斜帶石斑魚ctrp9基因、編碼蛋白及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于基因工程【技術領域】，具體公開了一種斜帶石斑魚ctrp9基因、編碼蛋白及其應用。本發明首次克隆獲得斜帶石斑魚gctrp9基因，并將該基因構建表達載體和重組酵母菌株，利用重組酵母菌種在體外獲得大量表達的斜帶石斑魚gctrp9蛋白，該蛋白可以用于制備適合海水魚類使用的促生長劑或添加劑。
【專利說明】斜帶石斑魚基因、編碼蛋白及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程【技術領域】，具體涉及一種斜帶石斑魚基因、編碼蛋白 及其應用，所述應用為在制備促生長劑或飼料添加劑中的應用。
【背景技術】
[0002] 脂肪作為動物貯存能量的組織，在調節和控制機體的代謝中起著重要的作用，它 能分泌多種具有生物活性的細胞因子。在哺乳類動物中脂聯素（Adiponectin)是一種由脂 肪細胞分泌的細胞因子蛋白，主要參與調節葡萄糖水平和脂肪的降解，其次還包括抗炎、抗 動脈粥樣硬化、促血管形成因子和抗血管形成因子的特性。是與同源性 最近的CTRP家族的成員，由四個區域，第一個區域為信號肽；第二個區域為可變區；第三個 區域為膠原蛋白的相似區；最后一個區域為球狀區，也為功能區。最近研究表明，與 有相同的功能，參與調節葡萄糖水平和脂肪的降解，還有參與攝食、抗炎作用、 免疫反應的功能，并且有實驗證明CTRP9可能通過與結合，增加 AMPK/Akt/eNOS磷 酸化，增加血管活性。
[0003] 石斑魚屬鯧科，石斑魚屬（你，為暖水性的大中型海產 魚類。石斑魚營養豐富，肉質細嫩潔白，類似雞肉，素有"海雞肉"之稱。石斑魚又是一種低 脂肪、高蛋白的上等食用魚，被港澳地區推為我國四大名魚之一，是高檔筵席必備之佳肴。 目前石斑魚的飼料還是以動植物蛋白作為主要添加劑，然而動植物蛋白成本較高，如果能 夠提高石斑魚對糖脂的利用，對生產成本會有很大的降低，但目前在石斑魚人工養殖中還 沒有一種能有效促進糖脂利用的餌料添加劑。
【發明內容】
[0004] 為了克服上述現有技術的不足，本發明提供一種斜帶石斑魚基因，其核苷 酸序列如SEQ IDN0 :1所示。
[0005] 本發明的另一目的在于提供一種含有斜帶石斑魚狀基因的表達載體； 本發明的另一目的在于提供上述載體轉化的酵母菌株； 本發明的另一目的在于提供了利用上述酵母重組酵母菌株得到重組斜帶石斑魚 gCTRP9的方法。
[0006] 本發明的另一目的在于提供上述基因在制備魚苗苗種促生長劑或添加劑中的應 用。
[0007] 本發明克隆了斜帶石斑魚的基因，并得到了 3'UTR和部分5'UTR。克隆的方 法是常規的基因克隆方法，利用同源物種的基因比對設計簡并引物，經過PCR后得到中間 片段，然后根據中間片段的序列分別設計兩個5' RACE的下游引物和兩個3' RACE的上游引 物，在利用通用引物AAP和AUAP進行5 '和3 '嵌套PCR得到了 c 的0RF、5 ' UTR和3 ' UTR。 最后設計克隆0RF的引物，PCR后把得到目的基因連接到PCR2. 1載體為PCR2.
[0008] 本發明構建了含有斜帶石斑魚gCTRP9的畢赤酵母表達載體。這個載體的構建方 法是按常規方法，利用自己所構建的載體PCR2. 1- 為模板，通過PCR方法合成帶有酶 切接頭的斜帶石斑魚#基因，經酶切和分離純化后，接入到已有的載體pPICZaA的相 應酶切位點（即EcoRI-HF和Notl)之間，即構建成所需的含有斜帶石斑魚狀基因的表 達載體pPICZaA-
[0009] 本發明還用上述含有斜帶石斑魚gcir/W基因的相應表達載體構建了能高效表達 斜帶石斑魚#基因的酵母重組株。
[0010] 本發明的上述能表達斜帶石斑魚gCTRP9酵母重組菌株優先由含有斜帶石斑 魚％基因的表達載體pPICZaA- 轉化畢赤酵母X33而得到的菌株，命名為 pPICZaA- gctrp9~ X33〇
[0011] 本發明還提供了利用上述畢赤酵母重組株生產斜帶石斑魚gCTRP9的方法。先將 菌種接種在含有BMGY的液體培養基中，28°C，200轉/分培養18-24小時，然后離心收集菌 體并重懸菌體于BMMY液體培養基中，并加入吐溫-80,使其終濃度為0. 4%，28°C，200轉/ 分培養，18-24小時后向培養液中加入甲醇，使終濃度為0. 5%，然后28°C，200轉/分培養， 18-24小時后收集上清，經分離純化得到重組斜帶石斑魚gCTRP9產品 斜帶石斑魚具有重大的經濟價值，采用常規的基因工程技術，可利用本發明的石斑魚 gcir/W基因重組株pPICZaA- X33,生產重組斜帶石斑魚gCTRP9蛋白，并可進一步 用作制備適合海水魚類使用的促生長劑或添加劑。
[0012] 與現有技術相比，本發明具有以下有益效果： 本發明首次克隆獲得斜帶石斑魚#基因，并將該基因構建表達載體和重組酵母 菌株，利用重組酵母菌種在體外獲得大量表達的斜帶石斑魚gCTRP9蛋白，該蛋白可以用于 制備適合海水魚類使用的促生長劑或添加劑。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013] 圖1.以斜帶石斑魚肝臟的反轉錄CDNA為模板進行PCR擴增中間片段產物 的凝膠電泳分析圖，其中，M :Marker ;1 :PCR擴增產物；NC :陰性對照。
[0014] 圖2. 5' RACE和3' RACE的PCR電泳圖；A是5' RACE第一輪產物的凝膠電泳圖，其 中M :Marker ;1、2、3 :PCR擴增產物；NC :陰性對照；B是5' RACE第二輪產物的凝膠電泳圖， 其中M :Marker ;1、2、3 :PCR擴增產物；NC :陰性對照；C是3' RACE第一輪產物的凝膠電泳 圖，其中M :Marker ;1、2、3 :PCR擴增產物；NC :陰性對照；D是3' RACE第二輪產物的凝膠電 泳圖，其中M :Marker ;1、2、3 :PCR擴增產物；NC :陰性對照；E是克隆0RF的產物的凝 膠電泳圖，其中M :Marker ;1、2、3 :PCR擴增產物；NC :陰性對照。
[0015] 圖3 ;A是帶酶切位點的PCR擴增凝膠電泳分析圖，其中，M :Marker ;1、2、 3 :PCR擴增產物；NC :陰性對照；B是重組質粒pPICZaA-gcir/^的酶切鑒定凝膠電泳分析 圖，其中，M :Marker ;1 :pPICZaA-gcir/^EcoRI-HF 和 Notl 雙酶切；2 :pPICZaA-gcir/^ 未酶 切。
[0016] 圖4 ;A是重組株pPICZaA-狀ir/^-X33表達產物gCTRP9的SDS-PAGE電泳分析圖， 其中：Μ :蛋白Marker ; NC :陰性對照；1 :重組株pPICZaA-狀ir/^-X33表達產物；B和C是 重組株pPICZaA-狀ir/^-X33表達產物gCTRP9純化產物的SDS-PAGE電泳分析圖及Western blot鑒定圖譜；其中，Μ :蛋白Marker ;1、2、3、4 :SDS-PAGE ;5、6、7、8 Western blot ; NC :陰 性對照。
[0017] 圖5是重組斜帶石斑魚gCTRP9對斜帶石斑魚原代肝細胞葡萄糖產出的影響；其中 表示與對照組相比有顯著性差異，P < 0. 01。
【具體實施方式】
[0018] 下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明，但不以任何形式限制本發明。
[0019] 實施例1 ^基因中間片段的克隆 對已報道的紅鰭東方飩（青斑河豚（ieiraot/o/? 三刺魚(gasierosieiAs acWeates)，青鎌中所獲得的 序列進行 比對，找到相對保守區域，設計克隆斜帶石斑魚cir/79序列中間片段的一對簡并引物，上 游引物為 5' CCHGGRAAAATGGGVCCCCA 3'，下游引物為 5' AAGACRGTGATGTGRTAGGTRAAG 3' ;以 斜帶石斑魚肝臟RNA反轉錄后的cDNA為模板做PCR。PCR條件為：94 °C 3 min;94 °C 15 s，60 °C 15s，72 °C 40 s，35個循環；72 °C 5 min;4 Oc^PCR反應后的凝膠電泳圖見圖 1〇
[0020] 實施例 2 9 基因 5' RACE 和 3' RACE 根據已經獲得的中間片段序列分別設計5' RACE和3' RACE各兩條引物并利用通用引 物 AUAP 和 AAP。
[0021] 5' RACE上游引物為： AAP :5， GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG 3,、 下游引物分別為： R1 :5' TAGGGAGTTTACTTTGTGCTGTGAG 3' ； R2:5'ATATTGCCTTTGTGACCTGGAAC3' ； 3' RACE上游引物分別為： F1 :5' GAAGTTGGCCTTAGAGGTGACAGA 3' ； F2 :5' CTCACAGCACAAAGTAAACTCCCTA 3' ； 下游引物為 AUAP :5' GGCCACGCGTCGACTAGTAC 3'。
[0022] 以斜帶石斑魚腎臟RNA反轉錄后的cDNA為模板做PCILPCR條件為：94 °C 3 min ; 94 °C 15 s，65 °C 15s，72 °C 90 s，35個循環；72 °C 5 min;4 °C ⑴。PCR反應后的凝膠 電泳圖見圖2中的A、B、C、D。
[0023] 實施例3 9 0RF的克隆 根據實施例1和實施例2的結果，設計一對克隆0RF的引物，上游引物 F-0RF的核苷酸序列為5' TTTTGCATTGTTGATAGATAGG3'、下游引物R-0RF的核苷酸序列為 5' AGACAGGCTGATTTCTTATGAC3'，以斜帶石斑魚腎臟RNA反轉錄后的cDNA為模板做PCR。PCR 條件為：94 °C 3 min;94 °C 15 s，59 °C 15s，72 °C 80 s，35 個循環；72 °C 10 min;4 °C °〇。經過PCR后把得到的產物與PCR2. 1載體連接在一起為PCR2. PCR反應后 的凝膠電泳圖見圖2中的E。
[0024] 實施例4 :帶酶切位點的斜帶石斑魚基因合成 根據自己克隆到的斜帶石斑魚基因的序列及限制性內切酶EcoRI-HF和Notl 的識別序列以及保護堿基，設計合成一對特異性引物，上游引物F為5' CGGAATTCCATCATCA TCATCATCATCTTGTTATCTCTAAAAGCG3'是在狀基因的成熟肽序列前添加了 EcoRI-HF酶 切識別位點和 6Xhis 標簽，下游引物 R 為 5' ATAGITTAGCGGCCGCCTAAGCCCCAAAGATTA3' 是 在#基因成熟肽序列后添加了終止密碼子及Notl酶切識別位點。利用自己構建的 PCR2.1-cir/^ 為模板進行 PCR 反應，PCR 反應條件為：94 °C 2 min;94 °C 15 s，64 °C 30s，72 °C 40 s，35個循環；72 °C 10 min;4 擴增產物的電泳鑒定圖見圖3中 A〇
[0025] 實施例5 :含斜帶石斑魚基因的畢赤酵母表達載體pPICZaA- 的構 建 PCR產物用限制性內切酶EcoRI-HF和Notl雙酶切后，酶切產物用E. Z.N.A.? Gel Extraction Kit回收，進行瓊脂糖凝膠電泳，分離純化斜帶石斑魚狀斤/沿基因片段；載體 質粒pPICZaA經限制性內切酶EcoRI-HF和Notl雙酶切后分離純化，與分離純化斜帶石斑 魚狀基因片段混合，用Τ0Υ0Β0 Ligtion High連接酶16°C連接過夜后用標準氯化鈣轉 化法轉入大腸桿菌DH5a中，用低鹽LB平板篩選具Zeocin抗性的轉化子，以標準方法提取 質粒，用限制性內切酶EcoRI-HF和Notl雙酶切重組質粒，得到大和小兩個片段，大小分別 與斜帶石斑魚基因和表達載體pPICZaA大小相同，證明斜帶石斑魚基因已 克隆入畢赤酵母表達載體PPICZaA中，重組質粒命名為pPICZaA-狀酶切分析圖分別 見圖3中的B。
[0026] 實施例6 :能高效表達斜帶石斑魚gCTRP9的畢赤酵母重組株pPICZaA-狀ir/^-X33 的構建 按照 invitrogen 公司的 The EasyselectTM Pichia Expression Kit 說明書制備畢赤 酵母X33感受態細胞，重組質粒pPICZaA- gcir/W用Pmel線形化后凝膠回收，用標準方法 電擊轉化畢赤酵母X33感受態細胞，在含Zeocin 500ug/ml的YPDS平板上28°C進行培養。 約3d后長出單克隆，挑取單克隆經誘導培養與鑒定篩選出能高效表達斜帶石斑魚gCTRP9 的畢赤酵母重組株pPICZaA-gctTjC^-JGS。
[0027] 實施例7 :利用畢赤酵母基因工程菌pPICZaA-gcir/^-X33生產重組斜帶石斑魚 gCTRP9 挑取畢赤酵母工程菌pPICZaA-狀ir/^-X33單菌落接種在10ml BMGY液體培養基中， 28°C，200轉/分培養18-24小時，然后離心收集菌體并重懸菌體于lOOmlBMGY液體培養基 中，28°C，200轉/分培養18-24小時，然后離心收集菌體并重懸菌體于lOOmlBMMY液體培養 基中，并加入吐溫-80,使其終濃度為0. 4%，28°C，200轉/分培養，18-24小時后向培養液 中加入甲醇，使終濃度為〇. 5%，然后28°C，200轉/分培養，18-24小時后收集上清，經分離 純化得到重組斜帶石斑魚gCTRP9產品。取lml上清用D0C-TCA-丙酮沉淀法濃縮后，加2 X 電泳上樣緩沖液，煮沸5分鐘后按標準方法跑SDS-PAGE凝膠電泳，同時取陰性對照按同樣 方法處理后電泳。陰性對照為空載質粒PPICZaA轉化X33后長出的單克隆培養后的上清蛋 白。結果見圖4中的A。pPICZaA-gctTjC^-JGS表達上清用Novagen公司的His-bind Resin 進行純化處理，結果見圖4中的B。
[0028] 將重組斜帶石斑魚gCTRP9蛋白采用免疫印跡（Western blot)方法進行鑒定。一 抗為s鼠抗HIS單克隆抗體(購自Novagen公司），二抗為羊抗鼠 IgG-HRP (購自博士德生物 工程有限公司）。結果見圖4中的C。
[0029] 實施例8 :重組斜帶石斑魚gCTRP9的功能研究-對斜帶石斑魚原代肝細胞葡萄糖 產出的影響 分離斜帶石斑魚原代肝細胞后，用加入10%FBS的含有酚紅的L15培養基把細胞濃度調 成5 X 105細胞/mL，然后在24孔板中每孔加入lmL，放在25°C的生化培養箱中，培養4h后， 換成900 μ L的無 FBS和酚紅的L15培養基過夜，第二天向處理組中每孔加入100 μ L的濃 度為100 μ g/mL的分離純化后的重組斜帶石斑魚gCTRP9,對照組加入等體積的PBS，分別在 6和12h收取培養上清并用細胞裂解液(購自ThermoFisher Scientific公司）裂解細胞后 完全收取裂解細胞后的裂解液。用BCA (購自碧云天公司）法測量裂解液中的總蛋白濃度， 培養上清濃縮(凍干再溶水）后用葡萄糖測定試劑盒(南京建成生物工程研究所）測量葡萄 糖濃度。以每孔中的總蛋白濃度作為內參，比較對照組和處理組之間葡萄糖濃度的變化情 況。結果顯示，在6h時，處理組葡萄糖濃度比對照組有下降趨勢，但在12h后處理組葡萄糖 濃度明顯低于對照組。結果如圖5。
【權利要求】
1. 斜帶石斑魚基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
2. 斜帶石斑魚ctrp9蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
3. -種表達載體，其特征在于，含有權利要求1所述的斜帶石斑魚gcir/W基因。
4. 根據權利要求3所述的表達載體，其特征在于，所述載體為畢赤酵母表達載體 pPICZak-gc trp9〇
5. -種重組株，其特征在于，是由權利要求4所述的表達載體pPICZaA-gcir/W轉入畢 赤酵母X-33中所形成的畢赤酵母重組株pPICZaA-gci/779- X-33。
6. 利用權利要求5所述畢赤酵母重組株生產斜帶石斑魚gCTRP9蛋白的方法，其特征在 于，包括如下步驟：將該菌種接種在BMGY液體培養基中，28°C，200轉/分培養18~24小時， 然后離心收集菌體并重懸菌體于BMMY液體培養基中，并加入吐溫-80,使其終濃度為0. 4%， 28°C，200轉/分培養，18?24小時后向培養液中加入甲醇，使終濃度為0. 5%，然后28°C，200 轉/分培養，18~24小時后收集上清，經分離純化得到重組斜帶石斑魚gCTRP9蛋白。
7. 權利要求6所述方法制備得到的重組斜帶石斑魚gCTRP9蛋白。
8. 權利要求2所述的斜帶石斑魚ctrp9蛋白或權利要求7所述的石斑魚gCTRP9重組 蛋白在制備促生長劑或添加劑中的應用。
【文檔編號】C12R1/84GK104152461SQ201410380895
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月5日 優先權日:2014年8月5日
【發明者】李文笙, 楊國坤, 秦超彬 申請人:中山大學