前在國內微生物育種中取得顯著成效,其原因在于低能離子注入生物體時同時存在能量交換、能量沉積、質量沉積及電荷交換四大效應。由于注入離子的電荷數、質量數、能量和劑量的組合不同,可以提供眾多的誘變條件,使離子注入誘變具有突變譜寬,突變率高的特點,從而可以篩選到符合生產要求、提高產量的突變體。然而低能N+離子注入技術轉化的隨機性較大,建立一種高通量的快速篩選方法尤為重要。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一種D-阿拉伯糖醇高產酵母突變菌株的篩選方法。
[0006]為達到上述目的,本發明采用了以下技術方案:
[0007]I)初篩:將經過誘變的出發酵母菌株接種于YPD液體培養基中,然后于28~370C >160~200r/min下振蕩培養24~28h得預培養液,將預培養液涂布于高糖固體培養基上,然后于28~37°C恒溫培養48~60h,所述高糖固體培養基含有500~550g/L的葡萄糖;
[0008]2)復篩:經過恒溫培養后,挑取生長于高糖固體培養基上的單菌落并接種于YPD液體培養基中,然后于28~37°C、160~200r/min下振蕩培養24~28h得種子培養液,將種子培養液接種于YPD發酵培養基中,然后于160~200r/min、28~37°C下振蕩培養96~144h得發酵液,將發酵液離心,將離心得到的上清液用紙色譜法進行分析,根據紙色譜上D-阿拉伯糖醇對應的顯色斑點篩選D-阿拉伯糖醇產量較高的突變菌株。
[0009]利用低能離子注入技術對出發酵母菌株進行誘變。
[0010]所述出發酵母菌株為乳酸克魯維酵母。
[0011]所述誘變具體包括以下步驟:
[0012]a)挑取出發酵母菌株單菌落接種于YPD液體培養基中,然后于28~37°C、160~200r/min下振蕩培養18~24h得菌液;
[0013]b)用無菌水將菌液稀釋至0.5~1.0 X 107CFU/mL得菌體稀釋液,將100~150 μ L菌體稀釋液均勻涂布于無菌平皿中央,然后用無菌風吹干得菌膜;
[0014]c)將菌膜置于離子注入機的無菌靶臺上,并按以下條件對菌膜進行低能離子注入:注入離子為N+,注入劑量為1.5 X 115~2.5X10161ns/cm2,注入能量為15~25KeV,脈沖時間為5~10s,間隔時間為5~10s,真空度為1.5~2.0XlO^4Pa0
[0015]所述高糖固體培養基的組成包括500.0g/L的葡萄糖、20.0g/L的蛋白胨、10.0g/L的酵母膏以及20.0g/L的瓊脂。
[0016]所述YPD發酵培養基的組成包括200.0g/L的葡萄糖、20.0g/L的蛋白胨以及10.0g/L的酵母膏。
[0017]所述紙色譜法采用的展開劑為正丁醇、吡啶與水的混合物,正丁醇:吡啶:水的體積比為14:3:3 ;紙色譜法采用的顯色劑是飽和硝酸銀-丙酮溶液和飽和氫氧化鈉-無水乙醇溶液,飽和硝酸銀-丙酮溶液的制備方法為:將0.1mL飽和硝酸銀水溶液加入到40mL丙酮中得混合物,向混合物中加入ImL水后通過攪拌使結晶析出的硝酸銀完全溶解,飽和氫氧化鈉-無水乙醇溶液的制備方法為:將1mL飽和氫氧化鈉水溶液與520mL無水乙醇混合;紙色譜法采用的標準品為質量濃度30g/L的葡萄糖水溶液、質量濃度30g/L的D-阿拉伯糖醇水溶液和質量濃度30g/L的甘油水溶液的等體積混合液。
[0018]所述篩選方法還包括以下步驟:
[0019]驗證:利用高效液相色譜對D-阿拉伯糖醇產量較高的突變菌株的發酵液進行分析。
[0020]本發明的有益效果體現在:
[0021]本發明以利用低能離子(N+)注入技術對出發酵母菌株(乳酸克魯維酵母)進行誘變而獲得的突變菌株為篩選對象,建立了高糖培養基初篩,紙色譜法復篩的高通量篩選方法。
[0022] 本發明對利用的低能離子注入技術的條件進行了大量的實驗摸索,所確定的注入劑量等條件可以保證穩定的篩選效率。本發明對標準品的組成和顯色劑進行了優化,可以加快篩選速度,提高篩選結果的可靠性。本發明通過整合高糖培養基初篩的高效性,紙色譜法復篩的簡便性和高效液相色譜法驗證的高準確性而建立的高通量快速篩選方法可以保證穩定的篩選效率。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]圖1為高產菌株的傳代穩定性試驗。
【具體實施方式】
[0024]下面結合附圖和實施例對本發明作詳細說明。
[0025](一 )培養基
[0026]高糖固體培養基的組成為:葡萄糖500.0g/L,蛋白胨20.0g/L,酵母膏10.0g/L,瓊脂 20.0g/L, pH 為 6.5 ;
[0027]YPD液體培養基的組成為:葡萄糖20.0g/L,蛋白胨20.0g/L,酵母膏10.0g/L, pH為 6.5 ;
[0028]YPD發酵培養基的組成為:葡萄糖200.0g/L,蛋白胨20.0g/L,酵母膏10.0g/L, pH為 6.5。
[0029]斜面培養基的組成為:葡萄糖20.0g/L,蛋白胨20.0g/L,酵母膏10.0g/L,瓊脂20g/L,pH 為 6.5 ;
[0030](二)篩選所依據的方法
[0031](I)耐高糖實驗:將經低能離子注入的出發菌株接種于高糖固體培養基上,于37 °C恒溫培養48h,觀察菌體生長情況。
[0032](2)紙色譜法復篩:分別將5 μ L上清液(發酵液離心)和標準品在層析濾紙上點樣,在展開劑正丁醇-吡啶-水(V/V/V, 14:3:3)中層析24h(室溫),晾干后用顯色劑(①取0.1mL飽和硝酸銀溶液加入到40mL丙酮中,然后逐滴加ImL水攪拌使結晶析出的硝酸銀至完全溶解,配制成飽和硝酸銀-丙酮溶液,其中飽和硝酸銀溶液為質量濃度為2500g/L的硝酸銀水溶液;②取1mL飽和氫氧化鈉溶液加入到520mL無水乙醇中,配制成飽和氫氧化鈉-無水乙醇溶液,其中飽和氫氧化鈉溶液為質量濃度為530g/L的氫氧化鈉水溶液)顯色,顯色步驟為:于室溫下向晾干后的濾紙上先噴灑一層飽和硝酸銀-丙酮溶液,待濾紙自然干燥后,再向濾紙上噴灑一層飽和氫氧化鈉-無水乙醇溶液,標準品為以下三種溶液的等體積混合液:質量濃度30g/L的葡萄糖水溶液、質量濃度30g/L的D-阿拉伯糖醇水溶液和質量濃度30g/L的甘油水溶液。標準品中葡萄糖、D-阿拉伯糖醇以及甘油在濾紙上的位置順序為:下面為葡萄糖,中間為D-阿拉伯糖醇,上面為甘油,觀察D-阿拉伯糖醇對應位置上的斑點大小。
[0033](3)高效液相色譜驗證:檢測發酵液中胞外D-阿拉伯糖醇含量。色譜柱=SHlOll ;流動相:0.01mol/L H2SO4 ;流速:0.8mL/min ;進樣量:5 μ L ;柱溫:50°C ;檢測器:示差檢測器(RID)。
[0034](三)突變菌株的構建
[0035]用低能N+離子注入技術對乳酸克魯維酵母進行誘變,構建D-阿拉伯糖醇高產工程菌。
[0036](I)菌懸液的制備
[0037]將本實驗室保藏的乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis, ATCC12426,購自中國工業微生物菌種保藏管理中心)作為出發菌株,出發菌株于斜面培養基上劃線,置于37°C恒溫培養24h后,挑取單菌落接種到YPD液體培養基中,于37°C、160r/min振蕩培養18h得菌液。
[0038](2)菌膜制備
[0039]用無菌水將菌液稀釋至1.0X 107CFU/mL得菌體稀釋液,取100 μ L菌體稀釋液均勻涂布于無菌平皿中央,用無菌風吹干制成菌膜。
[0040](3)低能離子注入最佳參數
[0041]在能量為20KeV、脈沖時間為5s、間隔時間為10s,真空度為1.5 X KT4Pa條件下,用不同劑量(0X1014、15X1014、35X1014、55X1014、75X1014、95X1014、115X1014、135X10141ns/cm2)對乳酸克魯維酵母進行誘變處理,結合低能離子對細胞的致死率情況,繪出致死率和注入劑量的曲線,致死率隨著注入劑量增加呈先增大后降低再增大的“馬鞍”型曲線,獲得最佳誘變注入參數為:能量為20KeV、脈沖時間為5s、間隔時間為10s,真空度為 1.5Xl(T4Pa,注入劑量為 75X10141ns/cm2。
[0042](4)低能離子注入菌膜
[0043]將帶有所述菌膜的無菌平皿置于離子注入機的無菌靶臺上,用能量為20keV、注入劑量為75X10141ns/cm2、脈沖時間為5s、間隔時間為10s、真空度為1.5X 10_4Pa,進行低能離子注入。
[0044](四)突變菌株篩選流程
[0045]將經低能離子注入后的乳酸克魯維酵母接種于高糖固體培養基上進行初步篩選;將初篩得到的菌株進一步進行YPD液體發酵培養,利用紙色譜法和液相色譜法分析發酵所得發酵液,從而對突變菌株進一步篩選鑒定。所述發酵培養包括以下步驟:轉接到Yro發酵培養基,于28~37°C、轉速為160~200r/min條件下培養96~144h。
[0046]具體說明如下:
[0047](I)預培養
[0048]經過上述步驟(4)低能離子注入菌膜后,用2mL YPD液體培養基浸泡菌膜,37°C溫育2h,用無菌玻璃刮鏟洗脫平皿上的菌膜,獲得洗脫液;未注入的對照菌膜也作同樣處理。用移液槍將洗脫液轉移至裝有5mL YPD液體培養基的試管中,于37°C、160r/min振蕩培養24h得預培養菌液。
[0049](2)高糖固體培養基初篩結果
[0050]將所得預培養菌液涂布于高糖固體培養基上,于37°C恒溫培養48h后,挑取生長情況較好的菌落復篩。
[0051](3)紙色譜法初步復篩
[0052]從步驟(2)中生長情況較好的菌落中隨機挑選出50個較大單菌落分別接種于含5mL YPD液體培養基的試管中,并于37°C、160r/min下培養24h得種子培養液,以體積比為5%的接種量將種子培養液接種于含10mL YPD發酵培養基的250mL三角瓶中,然后于160r/min、37°C下培養96h,然后于10000r/min離心10min,用紙色譜法對離心得到的上清液進行分析。
[0053](4)高效液相色譜法確證
[0054]將步驟(3)得到的顯色斑點較大的5株菌株的發酵液濃縮(將發酵液在70°C恒溫濃縮至原體積的1/50)后用微孔濾膜過濾,用高效液相色譜法對其進行驗證。試驗結果表明顯色較大的斑點所對應的發酵液中D-阿拉伯糖醇含量較高,最高可達88.23g/L。
[0055](五)篩選方法的可重復性
[0056]本發明進行了多個(1000個批次)批次的出發菌株誘變處理(注入),然后分別對各個批次處理后的菌株進行初篩和復篩,經過統計,各個批次均可以從初步篩選中的30~50個克隆中篩選出5~6株高產菌株,發酵液中D-阿拉伯糖醇含量至少為81.35g/L。
[0057](六)突變菌株的遺傳穩定性
[0058]將篩選出來的突變菌株活化后接種于含200mLYPD液體培養基的三角瓶中進行培養(37°C、160r/min),傳代培養8代測定突變菌株的遺傳穩定性結果參見圖1。D-阿拉伯糖醇的產量略有波動,但變化不顯著,說明菌株遺傳穩定性高。
[0059] 本發明使用低能N+離子注入技術對乳酸克魯維酵母進行誘變,構建D-阿拉伯糖醇高產突變菌株。根據高產菌株有耐高滲的性質,建立了用高糖固體培養基初篩的方法。再結合紙色譜法和高效液相色譜法聯合使用進行組合復篩,根據紙層析顯色斑點的大小篩選得到較高產菌株,再利用高效液相色譜法對紙色譜法的篩選結果進一步進行驗證。實驗結果表明,本發明建立的高糖固體培養基進行初篩以及組合紙色譜法與高效液相色譜法聯用復篩的篩選方法具有篩選成本低,操作方便,能快速地從大批量誘變菌株中篩選出高產菌株。
【權利要求】
1.一種D-阿拉伯糖醇高產酵母突變菌株的篩選方法,其特征在于:該篩選方法包括以下步驟: 1)初篩:將經過誘變的出發酵母菌株接種于YPD液體培養基中,然后于28~37°C、160~200r/min下振蕩培養24~28h得預培養液,將預培養液涂布于高糖固體培養基上,然后于28~37°C恒溫培養48~60h,所述高糖固體培養基含有500~550g/L的葡萄糖; 2)復篩:經過恒溫培養后,挑取生長于高糖固體培養基上的單菌落并接種于YH)液體培養基中,然后于28~37°C、160~200r/min下振蕩培養24~28h得種子培養液,將種子培養液接種于YPD發酵培養基中,然后于160~200r/min、28~37°C下振蕩培養96~144h得發酵液,將發酵液離心,將離心得到的上清液用紙色譜法進行分析,根據紙色譜上D-阿拉伯糖醇對應的顯色斑點篩選D-阿拉伯糖醇產量較高的突變菌株。
2.根據權利要求1所述一種D-阿拉伯糖醇高產酵母突變菌株的篩選方法,其特征在于:利用低能離子注入技術對出發酵母菌株進行誘變。
3.根據權利要求2所述一種D-阿拉伯糖醇高產酵母突變菌株的篩選方法,其特征在于:所述出發酵母菌株為乳酸克魯維酵母。
4.根據權利要求2所述一種D-阿拉伯糖醇高產酵母突變菌株的篩選方法,其特征在于:所述誘變具體包括以下步驟: a)挑取出發酵母菌株單菌落接種于YPD液體培養基中,然后于28~37°C、160~200r/min下振蕩培養18~24h得菌液; b)用無菌水將菌液稀釋至0.5~1.0X 107CFU/mL得菌體稀釋液,將100~150 μ L菌體稀釋液均勻涂布于無菌平皿中央,然后用無菌風吹干得菌膜; c)將菌膜置于離子注入機的無菌靶臺上,并按以下條件對菌膜進行低能離子注入:注入離子為N+,注入劑量為1.5 X 115~2.5 X 10161ns/cm2,注入能量為15~25KeV,脈沖時間為5~10s,間隔時間為5~10s,真空度為1.5~2.0XlO^4Pa0
5.根據權利要求1所述一種D-阿拉伯糖醇高產酵母突變菌株的篩選方法,其特征在于:所述高糖固體培養基的組成包括500.0g/L的葡萄糖、20.0g/L的蛋白胨、10.0g/L的酵母膏以及20.0g/L的瓊脂。
6.根據權利要求1所述一種D-阿拉伯糖醇高產酵母突變菌株的篩選方法,其特征在于:所述Yro發酵培養基的組成包括200.0g/L的葡萄糖、20.0g/L的蛋白胨以及10.0g/L的酵母膏。
7.根據權利要求1所述一種D-阿拉伯糖醇高產酵母突變菌株的篩選方法,其特征在于:所述紙色譜法采用的展開劑為正丁醇、吡啶與水的混合物,正丁醇:吡啶:水的體積比為14:3:3 ;紙色譜法采用的顯色劑是飽和硝酸銀-丙酮溶液和飽和氫氧化鈉-無水乙醇溶液,飽和硝酸銀-丙酮溶液的制備方法為:將0.1mL飽和硝酸銀水溶液加入到40mL丙酮中得混合物,向混合物中加入ImL水后通過攪拌使結晶析出的硝酸銀完全溶解,飽和氫氧化鈉-無水乙醇溶液的制備方法為:將1mL飽和氫氧化鈉水溶液與520mL無水乙醇混合;紙色譜法采用的標準品為質量濃度30g/L的葡萄糖水溶液、質量濃度30g/L的D-阿拉伯糖醇水溶液和質量濃度30g/L的甘油水溶液的等體積混合液。
8.根據權利要求1所述一種D-阿拉伯糖醇高產酵母突變菌株的篩選方法,其特征在于:所述篩選方法還包括以下步驟:驗證:利用 高效液相色譜對D-阿拉伯糖醇產量較高的突變菌株的發酵液進行分析。
【文檔編號】C12N15/01GK104164415SQ201410387843
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年8月7日 優先權日:2014年8月7日
【發明者】錢衛東, 周穎欣, 王婷, 寧肖肖, 蔡長龍, 毛培宏 申請人:陜西科技大學